黄道培-PKI全自动核酸提取技术在临床PCR的应用
如何在临床上应用PCR定量核酸检测技术
如何在临床上应用PCR定量核酸检测技术
吕屏;黄道培
【期刊名称】《中国医药导刊》
【年(卷),期】2003(005)001
【摘要】@@ 应用PCR技术检测患者体内的病毒核酸已逐渐成为一项十分重要而又可靠的手段来监测病毒在体内的实际复制状况.目前在爱滋和肝炎病毒的诊断和治疗中此项技术应用得较为广泛.
【总页数】3页(P14-16)
【作者】吕屏;黄道培
【作者单位】上海浩源生物科技有限公司,上海,200001;上海浩源生物科技有限公司,上海,200001
【正文语种】中文
【中图分类】R9
【相关文献】
1.荧光定量PCR技术及其在临床上的应用 [J], 邓少丽;罗阳;陈伟
2.实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较[J], 肖艳群;陈慧英;张锦锋;蒋玲丽;陆银华
3.常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒方法的研究和应用[J], 郭艳飞
4.实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较[J], 吴晓利
5.实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较[J], 吴晓利
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采用高敏检测技术检测血清HBV_DNA_载量筛选低病毒血症的无偿献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染研究
∗基金项目:湖北省卫健委科研基金资助项目(编号: WJ2017H039)作者单位:571799海南省儋州市人民医院消化内科(符鑫,彭鑫,黄婷婷,廖雪霞);湖北文理学院附属医院,襄阳市中心医院消化内科(刘悦,颜悦蓉)第一作者:符鑫,男,34岁,大学本科,主治医师㊂E-mail:fux-in23702378@通讯作者:颜悦蓉,E-mail:547742681@ ㊃病毒性肝炎㊃采用高敏检测技术检测血清HBV DNA载量筛选低病毒血症的无偿献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染研究∗符鑫,刘悦,彭鑫,黄婷婷,廖雪霞,颜悦蓉㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨采用高敏检测技术检测血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA筛选低病毒血症(LLV)的无偿献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)的价值㊂方法㊀2017年2月~2021年12月我市收集的11352份血清HBsAg阴性的无偿献血人群血液标本,采用电化学发光法定性检测血清HBeAg㊁HBeAb和HBcAb),定量检测血清HBsAb,使用AU5800型全自动生化分析仪检测血生化指标,使用ABI ViiA7型荧光定量PCR扩增仪,采用高敏PCR法检测血清HBV DNA载量,对所有经高敏PCR法检测为HBV DNA阳性的血清再使用Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan全自动核酸定量检测系统复核㊂结果㊀以全自动核酸定量检测系统检测结果为金标准,发现高敏PCR检测为HCV DNA阳性的67例(0.59%)为LLV人群,结果显示,该方法诊断OBI人群LLV的灵敏度和特异度均为100.0%和100.0%;金标准方法与高敏PCR检测血清HCV DNA载量差异无统计学意义ʌ(110.7ʃ20.2)IU/ml对(108.2ʃ19.6)IU/ml,P>0.05ɔ;经高敏PCR法检验发现, LLV人群血清HBV DNA载量为100~200IU/ml者41例(61.2%),20~100IU/ml者15例(22.4%),和<20IU/ml者11例(16.4%);5例血清HBsAb/HBeAb/HBcAb阳性人群血清HBV DNA载量为(162.4ʃ18.3)IU/ml,显著高于9例血清HBcAb阳性人群ʌ(82.3ʃ14.1)IU/ml,P<0.05ɔ或16例HBeAb/HBcAb阳性人群ʌ(136.9ʃ15.7)IU/ml,P<0.05ɔ或32例HBsAb/HBcAb阳性人群ʌ(99.3ʃ15.5)IU/ml,P<0.05ɔ或3例HBsAb阳性人群ʌ(71.5ʃ12.9)IU/ml,P<0.05ɔ或2例血清HBV标志物全阴性人ʌ分别为55.0IU/ml和56.1IU/mlɔ㊂结论㊀采用高敏PCR法检测血清HBV DNA载量能够在献血员人群中筛选LLV的OBI感染者,为临床用血安全又加了一道保险㊂㊀㊀ʌ关键词ɔ㊀隐匿性乙型肝炎;低病毒血症;精准检测HBV DNA;无偿献血员;筛查㊀㊀DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.02.005㊀㊀Screening of occult hepatitis B viral infection in unpaid blood donors with low-level viremia by serum HBV DNA precise detection technology㊀Fu Xin,Liu Yue,Peng Xin,et al.Department of Gastroenterology,People's Hospital,Danzhou571799, Hainan Province,China㊀㊀ʌAbstractɔ㊀Objective㊀The aim of this study was to explore the screening of occult hepatitis B viral infection(OBI)in unpaid blood donors with low-level viremia(LLV)by serum HBV DNA precise detection technology.Methods㊀11352unpaid blood samples with negative serum hepatitis B surface antigen(HBsAg)were collected between February2017and December 2021.Serum hepatitis B e antigen(HBeAg),anti-hepatitis B e antibody(HBeAb),anti-hepatitis B core antibody(HBcAb)and serum anti-hepatitis B surface antibody(HBsAb)were qualitatively or quantitatively detected by CL-2000i automatic chemiluminescence immunoassay.Serum biochemical parameters were detected by AU5800automatic biochemical analyzer.Serum HBV DNA loads were assayed by ABI ViiA7fluorescence quantitative PCR amplifier by means of high-sensitivity PCR assay.All individuals with positive seru HBV DNA by high-sensitivity PCR assay were checked-up by Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan automatic nucleic acid quantitative detection system.Results㊀The high-sensitivity PCR detection found67blood donors (0.59%)were serum HBV DNA positive with LLV from the11352blood samples,which were completely coincided with the goldmethod of automatic nucleic acid quantitative detection system,with the sensitivity and specificity of100.0%(67/67)and100.0%(67/67),respectively;there was no statisticalsignificance as respect to serum HBV DNA loads detected bygold standard method and high-sensitivity PCR[(110.7ʃ20.2)IU/ml vs.(108.2ʃ19.6)IU/ml,P>0.05];the high-sensitivity PCR detection found serum HBV DNA loads were100-200IU/ml in41cases(61.2%),20-100IU/ml in15cases(22.4%)and<20IU/ml in11cases(16.4%);serum HBVDNA loads in5blood samples with serum HBsAb/HBeAb/HBcAb positive were(162.4ʃ18.3)IU/ml,significantly higher than [(82.3ʃ14.1)IU/ml,P<0.05]in9blood samples with serum HBcAb positive or[(136.9ʃ15.7)IU/ml,P<0.05]in16blood samples with serum HBeAb/HBcAb positive or[(99.3ʃ15.5)IU/ml,P<0.05]in32blood samples with serum HBsAb/HBcAb positive or[(71.5ʃ12.9)IU/ml,P<0.05]in3blood samples with serum HBsAb positive or[55.0IU/ml和56.1IU/ml, respectively]in2blood samples with all serum HBV markers negative.Conclusion㊀The screening of serum HBV DNA by high-sensitivity PCR in unpaid blood donors could reveal OBI with LLV,which might be more safe in clinical blood use.㊀㊀ʌKey wordsɔ㊀Occult hepatitis B viral infection;HBV DNA precise detection technology;Unpaid blood donors;Low-level viremia;Screening㊀㊀输血是临床急救和治疗的重要手段㊂目前,我国血站严格按照卫健委发布的筛查乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen negative,HBsAg),但仍有受血者在输注HBsAg阴性血液后发生输血后慢性乙型肝炎(chronic Hepatitis B,CHB)的可能㊂相关研究发现,依靠单一检测HBsAg筛查诊断献血者HBV感染的灵敏度较低㊂虽然采用灵敏度更高的ELISA法可明显减少输血传播HBV的风险,但却无法完全避免HBV传播,检测血清HBV DNA可进一步保证用血的安全[1,2]㊂目前认为,窗口期感染和隐匿性乙型肝炎病毒感染(occult HBV infection,OBI)的存在是导致输血后CHB发生的重要原因,后者血清HBsAg阴性,但血清或肝组织HBV DNA仍持续存在㊂有研究指出,常规检测方法的灵敏度不高是导致OBI漏检的主要原因,给安全输血带来了极大的隐患[3]㊂HBV DNA是诊断和治疗HBV感染者的重要指标,代表病毒在体内的复制水平㊂血清HBV DNA的出现早于其他血清标志物,可反映传染性的大小㊂有学者在血清HBsAg阴性患者采用非高敏HBV DNA检测试剂检测HBV DNA,发现30%患者检测不到HBV DNA[4],而低病毒血症(low-level viremia,LLV)在OBI中所占比例较高㊂LLV的存在不仅可对肝功能造成影响,还可增加受血者感染的风险㊂本研究采用精准检测技术在无偿献血人群检测血清HBV DNA,以期发现伴LLV的OBI人群,以降低输血引起的HBV感染,现将结果报道如下㊂1㊀资料与方法1.1临床资料㊀2017年2月~2021年12月我市收集的无偿献血血液标本11352份,男6741例,4611例;年龄为18~60岁,平均年龄为(35.5ʃ6.1)岁;血清HBsAg阴性(HBsAb<10mIU/ml);首次献血7379例,多次献血3973例㊂血标本均符合‘献血者健康检查要求“中的相关要求㊂排除标准:(1)存在嗜肝病毒感染;(2)存在肝损伤的肝功能指标表现㊂本研究满足‘赫尔辛基宣言“有关伦理学的要求㊂OBI诊断标准[5]:血清HBsAg阴性,血清和(或)肝组织HBV DNA阳性,血清HBV DNA载量<200IU/ml㊂1.2血液标本处理㊀按照‘献血者健康检查要求“的标准进行采血㊁保存,采血后应用EDTA-K2抗凝负压真空管留取献血者静脉血2管(5ml/管),其中一管用于血清HBV DNA检测,于留样后4h内进行离心处理,保存于2~8ħ冰箱㊂另一管用于血清学检测㊂1.3血清HBV标志物检测㊀使用CL-2000i全自动化学发光免疫分析仪,采用电化学发光法定性检测血清HBeAg㊁HBeAb㊁HBcAb,定量检测血清HBsAb (深圳迈瑞公司提供)㊂1.4肝功能指标检测㊀使用美国贝克曼库尔特公司生产的AU5800型全自动生化分析仪检测血生化指标㊂1.5血清HBV DNA检测㊀血液标本经离心后取血清㊂采用高敏PCR法检测,使用Trizol试剂(Invitrogen公司,美国)提取DNA并检查其完整性㊂采用逆转录试剂盒合成cDNA,使用美国ThermoFisher公司提供的ABI ViiA7型荧光定量PCR扩增仪检测,核酸提取纯化试剂和高灵敏HBV DNA定量检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司,引物序列:上游引物:5 -CTCTCTTTACGCG-GTCTC-3 ,下游引物:5 -GTCGTTGACATTGCTGAG -3 ㊂反应条件为93ħ2min;93ħ45s㊁55ħ60s, 10个循环;93ħ30s㊁55ħ45s,30个循环㊂使用Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan全自动核酸定量检测系统检测血清HBV DNA载量(瑞士Roche公司,最低检测下限为20IU/ml)㊂1.6统计学处理㊀应用IBM SPSS Statistics24.0软件行统计学分析,对正态分布的计量资料以(xʃs)表示,两组间差异比较采用独立t检验,多组间差异比较采用单因素方差分析;计数资料的比较采用x2检验㊂P<0.05表示差异有统计学意义㊂2㊀结果2.1高敏PCR检测情况㊀以全自动核酸定量检测系统检测结果为金标准,发现高敏PCR检测为HCV DNA阳性的67例(0.59%)为LLV人群,结果显示,该方法诊断OBI人群LLV的灵敏度和特异度均为100.0%(67/67)和100.0%(67/67);金标准与高敏PCR检测血清HCV DNA载量差异无统计学意义[(110.7ʃ20.2)IU/ml对(108.2ʃ19.6)IU/ml,P> 0.05]㊂2.267例LLV人群血清HBV DNA载量分布情况㊀经高敏PCR法检验发现,LLV人群血清HBV DNA 载量为100~200IU/ml者41例(61.2%),20~100 IU/ml者15例(22.4%),和<20IU/ml者11例(16.4%)㊂2.3不同血清学模式阳性人群血清HBV DNA载量比较㊀血清HBsAb/HBeAb/HBcAb阳性人群血清HBV DNA载量显著高于其他血清标志物阳性模式人群(P<0.05,表1)㊂表1㊀不同血清学模式人群血清HBV DNA载量(IU/ml,xʃs)比较血清HBV标志物例数HBV DNA载量(IU/ml)全阴性255.0,56.1 HBsAb阳性371.5ʃ12.9①HBsAb/HBcAb阳性3299.3ʃ15.5①②HBeAb/HBcAb阳性16136.9ʃ15.7①②HBcAb阳性982.3ʃ14.1①HBsAb/HBeAb/HBcAb阳性5162.4ʃ18.3①②㊀㊀与全阴性组比,①P<0.05;与HBsAb阳性组比,②P< 0.053㊀讨论输血相关传染病的预防和控制已成为我国重点关注和解决的问题㊂HBV可经血液或血制品传播,导致受血者感染㊂目前,血液筛查主要采用ELISA 法检测,但由于窗口期和OBI的存在,有引起感染的风险[6]㊂相关研究也指出,OBI是我国不明原因肝病发生的主要原因之一,也是造成输血感染的重要因素[7],故临床上需重视低水平HBV DNA载量的CHB的检测,以免造成输血感染的发生㊂LLV指在抗病毒治疗过程中或处于OBI的人群,血清HBV载量持续维持在较低水平㊂既往报道指出,HBV感染患者在经核苷(酸)类似物治疗后出现LLV,不仅不能达到理想的治疗目标,短期内还会增加耐药风险,降低累积病毒学抑制率[8,9]㊂LLV的发生可增加耐药及病毒学突破的风险,长期LLV可促进肝纤维化进展,增加肝细胞癌发生概率[10]㊂有研究显示,部分患者在经核苷(酸)类似物治疗后,仍会出现LLV,故如检测HBV DNA方法的灵敏度较低会导致漏诊等现象的发生[11]㊂HBV DNA是能通过荧光PCR技术从分子生物学水平直接检测的HBV的遗传物质,可用于判断HBV感染状况,但目前常规诊断试剂的检测灵敏度偏低,有导致漏诊的可能,进而影响输血安全,故探究一种检测HBV DNA的精准技术以提高LLV检出率,对于保证输血安全至关重要㊂高敏PCR法通过设计针对病毒保守序列的特异性引物扩增病毒及其变异株核酸,并能放大检测信号,进而可提高HBV DNA低载量患者检出率[12]㊂本研究发现高敏PCR诊断OBI患者LLV的灵敏度和特异度均较高,与金标准高敏PCR检测结果对比,差异无统计学意义,表明本研究采用的高敏PCR法检测对LLV的诊断效能较高,可将其应用于HBsAg阴性的HBV DNA的检测㊂经高敏PCR法检验发现,LLV 患者HBV DNA载量为100~200IU/ml患者的比例较高,提示大部分LLV患者病毒载量仍较高,是可以通过提高检测方法的灵敏度而实现临床检测的㊂随着血清HBsAg的清除,HBV处于一种低水平复制状态,或处于一种可被重新激活形成传染性颗粒的活性复制状态,因而在HBsAg清除一段时间后仍可观察到病毒复制现象㊂相关研究指出,血清HBV标志物状态与HBV DNA载量有关[13,14]㊂本研究结果显示,4种血清HBV标志物均阴性患者血清HBV DNA载量低于至少一种标志物阳性患者㊂血清HBsAb㊁HBcAb和HBeAb阳性人群血清HBV DNA载量相对较高㊂相关研究指出,持续抑制HBV DNA可改善肝脏组织学病变,使肝纤维化消退或延缓肝硬化病情进展,进而可起到改善临床结局的作用[15,16]㊂故降低机体血清HBV DNA载量对于患者肝功能恢复至关重要㊂LLV人群肝功能指标往往正常或轻度升高,但持续的病毒复制仍可促进肝纤维化进展,进而影响患者肝功能[17,18]㊂在HBV感染早期,机体处于免疫耐受阶段,尽管存在着病毒复制现象,肝功能却未出现明显异常[19]㊂亦有研究表明, HBV并不是直接导致肝细胞病变的主要原因, HBsAg等抗原所引起的宿主免疫应答才是引发肝细胞损害的决定性因素㊂随着疾病的进展,病毒逃避宿主免疫反应或机体免疫压力等防御因素,可造成肝细胞损伤[20,21]㊂综上所述,采用高敏PCR法检测血清HBV DNA 能发现处于LLV的OBI人群,诊断效能较高,给临床输血安全又加了一道保险㊂由于输血可能传播经血传播的疾病,如HBV㊁HCV㊁HIV㊁梅毒和疟疾等感染,需要加强对献血员的安全检查㊂由于检测技术的进步和分子生物学的发展,可以设计高敏和精准的基因检测技术,能够帮助实现高效安全的目标,降低临床用血的风险㊂ʌ参考文献ɔ[1]刘海燕,陈华忠,邢同京,等.核苷(酸)类似物治疗乙型肝炎肝硬化代偿期患者HBsAg消失后可考虑停药.中华临床感染病杂志,2022,15(1):16-20.[2]Mak LY,Huang Q,Wong DK,et al.Residual HBV DNA andpgRNA viraemia is associated with hepatocellular carcinoma in chro-nic hepatitis B patients on antiviral therapy.J Gastroenterol,2021, 56(5):479-488.[3]Sun F,Liu Z,Wang B.Correlation between low-level viremia andhepatitis B-related hepatocellular carcinoma and recurrence:a ret-rospective study.BMC Cancer,2021,21(1):1103-1108. [4]路正昭,孙亚朦,尤红.慢性乙型肝炎低病毒血症致肝纤维化与肝细胞癌.中华肝脏病杂志,2021,29(12):1144-1146. [5]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2015年版).实用肝脏病杂志,2016,19(3): 389-400.[6]Kim JH,Sinn DH,Kang W,et al.Low-level viremia and the in-creased risk of hepatocellular carcinoma in patients receiving ente-cavir treatment.Hepatology,2017,66(2):335-343. [7]Jang JW,Choi JY,Kim YS,et al.Effects of virologic response totreatment on short-and long-term outcomes of patients with chronic hepatitis B virus infection and decompensated cirrhosis.Clin Gastro-enterol Hepatol,2018,16(12):1954-1963.[8]Zhou K,Wahed AS,Cooper S,et al.Phase transition is infrequentamong north American adults with e-antigen-negative chronic hepa-titis B and low-level viremia.Am J Gastroenterol,2019,114(11):1753-1763.[9]Liu P,You Y,Liao L,et al.Impact of low-level viremia with drugresistance on CD4cell counts among people living with HIVon an-tiretroviral treatment in China.BMC Infect Dis,2022,22(1): 426-435.[10]Gay CL,James KS,Tuyishime M,et al.Stable latent HIVinfection and low-level viremia despite treatment with the broadly neutralizing antibody VRC07-523LS and the latency reversal agent vorinostat.J Infect Dis,2022,225(5):856-861. [11]Chen GJ,Sun HY,Chang SY,et al.Incidence and impact of low-level viremia among people living with HIV who received protease inhibitor-or dolutegravir-based antiretroviral therapy.Int J Infect Dis,2021,105(4):147-151.[12]王明,张抒,李明,等.慢性乙型肝炎患者血清与粪便HBV DNA水平对比研究.实用肝脏病杂志,2019,22(2):176-179. [13]Zhang T,Ding H,An M,et al.Factors associated with high-risklow-level viremia leading to virologic failure:16-year retrospective study of a Chinese antiretroviral therapy cohort.BMC Infect Dis, 2020,20(1):147-151.[14]田贤江,赵立夫,沈跃飞,等.恩替卡韦治疗HBV DNA低水平HBeAg阳性慢性乙型肝炎可抑制病毒复制及改善肝组织学病变.中华临床感染病杂志,2019,12(2):107-110. [15]Li N,Xi X,Zhu J,et al.High sensitivity and rapid detection ofhepatitis B virus DNA using lateral flow biosensors based on Au@Pt nanorods in the absence of hydrogen peroxide.Analyst,2022,147(3):423-429.[16]Chang KC,Chang MH,Lee CN,et al.Decreased neonatalhepatitis B virus(HBV)viremia by maternal tenofovir treatment predicts reduced chronic HBV infection in children born to highly viremic mothers.Aliment Pharmacol Ther,2019,50(3): 306-316.[17]张缈曲,张琪然,张寒悦,等.一种新型乙型肝炎病毒RNA定量检测方法的临床检测性能评估.中华传染病杂志,2020,38(12):782-785.[18]Li Z,Zou S,Wu S,et al.Polymerase chain reaction-basedultra-sensitive detection of HBV DNA via G-quadruplex selective iridium (III)complex luminescent probe.Talanta,2021,221(1):e121661.[19]Luk KC,Gersch J,Harris BJ,et al.More DNA and RNA of HBVSP1splice variants are detected in genotypes B and C at low viral replication.Sci Rep,2021,11(1):23838-23850. [20]Qian X,Tan S,Li Z,et al.A robust host-guest interaction con-trolled probe immobilization strategy for the ultrasensitive detection of HBV DNA using hollow HP5–Au/CoS nanobox as biosensing platform.Biosens Bioelectron,2020,153(4):112051. [21]Liu D,Xu T,Shi B,et al.Clinical relevance of the in situ assayfor HBV DNA:a cross-sectional study in patients with chronic hep-atitis B.J Clin Pathol,2020,73(12):813-818.(收稿:2022-08-31)(本文编辑:陈从新)。
怎样理解PCR技术是获取目的基因的途径?
怎样理解PCR技术是获取目的基因的途径？
王鹏程;刘聪;姜万录
【期刊名称】《中学生物教学》
【年(卷),期】2012()6
【摘要】洪毅[四川省泸州市纳溪中学（646300）]在学习人教版选修3的“基因工程”专题时遇到下面一道题。
题目获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取方法的是（）
【总页数】2页(P70-71)
【关键词】基因工程;PCR技术;获取方法;人教版;泸州市;四川省
【作者】王鹏程;刘聪;姜万录
【作者单位】河南省新乡市第一中学;黑龙江省大庆铁人中学;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
1.三种获取目的基因的PCR方法 [J], 李鹏;刘文忠;栗艳
2.用PCR技术从cDNA文库中获取目的基因长片段 [J], 汪思应;郑红;程洁;余科科;许望翔;李俊
3.用RD-PCR技术获取IL-1β作用前后NIT-1细胞的差异表达基因 [J], 付青姐;马文丽;郑文岭;宋艳斌;吴曙光
4.以全RNA为底物进行逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）是获取外源基因的有效途径（简报） [J], 黄秉仁
5.基因预测与PCR技术相结合从cDNA文库中获取表达基因的研究 [J], 谢小燕;谭有将;李景全;陈芳;高剑峰
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脱氧核糖核酸分子的通用捕集法[发明专利]
![脱氧核糖核酸分子的通用捕集法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/06585dd1a32d7375a5178064.png)
专利名称：脱氧核糖核酸分子的通用捕集法专利类型：发明专利
发明人：黄道培
申请号：CN98102208.1
申请日：19980602
公开号：CN1202525A
公开日：
19981223
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种脱氧核糖核酸分子的通用捕集法,可应用于分子医学的疾病诊断。
本方法包括预杂交、杂交、洗板、酶联、洗板、显色、光密度测定等步骤,利用接头液分子的特异性部分与病原体核酸分子的杂交及通用部分与共价键地固定在通用捕集孔上的通用捕集寡核苷酸分子杂交而应用于临床检测。
该法与直接法相比较,具有杂交特异性强、杂交效率一致、灵敏度高、操作方便、能做定性定量及分型等多种检测、临检效率高、成本费用低等特点,适合日益增多的临检需要。
申请人：黄道培
地址：200233 上海市桂平路495号15号楼5B2上海浩源生物科技公司
国籍：CN
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转基因产品中常见外源基因的克隆与转化-食品科学网
97※基础研究食品科学转基因产品中常见外源基因的克隆与转化邵碧英，陈文炳，杨 婕，江树勋，李寿崧(福建出入境检验检疫局，福建 福州 350001)摘 要：设计带不同酶切位点的引物，分别用PCR 扩增植物内源rbcL 基因和2种转基因产品中常见的外源基因－CP4-EPSPS 基因和BAR 基因，并分别与pGEM-T Easy Vector 连接，克隆到大肠杆菌DH5α中。
提取克隆菌落的质粒，并进行酶切鉴定和序列测定。
对3个基因的克隆质粒进行相应的双酶切，回收酶切产物，先后转化到受体载体p C A M B W 中。
最后获得的重组质粒的酶切和P C R 鉴定结果表明3个基因已被成功转化到受体载体中。
关键词：转基因产品；外源基因；克隆；转化Cloning and Transforming of the Universal Exogenous Genes in Genitically Modified ProductsSHAO Bi-ying ，CHEN Wen-bing ，Yang Jie ，JIANG Shu-xun ，LI Shou-song(Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)Abstract ：The primers with different enzyme sites were designed, and the plant endogenous rbcL gene and two kinds of universal exogenous CP4-EPSPS gene and BAR gene in genetically modified products were expanded by PCR respectively. The PCR products were ligated with pGEM-T Easy Vector, then cloned into E.coli strain DH5α. The clone plasmids of the 3 genes were extracted, then analysed with restriction enzyme and sequenced respectively. The enzymed products of the 3 clone plasmids cut by two corresponding restriction enzyme were recovered, and transformed into the received carrier pCAMBW one after the other. The restriction enzyme analysising and PCR detection results of the recombinant plasmid obtained finally showed that the 3 genes were transformed successfully into the received carrier.Key words ：genetically modified product ；exogenous gene ；clone ；transform中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)11-0097-04收稿日期：2006-08-09基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技项目(2005IK006)作者简介：邵碧英(1973-)，女，高级工程师，博士，主要从事转基因产品和动物产品的分子检测与科研。
核酸抗体结合技术在生物实验中的应用
核酸抗体结合技术在生物实验中的应用随着科学技术的不断发展，生物实验日益复杂。
在生物实验中，核酸抗体结合技术是一种非常重要的技术，广泛应用于基因工程、抗体制备、肿瘤治疗等领域。
本文将介绍核酸抗体结合技术的基本原理和在生物实验中的应用。
一、核酸抗体结合技术基本原理核酸抗体结合技术是利用单链DNA、RNA、短肽等寡核苷酸序列特异性识别和定位靶标分子，并实现相应信号的传导。
它主要包括两个方面：一是核酸探针的设计与制备，二是核酸抗体结合和检测。
核酸探针的设计与制备是核酸抗体结合技术的关键步骤。
核酸探针的特异性来自于其序列的选择和修饰。
在设计核酸探针时，需要考虑其适合目标靶标分子的结构和特性，如分子量、碱基序列、交联位置等。
同时，在核酸探针的制备中常常需要进行修饰。
对于DNA探针来说，通常采用脱氧核糖核酸（DNA）或锁核酸（LNA）等修饰，而RNA探针则常采用2'-O-甲基标记等修饰。
核酸抗体结合和检测是核酸抗体结合技术的核心步骤。
在这个过程中，通常采用荧光标记或放射标记等手段对探针-靶标分子结合进行检测。
核酸抗体结合的检测方法有很多种，如荧光共振能量转移（FRET）、比色法、化学发光法等。
其中，荧光共振能量转移法是一种常用的方法，其原理是通过调控不同荧光物质的距离和荧光发射频谱来实现探针-靶标分子的检测。
二、核酸抗体结合技术在生物实验中具有广泛的应用前景。
以下是一些典型的应用案例：1.基因工程技术：核酸抗体结合技术在基因工程领域中扮演着重要的角色。
基因工程技术包括基因克隆、遗传转化、基因诊断、基因治疗等领域。
在这些领域中，核酸抗体结合技术常常用于检测目标基因的特异性表达及其在细胞中的位置。
2.抗体制备：核酸抗体结合技术在抗体制备领域中也有广泛的应用。
抗体是生物实验中常用的检测工具。
通过核酸抗体结合技术可以制备出特定靶标分子的抗体，例如简化的涂层ELISA和岛屿放射免疫测定等。
3.肿瘤治疗：核酸抗体结合技术在肿瘤治疗领域中也有广泛的应用。
IVDMBT基本原理与流程
IVDMBT基本原理与流程
首先是样品采集。
样品可以是血液、尿液、唾液、组织等生物样本。
采集时要注意无菌操作，避免交叉感染。
接着是核酸提取，目的是将样品中的核酸提取出来。
根据样品的不同，提取方法也不同，常用的包括酚氯仿法、阳离子膜法、玻璃纤维法等。
提
取的核酸可以是DNA或RNA。
然后是核酸扩增，在扩增过程中，通过特定的引物选择性地放大感兴
趣的目标序列。
目前常用的核酸扩增技术有聚合酶链式反应(PCR)、实时
荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)、循环扩增酶链反应(LAMP)等。
扩增过程
中需要将样品与引物、酶、缓冲液等混合后放入热循环仪或扩增仪中进行
反应。
接下来是基因检测。
在此步骤中，将扩增产物与特定探针结合进行检
测和分析。
常用的检测方法有凝胶电泳、酶联免疫吸附试验(ELISA)、西
方印迹、基因芯片等。
通过检测特定的基因突变、SNP、以及蛋白质表达
等信息，可以判断是否存在病理变化。
最后是数据分析。
将基因检测结果进行记录、分析和解释。
根据不同
的目的，可以运用不同的分析方法，如比对参考基因组、构建基因表达谱、寻找潜在致病基因等。
而对于临床应用，还需要将检测结果与临床资料结合，进行相关性分析和解读。
总之，IVDMBT通过分析样品中的分子生物学特征，可以实现快速、
准确的疾病诊断和治疗监测。
其基本原理是通过核酸提取、扩增和检测等
步骤，最终得到与疾病相关的基因信息，并进行数据分析和解读。
这一技
术在临床医学中具有重要的应用前景和发展潜力。
一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌NWMCC0137_全基因组测序及分析
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(７):１４６０￣１４７１ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ刘高强ꎬ李新鹏ꎬ刘文钊ꎬ等.一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(７):１４６０￣１４７１.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０７.００３一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析刘高强１ꎬ２ꎬ㊀李新鹏１ꎬ３ꎬ㊀刘文钊１ꎬ２ꎬ㊀周㊀魏１ꎬ２ꎬ㊀彭乔烽１ꎬ２ꎬ㊀周雪雁１ꎬ２ꎬ㊀默罕默德 索布瑞 塔克瑞夫４ꎬ㊀丁功涛１(１.西北民族大学生物医学研究中心中国￣马来西亚国家联合实验室ꎬ甘肃兰州７３００３０ꎻ２.西北民族大学生命科学与工程学院ꎬ甘肃兰州７３００３０ꎻ３.西北民族大学化工学院ꎬ甘肃兰州７３００３０ꎻ４.马来西亚国立大学工程与建筑环境学院化工系ꎬ雪兰莪州万宜４３６００)收稿日期:２０２２￣１２￣０１基金项目: 科技助力经济２０２０ 重点专项(ＳＱ２０２０ＹＦＦ０４０５５８３)ꎻ西北民族大学中央高校基本科研业务经费项目(３１９２０２２００２３)ꎻ西北民族大学中央高校基本科研业务费资助项目(３１９２０１８０１２２)作者简介:刘高强(１９９６－)ꎬ男ꎬ河南周口人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为环境生物技术ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)７６０５１１６３８＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:丁功涛ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｄｉｎｇｇｏｎｇｔａｏ＠ｏｕｔｌｏｏｋ.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀ＮＷＭＣＣ０１３７是从屠宰场下水道污泥中分离获得的１株高效分解血液蛋白并具有良好生物防控特性的枯草芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ)ꎮ为探究枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７(Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７)高效水解血液蛋白机制及挖掘次级代谢产物编码基因资源ꎬ利用ＤＮＢＳＥＱ与ＰａｃＢｉｏ测序平台对其进行全基因组测序并进行序列组装和基因预测㊁功能注释㊁比较基因组分析ꎮ结果表明Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７的基因组长度为４２１５５８５ｂｐꎬＧ＋Ｃ含量为４４ ２３％ꎻ编码基因总长度为３７１１８８５ｂｐꎬ编码４３８４个基因ꎬ编码序列占整个基因组长度的８８ ０５％ꎬ非编码ＲＮＡ中包含８５个ｔＲＮＡ基因ꎮ在ＫＥＧＧ数据库中Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组被注释到７种胞外蛋白酶编码基因ꎬ其中与丝氨酸蛋白酶相关的编码基因有８个ꎮ通过ａｎｔｉＳＭＡＳＨ预测发现ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７基因组中包含７种与已知次生代谢产物合成基因簇相似度为１００％的基因簇ꎬ包括产孢致死因子㊁聚酮类化合物㊁丰原素㊁枯草芽孢杆菌素１６８㊁儿茶酚型嗜铁素㊁芽孢杆菌素㊁杆菌溶素合成基因簇ꎮ进化分析结果表明ꎬＮＷＭＣＣ０１３７为枯草芽孢杆菌ꎬ并且与枯草芽孢杆菌１６８具有很高的共线性ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组序列已提交至ＧｅｎＢａｎｋ数据库ꎬ登录号为ＣＰ１０３０６６ꎮ本研究从基因层面揭示了菌株ＮＷＭＣＣ０１３７的遗传信息ꎬ为该菌株应用于屠宰场血液蛋白降解及生物防控提供了参考ꎮ关键词:㊀枯草芽孢杆菌ꎻ全基因组ꎻ基因功能注释ꎻ蛋白酶中图分类号:㊀Ｑ９３４.１２４㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０７￣１４６０￣１２ＷｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ꎬａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｇｒａｄｉｎｇｓｔｒａｉｎＬＩＵＧａｏ￣ｑｉａｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＬＩＸｉｎ￣ｐｅｎｇ１ꎬ３ꎬ㊀ＬＩＵＷｅｎ￣ｚｈａｏ１ꎬ２ꎬ㊀ＺＨＯＵＷｅｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＰＥＮＧＱｉａｏ￣ｆｅｎｇ１ꎬ２ꎬ㊀ＺＨＯＵＸｕｅ￣ｙａｎ１ꎬ２ꎬ㊀ＭＯＨＡＭＭＥＤＳｏｂｒｉ￣ｔａｋｒｉｆｆ４ꎬ㊀ＤＩＮＧＧｏｎｇ￣ｔａｏ１(１.Ｃｈｉｎａ￣ＭａｌａｙｓｉａＮａｔｉｏｎａｌＪｏｉｎｔＬａｂｏｒａｔｏｒｙꎬＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒꎬＮｏｒｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬａｎｚｈｏｕ７３００３０ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＮｏｒｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬａｎｚｈｏｕ７３００３０ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＮｏｒｔｈｗｅｓｔＭｉｎｚｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＬａｎｚｈｏｕ７３００３０ꎬＣｈｉｎａꎻ４.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＰｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉ￣ｎｅｅｒｉｎｇꎬＦａｃｕｌｔｙｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＢｕｉｌｔＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＫｅｂａｎｇ￣ｓａａｎＭａｌａｙｓｉａꎬＢａｎｇｉ４３６００ꎬＭａｌａｙｓｉａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＮＷＭＣＣ０１３７ｉｓａＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒａｉｎｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｅｗａｇｅｓｌｕｄｇｅｉｎｓｌａｕｇｈｔｅｒｈｏｕｓｅｓꎬｗｈｉｃｈｅｆｆｉ￣ｃｉｅｎｔｌｙｄｅｃｏｍｐｏｓｅｓｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｈａｓｇｏｏｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ０６４１ｃｏｎｔｒｏｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ.ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｏｆｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭ￣ＣＣ０１３７ａｎｄｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｇｅｎｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓꎬＤＮＢＳＥＱａｎｄＰａｃＢｉｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｐｌａｔｆｏｒｍｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅꎬａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｓｓｅｍｂｌｙꎬｇｅｎｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎꎬｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｎｏｔａｔｉｏｎａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｇｅ￣ｎｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｅｌｅｎｇｔｈｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ｗａｓ４２１５５８５ｂｐꎬａｎｄｔｈｅＧ＋Ｃｃｏｎｔｅｎｔｗａｓ４４ ２３％.Ｔｈｅｔｏｔａｌｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｗａｓ３７１１８８５ｂｐꎬｅｎｃｏｄｉｎｇ４３８４ｇｅｎｅｓꎬａｃ￣ｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒ８８.０５％ｏｆｔｈｅｅｎｔｉｒｅｇｅｎｏｍｅｌｅｎｇｔｈ.Ｔｈｅｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｃｏｎｔａｉｎｅｄ８５ｔＲＮＡｇｅｎｅｓ.ＩｎＫＥＧＧｄａｔａｂａｓｅꎬＢａ￣ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ｇｅｎｏｍｅｗａｓａｎｎｏｔａｔｅｄｔｏｓｅｖｅｎｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅａｓｅｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｅｉｇｈｔｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ.ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉＳＭＡＳＨꎬｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆｓｔｒａｉｎＮＷＭＣＣ０１３７ｃｏｎｔａｉｎｅｄｓｅｖｅｎｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｗｉｔｈ１００％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｔｏｔｈｅｋｎｏｗｎｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｋｉｌｌｉｎｇｆａｃｔｏｒꎬｂａｃｉｌｌａｅｎｅꎬｆｅｎｇｙｃｉｎꎬｓｕｂｌａｎｃｉｎ１６８ꎬｂａｃｉｌｌｉｂａｃｔｉｎꎬｓｕｂｔｉｌｏｓｉｎＡａｎｄｂａｃｉｌｙｓｉｎｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓ.Ｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙａｎａｌｙ￣ｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＮＷＭＣＣ０１３７ｗａｓａＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｎｄｈａｄｈｉｇｈｃｏｌｌｉｎｅａｒｉｔｙｗｉｔｈＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８.Ｔｈｅｇｅ￣ｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ｈａｄｂｅｅｎｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏｔｈｅＧｅｎＢａｎｋｄａｔａｂａｓｅｗｉｔｈａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＣＰ１０３０６６.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｒｅｖｅａｌｅｄｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎＮＷＭＣＣ０１３７ａｔｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｌｅｖｅｌꎬｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎｄｅｇｒａｄｉｎｇｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓꎻｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅꎻｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｎｏｔａｔｉｏｎꎻｐｒｏｔｅａｓｅ㊀㊀血液中蛋白质含量为２０％ꎬ动物屠宰后血液中的蛋白质资源[１]只有少部分能被利用ꎬ大多数血液未能被妥善处理ꎮ这不仅造成资源浪费ꎬ还会引起水土污染甚至是动物疾病[２]ꎮ提高动物屠宰血液利用率和废弃血液的资源化利用ꎬ是目前亟待解决的问题ꎮ目前国内外废弃血液利用方式主要有饲料化㊁能源化㊁食品化㊁药品化㊁肥料化等[３]ꎮ在饲料化和肥料化利用中ꎬ酶解和微生物发酵是重要的处理方式ꎮ酶解法对环境影响小ꎬ可以有效抑制毒物的生成[４]ꎻ与酶解法相比ꎬ微生物发酵的处理方式具有成本低㊁产酶种类丰富㊁操作简单等优势[５￣６]ꎮ目前微生物发酵所用的菌种有芽孢杆菌㊁酵母菌㊁乳酸菌[７]等ꎮ庞伟[８]利用枯草芽孢杆菌对血粉发酵ꎬ检测结果显示ꎬ发酵后蛋白质最大水解度为３２ ３０％ꎬ发酵产物中氨基酸含量是原来的４ ４４倍ꎬ可溶性蛋白质含量提高了５３ ７７％ꎮ陶艳华等[９]和Ｙａｏ等[１０]均采用短小芽孢杆菌发酵ꎬ发酵后血红蛋白降解率分别达到５３ ６４％和８５ ００％ꎮ崔玮琪等[１１]筛选得到菌株Ｘ￣１７ꎬ以猪血作为唯一氮源发酵ꎬ经优化后血液蛋白水解度达到１８ ５２％ꎬ可溶性蛋白质含量达到２ ７５ｍｇ/ｍｌꎮ有研究结果表明ꎬ菌株对蛋白质的降解率受血液占比影响较大ꎬ血液在发酵底物中的占比低于１０％时ꎬ菌株对血液蛋白降解率较高[１２]ꎬ血液在发酵底物中的占比高于１０％时ꎬ降解率明显降低ꎮＺｈａｎｇ等[１３]使用重组酵母菌发酵血液ꎬ血液在发酵底物中的占比为３ ２％时ꎬ蛋白质降解率为４９ ０％ꎮ而马子豪等[１４]发现ꎬ血液在发酵底物中的占比为３０％时ꎬ蛋白质降解率只有９ ８６％ꎮ本试验前期使用枯草芽孢杆菌ＮＷＭ￣ＣＣ０１３７ꎬ在动物屠宰血液占发酵底物９０ ０％情况下ꎬ血液中蛋白质水解率仍有１７ ６％ꎬ多肽含量为１５ １６ｍｇ/ｍｌꎬ具有较高的水解效率ꎬ表明菌株ＮＷＭＣＣ０１３７在动物屠宰血液再利用方面有着较好的潜力ꎮ枯草芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ)是一种重要的工业微生物[１５]ꎮ研究结果表明ꎬ枯草芽孢杆菌能产生至少８种胞外或细胞壁相关蛋白酶[１６]㊁纤维素酶㊁木聚糖酶[１７]以及聚酮类化合物㊁细菌素等多种抗菌物质[１８]ꎬ还具有促进养殖动物生长㊁降解环境废弃物㊁净化水质等作用[１９]ꎮ为探究菌株ＮＷＭ￣ＣＣ０１３７对血液中蛋白质降解的作用机制ꎬ通过ＤＮ￣ＢＳＥＱ平台与第三代测序技术ＰａｃＢｉｏ测序平台对其进行全基因组测序ꎬ在获得基因序列的基础上ꎬ利用ＧＯ㊁ＣＯＧ㊁ＫＥＧＧ㊁ＣＡＺｙ等数据库进行基因功能注释ꎮ并通过比较基因组学更好地了解菌株ＮＷＭ￣ＣＣ０１３７分类地位及其与其他枯草芽孢杆菌的差异性ꎬ揭示其高效降解屠宰动物血液蛋白的作用机制ꎬ为后期的生产应用提供理论依据ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料１.１.１㊀菌株㊀本试验使用的菌株为Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭ￣ＣＣ０１３７ꎬ由课题组前期分离所得ꎮ保存于西北民族大学生物医学研究中心中国￣马来西亚国家联合实１６４１刘高强等:一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析验室ꎮ１.１.２㊀相关试剂㊀ＬＢ培养基:琼脂粉１８ ０ｇ/Ｌꎬ胰蛋白胨１０ ０ｇ/Ｌꎬ酵母粉５ ０ｇ/ＬꎬＮａＣｌ１０ ０ｇ/ＬꎬｐＨ值７ ４(所用培养基中试剂均为分析纯)ꎻ细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒(ＴａＫａＲａＭｉｎｉＢＥＳＴＵｎｉｖｅｒｓａｌＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ ５ ０ꎬＴａＫａＲａ公司产品)ꎮ１.２㊀方法１.２.１㊀菌株基因组的提取及测序㊀将菌株在ＬＢ固体培养基复苏培养２４ｈꎬ取单菌落接入ＬＢ液体培养基ꎬ于３０ħꎬ１５０ｒ/ｍｉｎ条件下培养至对数生长期ꎬ使用细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒提取全基因组ＤＮＡꎮ提取的ＤＮＡ经检测符合条件后送至深圳华大基因股份有限公司通过第二代ＤＮＢＳＥＱ平台与第三代ＰａｃＢｉｏ平台进行基因组测序ꎮ１.２.２㊀基因组组分与功能分析㊀使用ＳＭＲＴＬｉｎｋＶ５.０.１软件(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｐａｃｂ.ｃｏｍ/ｓｕｐｐｏｒｔ/ｓｏｆｔｗａｒｅ￣ｄｏｗｎｌｏａｄｓ/)进行数据组装ꎮ使用Ｇｌｉｍｍｅｒ(Ｖ３.０２)软件(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｃｂ.ｕｍｄ.ｅｄｕ/ｓｏｆｔｗａｒｅ/ｇｌｉｍｍｅｒ/)[２０]预测编码基因ꎮ利用ＲＮＡｍｍｅｒ(Ｖ１.２)软件(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＲＮＡｍｍｅｒ/)预测ｒＲＮＡ[２１]ꎬ利用ｔＲＮＡｓｃａｎ￣ＳＥ(Ｖ１.３.１)软件预测ｔＲＮＡ[２２]ꎬ并与Ｒｆａｍ(Ｖ９.１)数据库(ｈｔｔｐ://ｒｆａｍ.ｓａｎｇｅｒ.ａｃ.ｕｋ/)比对得到ｓＲＮＡ[２３]ꎻ使用ＣＲＩＳＰＲＣａｓＦｉｎｄｅｒ软件(Ｖ４.２.１９)识别ＣＲＩＳＰＲｓꎬ得到ＤＲｓ和Ｓｐａｃｅｒｓꎻ使用ＴａｎｄｅｍＲｅｐｅａｔＦｉｎｄｅｒ(Ｖ４.０４)软件[２４]预测串联重复序列ꎬ根据重复单元长度及数目筛选出其中的微卫星以及小卫星序列ꎬ软件的参数设置为:２７７８０１０５０２０００￣ｄ￣ｈꎮＴａｎｄｅｍＲｅｐｅａｔＦｉｎｄｅｒ查找算法是一个两阶段查找算法ꎬ由检测阶段和分析阶段两部分组成ꎬ算法首先会基于重复片段的概率模型的统计信息对序列进行检测并得到可能满足条件的候选重复片段ꎬ之后通过对候选结果的分析和筛选得到最终的查找结果ꎮ并且ＴａｎｄｅｍＲｅｐｅａｔＦｉｎｄｅｒ查找算法不需要预先知道任何如模式组成㊁模式长度㊁模式重复次数等关于模式的已知信息ꎬ运行速度快㊁耗时少㊁重复序列准确ꎬ能够满足数据分析的要求ꎮ基因功能注释使用Ｄｉａｍｏｎｄ软件与ＧｅｎｅＯｎｔｏｌ￣ｏｇｙ(ＧＯ)㊁ＣｌｕｓｔｅｒｏｆＯｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓＧｒｏｕｐｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ(ＣＯＧ)㊁ＫｙｏｔｏＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＧｅｎｅｓａｎｄＧｅｎｏｍｅｓ(ＫＥＧＧ)㊁Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ￣ＡｃｔｉｖｅＥｎｚｙｍｅｓＤａｔａｂａｓｅ(ＣＡＺｙ)等数据库对比得到对应的功能注释信息ꎮ１.２.３㊀比较基因组分析㊀利用ＯｒｔｈｏＦｉｎｄｅｒ(ｖ２.２.６ꎬＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ２０１９ꎬｈｔｔｐｓ://ｇｉｔｈｕｂ.ｃｏｍ/ｄａｖ￣ｉｄｅｍｍｓ/ＯｒｔｈｏＦｉｎｄｅｒ)和参考基因组(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)找出多个同源基因ꎬ通过ＯｒｔｈｏＦｉｎｄｅｒ软件默认参数构建系统发育树ꎬ其中进化树可视化采用的是Ｍｅｇａ最大简约法模型ꎬ参数为默认ꎮ使用ＭＵＭｍｅｒ软件(Ｖ３.２２)进行共线性分析ꎮ通过ａｎｔｉＳＭＡＳＨｖｅｒｓｉｏｎ(Ｖ６.１.１ꎬｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏ￣ｌｉｔｅｓ.ｏｒｇ)对菌株ＮＷＭＣＣ０１３７进行次级代谢产物预测ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７全基因组概况Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组长度为４２１５５８５ｂｐꎬＧ＋Ｃ含量为４４ ２３％ꎬ无质粒ꎮ基因组共有４３８４个编码基因ꎬ编码基因总长度为３７１１８８５ｂｐꎬ平均长度８４６ ６９ｂｐꎬ占基因组的８８ ０５％ꎮ串联重复序列(ＴａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔꎬＴＲ)５５个ꎬ重复序列单元大小为１２~２５３ｂｐꎬ总长度４１４１ｂｐꎬ占基因组的０ ０９８２％ꎮ小卫星ＤＮＡ(ＭｉｎｉｓａｔｅｌｌｉｔｅＤＮＡ)４２个ꎬ单元大小为１５~６０ｂｐꎬ总长度２４５８ｂｐꎬ占基因组的０ ０５８３％ꎮ将ＮＷＭＣＣ０１３７基因组完整测序数据提交至Ｇｅｎ￣Ｂａｎｋ数据库ꎬ登录号为ＣＰ１０３０６６ꎮ将Ｂ ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７与另外２株枯草芽孢杆菌进行差异性比较分析结果(表１)表明ꎬＮＷＭＣＣ０１３７与Ｂ ｓｕｂｔｉ￣ｌｉｓ１６８的基因组长度和Ｇ＋Ｃ含量占比都很接近ꎬ但ＮＷＭＣＣ０１３７的编码基因数却比Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８多１４２个ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮ２￣１０[２５](ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＣＰ０９８４１７)的基因组长度小于ＮＷＭＣＣ０１３７ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７的Ｇ＋Ｃ含量占比也大于Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮ２￣１０ꎮ表１㊀不同菌株基因组概况Ｔａｂｌｅ１㊀Ｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆｇｅｎｏｍｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓ菌株㊀㊀㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮ２￣１０长度(ｂｐ)４２１５５８５４２１５６０６４０３６８９９Ｇ＋Ｃ含量(％)４４.２３４３.５０４３.８８编码基因数量４３８４４２４２４１５３平均长度(ｂｐ)８４６.６９８９５.００８６３.００ｔＲＮＡ数量８５８７８５２.２㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组组分分析非编码ＲＮＡ(ｎｃＲＮＡ)是一类可直接在ＲＮＡ水２６４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第７期平对生命活动发挥作用的ＲＮＡ分子ꎮＮＷＭＣＣ０１３７基因组含ｔＲＮＡ㊁ｒＲＮＡ㊁ｓＲＮＡ３种非编码ＲＮＡꎬ其中ｔＲＮＡ８５个ꎬ５ｓｒＲＮＡ㊁１６ｓｒＲＮＡ及２３ｓｒＲＮＡ均为１０个ꎬｓＲＮＡ３４个ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７的基因组圈图如图１所示ꎮ由于ＤＮＡ单链中Ｇ与Ｃ含量不一定相同ꎬ单链中Ｇ与Ｃ含量的偏移称为ＧＣ￣Ｓｋｅｗꎬ因此第８圈的ＧＣ￣Ｓｋｅｗ值是用来衡量在ＤＮＡ单链中碱基Ｇ和Ｃ相对含量的不同ꎮＧＣ￣Ｓｋｅｗ＋表示Ｇ含量大于ＣꎬＧＣ￣Ｓｋｅｗ￣表示Ｇ含量小于ＣꎮＤＮＡ复制中的前导链(Ｌｅａｄｉｎｇｓｔｒａｎｄ)富含Ｇ和Ｔꎬ而滞后链(Ｌａｇｇｉｎｇｓｔｒａｎｄ)中的Ａ和Ｃ偏多ꎬ表现出碱基组成上的不对称性ꎮ因此从复制起点延伸的前导链中是ＧＣ￣Ｓｋｅｗ＋ꎬ而在滞后链中为ＧＣ￣Ｓｋｅｗ￣ꎮ由外向内ꎬ第１圈表示基因组大小ꎻ第２和第３圈为正向反向链基因ꎻ第４第５圈为正向链ｎｃＲＮＡ与反向链ｎｃＲＮＡꎻ第６圈为重复序列ꎻ第７圈为Ｇ＋Ｃ含量ꎻ第８圈为ＧＣ￣Ｓｋｅｗ值ꎮ图１㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组特征Ｆｉｇ.１㊀ＧｅｎｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７２.３㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因功能分析将全基因组数据与ＧＯ㊁ＫＥＧＧ和ＣＯＧ等数据库进行比对注释ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组中被注释到ＧＯ数据库的基因数目为２５５５个(５８ ２８％)ꎬ被注释到ＣＯＧ的基因数目为３２０７个(７３ １５％)ꎬＫＥＥＧ数据库中被注释到有具体Ｐａｔｈｗａｙ的基因数目为２６０９个(５９ ５１％)ꎬＮＲ数据库中被注释到的基因数目为４３８１个(９９ ９３％)ꎬＣＡＺｙ数据库中被注释到的基因数目为１５２个(３ ４６％)ꎬＶＦＤＢ数据库中被注释到的基因数目为２０６个(４ ６９％)ꎮ３６４１刘高强等:一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析２.３.１㊀ＧＯ数据库注释㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因功能ＧＯ数据库注释结果如图２所示ꎬ基因被注释到与生物过程相关的类别最多ꎬ有１９种ꎬ前３种分别是细胞过程(１４０７个基因)㊁代谢过程(１３４７个基因)和定位(３８７个基因)ꎮ基因被注释到与分子功能相关的类别有１２种ꎬ基因数量最多的前两类是催化活性和结合ꎮ细胞组分中与细胞组织相关的功能注释基因最多ꎬ为７１６个ꎮＧＯ数据库中还注释到抗逆性相关的基因ꎬ如孢子形成(ＧＯ:００４３９３４)㊁萌发(ＧＯ:００３０４３５)ꎻ此外ꎬ菌株还含有嗜铁素生物合成基因(ＧＯ:００１９２９０)ꎮＧＯ数据库注释结果表明ꎬ该菌株不仅在代谢过程中结合㊁转运和催化等方面具有较强能力ꎬ还具有抗逆㊁抗真菌等特性ꎮ图２㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因功能ＧＯ数据库注释Ｆｉｇ.２㊀ＧＯｄａｔａｂａｓｅａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ４６４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第７期２.３.２㊀ＣＯＧ数据库注释㊀根据Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭ￣ＣＣ０１３７基因功能的ＣＯＧ数据库注释结果(图３)ꎬ其中参与氨基酸转运与代谢的基因有３２９个ꎻ关于碳水化合物的运输和代谢的基因ꎬ有３２７个ꎻ与转录相关的有３３０个基因ꎮ同时还发现有２３２个基因与细胞壁㊁细胞膜的生物反应有关ꎬ说明菌株具有较强的生成细胞膜的能力ꎮ还有１０２个基因与防御机制有关ꎬ这些基因保障了菌株在复杂环境中的生存能力ꎬ使菌株能够在下水道污泥中存活ꎮ在ＣＯＧ数据库注释结果中ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７的基因功能主要被注释到氨基酸㊁碳水化合物㊁无机离子的转运与代谢３个途径ꎮ图３㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组功能ＣＯＧ数据库注释Ｆｉｇ.３㊀ＣＯＧｄａｔａｂａｓｅａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ２.３.３㊀ＫＥＧＧ数据库注释㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组与ＫＥＧＧ数据库比对ꎬ共有２６０９个基因分别在６大功能４２个通路上得到功能注释(图４)ꎮ在新陈代谢方面被功能注释的基因最多ꎬ有１７１０个基因ꎮ１２个代谢通路中ꎬ与碳水化合物代谢相关的基因有２８５个ꎬ与氨基酸代谢相关的基因有２２７个ꎮ还有３３１个基因在环境信息处理上得到功能注释ꎬ其中与膜运输相关的基因有１８７个ꎬ与信号传导相关的基因有１４３个ꎮ在ＫＥＧＧ数据库中ꎬ被注释到的数量最多的是与碳水化合物代谢相关的基因ꎬ其次是与氨基酸代谢相关的基因ꎬ还注释到４４个与萜类和聚酮类化合物代谢相关的基因ꎮ这些基因控制５６４１刘高强等:一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析着表面活性素生物合成以及丰原素合成ꎮ其中与表面活性素(Ｓｕｒｆａｃｔｉｎｆａｍｉｌｙ)相关的基因有３个ꎬ分别为ｓｒｆＡＡ(ＧＬ０００３６４)㊁ｓｒｆＡＢ(ＧＬ０００３６５)㊁ｓｒｆＡＣ(ＧＬ０００３６６)ꎻ与丰原素(Ｆｅｎｇｙｃｉｎｆａｍｉｌｙ)相关的基因有６个ꎬ分别为ｐｐｓＡ(ＧＬ００１９７６)㊁ｐｐｓＢ(ＧＬ００１９７５)㊁ｐｐｓＣ(ＧＬ００１９７３)㊁ｐｐｓＤ(ＧＬ００１９７２㊁ＧＬ００１９７４)㊁ｐｐｓＥ(ＧＬ００１９７１)ꎮ图４㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因功能ＫＥＧＧ数据库注释Ｆｉｇ.４㊀ＫＥＧＧｄａｔａｂａｓｅａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ６６４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第７期㊀㊀根据前期研究结果ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７所产的中性蛋白酶具有半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的性质ꎬ可裂解大分子蛋白质中的肽键ꎬ使之成为小分子寡肽[２６]ꎬ在水解反应过程中发挥着重要作用ꎮ通过ＮＷＭＣＣ０１３７基因组与ＫＥＧＧ数据库比对分析可得ꎬＮＷＭＣＣ０１３７基因组中包括枯草杆菌蛋白酶ＡｐｒＥ(ＧＬ００１８５２ꎬＥＣ３.４.２１.６２)㊁中性金属蛋白酶ＮｐｒＥ(ＧＬ００１５８８ꎬＥＣ３.４.２４.２８)㊁丝氨酸蛋白酶Ｅｐｒ(ＧＬ００４０９６ꎬＥＣ３.４.２１.－)和Ｖｐｒ(ＧＬ００４０６２ꎬＥＣ３.４.２１.－)㊁杆状肽酶Ｆ(ＢｐｒꎬＧＬ００１６５２ꎬＥＣ３.４.２１.－)㊁中性蛋白酶Ｂ(ＮｐｒＢꎬＧＬ００１１７６ꎬＥＣ３.４.２４.－)㊁细胞壁相关蛋白酶(ＷｐｒＡꎬＧＬ００１１４２ꎬＥＣ３.４.２１.－)编码基因ꎮ其中编码丝氨酸蛋白酶的基因有８个(表２)ꎬ分别是丝氨酸蛋白酶Ｄｏ(ＳｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅＤｏ)㊁主要细胞内丝氨酸蛋白酶(Ｍａｊｏｒｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ)㊁丝氨酸蛋白酶ＡｐｒＸ(ＳｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅＡｐ￣ｒＸ)㊁膜结合丝氨酸蛋白酶ＣｌｐＰ类(Ｍｅｍｂｒａｎｅ￣ｂｏｕｎｄｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ)㊁丝氨酸蛋白酶(Ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ)㊁微量细胞外丝氨酸蛋白酶Ｖｐｒ(Ｍｉｎｏｒｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｅｒ￣ｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅＶｐｒ)ꎮ推断这些基因是枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７高效降解屠宰动物血液蛋白的基础ꎮ表２㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组中编码丝氨酸蛋白酶的相关基因Ｔａｂｌｅ２㊀ＧｅｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因㊀㊀编码的蛋白酶㊀㊀㊀㊀基因编号ＤｅｇＰ㊁ＨｔｒＡ丝氨酸蛋白酶ＤｏＧＬ００１３８５㊁ＧＬ００３５２１㊁ＧＬ００４３０９ＩＳＰ主要细胞内丝氨酸蛋白酶ＧＬ００１４１７ＡｐｒＸ丝氨酸蛋白酶ＡｐｒＸＧＬ００１８５２ＮｆｅＤ膜结合丝氨酸蛋白酶ＣｌｐＰ类ＧＬ００２７０４Ｋ１４６４５丝氨酸蛋白酶(３.４.２１.￣)ＧＬ００３４６８Ｖｐｒ微量细胞外丝氨酸蛋白酶ＶｐｒＧＬ００４０６２２.３.４㊀碳水化合物相关酶(ＣＡＺｙ)基因数据库注释㊀将Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７的基因组序列与碳水化合物相关酶数据库进行注释比对ꎬ注释结果显示ꎬ编码ＣＡＺｙ的基因有１５２个ꎬ占基因总数的３.４６％ꎮ其中ꎬＮＷＭＣＣ０１３７基因组中有６８个糖苷水解酶(ＧＨｓ)编码基因㊁４３个碳水化合物酶结合模块(Ｃａｒ￣ｂｏｈｙｄｒａｔｅ￣ｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｕｌｅｓꎬＣＢＭｓ)编码基因㊁３１个编码糖基转移酶(ＧＴｓ)基因㊁１３个碳水化合物酯酶(ＣＥｓ)编码基因㊁７个多糖裂解酶(ＰＬｓ)编码基因㊁１个辅助活性酶(ＡＡｓ)编码基因ꎮ在碳水化合物酶结合模块中α￣淀粉酶(ＥＣ３.２.１.１)与分支酶(ＥＣ２.４.１.１８)具有最高的覆盖度ꎮ在糖苷水解酶中ꎬ覆盖度较高的有分支酶㊁几丁质酶(ＥＣ３.２.１.１４)㊁β￣１ꎬ４￣木聚糖内切酶(ＥＣ３.２.１.８)㊁双功能胞壁酰胺酶ＤＤ内肽酶(ＥＣ３.２.１.１７)㊁Ｇ型溶菌酶(ＥＣ３.２.１.１７)ꎮ这些酶在菌株生长代谢过程中发挥着重要作用ꎮ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７基因组中还含有内切葡聚糖酶(ＥＣ３.２.１.４)㊁β￣葡萄糖苷酶(ＥＣ３.２.１.２１)等酶的编码基因ꎬ从基因层面进一步了解了菌株ＮＷＭＣＣ０１３７在碳水化合物代谢中的潜力ꎮ２.４㊀系统发生分析与共线性分析根据全基因组序列ꎬ使用ＴｒｅｅＢｅＳＴ软件对Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１１７７４㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＣＧＭＣＣ２１０８㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ２１２２８㊁Ｂ.ｔｅｑｕｉｌｅｎｓｉｓＥＡ￣ＣＢ００１５㊁Ｂ.ｖｅｌｅｚｅｎｓｉｓＪＳ２５Ｒ构建系统发育进化树(图５)ꎮ从图中可以看出Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７与枯草芽孢杆菌１６８聚合在同一分支ꎬ说明这两者之间的进化距离最为接近ꎮ分支点上的数字表示自展值ꎮ图５㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ物种间的系统进化树Ｆｉｇ.５㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｐｅｃｉｅｓ㊀㊀为研究Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７分别与Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１１７７４基因组的整体相似性ꎬ采用ＭＵＭｍｅｒ软件对它们进行共线性分析(图６)ꎮ通过共线性分析ꎬ可以得到测序基因组与参考基因组之间遗传基因变化情况ꎬ以及菌株基因组在进化过程中发生的结构性变异情况ꎮ枯草芽孢杆菌Ｂ.ｓｕｂ￣ｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７分别与Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１１７７４均具有良好的共线性ꎬ存在着大量同源性基因ꎬ说明菌株之间的进化关系较近ꎮ而Ｂ.ｓｕｂｔｉ￣７６４１刘高强等:一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析ｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７与Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１１７７４之间的遗传差异较为明显ꎮ２.５㊀次级代谢产物合成基因注释结果通过ａｎｔｉＳＭＡＳＨ对菌株ＮＷＭＣＣ０１３７进行次级代谢产物合成基因注释(表３)ꎮ该菌株共有１３种次级代谢产物合成基因簇被注释ꎬ其中包括非核糖体多肽类(ＮＲＰＳ)㊁萜烯(Ｔｅｒｐｅｎｅ)㊁塞克肽类(Ｓａｃｔｉｐｅｐ￣ｔｉｄｅ)㊁Ｔｒａｎｓａｔｐｋｓ㊁第三类聚酮合酶(Ｔ３ＰＫＳ)㊁甘氨酸(Ｇｌｙｃｏｃｉｎ)㊁内酯(Ｂｅｔａ￣ｌａｃｔｏｎｅ)㊁表肽(Ｅｐｉｐｅｐｔｉｄｅ)㊁兰提肽(Ｒａｎｔｈｉｐｅｐｔｉｄｅ)和ＣＤＰＳ基因簇ꎮ在已鉴定的基因簇类型中ꎬ基因簇相似性为１００％的有产孢致死因子(Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎｋｉｌｌｉｎｇｆａｃｔｏｒ)㊁聚酮类化合物(Ｂａｃｉｌ￣ｌａｅｎｅ)㊁丰原素(Ｆｅｎｇｙｃｉｎ)㊁枯草芽孢杆菌素１６８(Ｓｕｂｌａｎｃｉｎ１６８)㊁儿茶酚型嗜铁素(Ｂａｃｉｌｌｉｂａｃｔｉｎ)㊁芽孢杆菌素(ＳｕｂｔｉｌｏｓｉｎＡ)㊁杆菌溶素(Ｂａｃｉｌｙｓｉｎ)合成基因簇ꎮ有３类基因簇未能注释到明确的代谢产物ꎮ非核糖体多肽类(ＮＲＰＳ)基因簇与表面活性素(Ｓｕｒ￣ｆａｃｔｉｎ)基因簇相似度为８３％ꎬ表肽(Ｅｐｉｐｅｐｔｉｄｅ)基因簇与泰蓝抑素Ａ(ＴｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎＡ)基因簇相似度仅为１０％ꎬ表明菌株ＮＷＭＣＣ０１３７可能合成新的代谢产物ꎮ图６㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７与Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８㊁Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７与Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１１７７４共线性分析Ｆｉｇ.６㊀ＣｏｌｉｎｅａｒｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ａｎｄＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ.１６８ꎬＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７ａｎｄＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１１７７４表３㊀Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７次级代谢产物合成基因簇Ｔａｂｌｅ３㊀ＧｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７编号类型起始位点(ｂｐ)终止位点(ｂｐ)最相似的已知基因簇㊀㊀㊀相似度(％)基因个数基因簇１兰提肽㊁塞克肽类２０３８５１２２５９２４产孢致死因子合成基因簇１００２２基因簇２非核糖体多肽类３５７９８０４２１４１９表面活性素合成基因簇８２４２基因簇３萜烯１１４９６３０１１７０１４８㊀㊀㊀㊀㊀－－２１基因簇４第三类聚酮合酶ꎬ非核糖体多肽类１７６３４４１１８６８６８７聚酮类化合物合成基因簇１００４６基因簇５非核糖体多肽类ꎬ内酯１９４０３０３２０１７３３０丰原素合成基因簇１００３９基因簇６萜烯２０９１８０７２１１３７０５㊀㊀㊀㊀㊀－－１９基因簇７甘氨酸２２５９１５８２２７９３２８枯草芽孢杆菌素１６８合成基因簇１００２５基因簇８第三类聚酮合酶２２９６５８９２３３７６８６㊀㊀㊀㊀㊀－－４３基因簇９非核糖体多肽类３２６０１４７３３０７２８３儿茶酚型嗜铁素合成基因簇１００４０基因簇１０ＣＤＰＳ３５９３４４９３６１４１９５㊀㊀㊀㊀㊀－－１７基因簇１１塞克肽类３８２５７１３３８４７３２４芽孢杆菌素Ａ合成基因簇１００１９基因簇１２其他３８５０３２３３８９１７４１杆菌溶素合成基因簇１００３９基因簇１３表肽４１１５３９５４１３７０９３泰蓝抑素Ａ合成基因簇１０２１ － 表示ＮＷＭＣＣ０１３７基因组中未被鉴定的基因簇ꎮ８６４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第７期３㊀讨论屠宰场废弃动物血液不能得到价值化利用ꎬ导致大量蛋白质资源被浪费ꎮ课题前期搜集到的Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７是产蛋白酶的优势菌株ꎬ能够有效将血液中的大分子蛋白质分解为小分子多肽及氨基酸ꎮ由于传统方法难以挖掘该菌产中性蛋白酶关键基因ꎬ因此对该菌进行全基因组测序以挖掘其基因资源ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组在ＧＯ数据库中被注释到与生物过程㊁分子功能有关的基因占比多ꎬ这些基因对菌株的生物学过程影响较大ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组在ＣＯＧ数据库中被注释到与氨基酸㊁碳水化合物转运与代谢有关的基因较多ꎮＢ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组在ＫＥＧＧ数据库中被注释到与代谢途径有关的基因最多ꎬ其中碳水化合物代谢与氨基酸代谢是被注释到基因最多的两种代谢途径ꎮ３个数据库的注释结果一致ꎮＫＥＧＧ数据库中还注释到Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组中的７种胞外蛋白酶编码基因ꎬ最主要的胞外蛋白酶是由ＡｐｒＥ编码的枯草杆菌蛋白酶和ＮｐｒＥ编码的中性金属蛋白酶[２７]ꎬ枯草杆菌蛋白酶可将环境中的不溶性蛋白质降解为多种寡肽和氨基酸ꎬ以此来生产含氮化合物供细菌本体利用ꎮ此外丝氨酸蛋白酶Ｅｐｒ和Ｖｐｒ㊁杆状肽酶Ｆ㊁中性蛋白酶Ｂ㊁细胞壁相关蛋白酶ＷｐｒＡ编码基因ꎬ这些基因也是ＮＷＭＣＣ０１３７能够高效降解血液中蛋白质的基础ꎮ而且前期研究结果表明ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７所产蛋白酶具有金属蛋白酶㊁半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的特性ꎮ菌株代谢产生丝氨酸蛋白酶表明ＡｐｒＸ基因也是影响芽孢杆菌属产胞外蛋白酶的重要基因ꎬ因此ＮｐｒＥ与ＡｐｒＸ均是影响菌株ＮＷＭＣＣ０１３７产酶的关键基因ꎮ贾仲昕等[２８]在细菌生长的后期阶段对蛋白酶基因的表达与产酶能力进行了检测ꎬ结果表明除枯草杆菌蛋白酶ＡｐｒＥ和中性金属蛋白酶ＮｐｒＥ编码基因外ꎬＡｐ￣ｒＸ也是影响芽孢杆菌属细菌产胞外蛋白酶能力的重要基因[２９]ꎮ前人研究结果验证了本研究结果ꎮ此外ꎬ蛋白酶是一种诱导酶ꎬ在合成过程中受多方面因素的影响ꎮ在ＣＡＺｙ数据库注释结果中ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７含有许多与α￣淀粉酶㊁β￣１ꎬ４￣木聚糖内切酶㊁Ｇ型溶菌酶㊁几丁质酶㊁β￣葡萄糖苷酶㊁内切葡聚糖酶相关的编码基因ꎮ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７可产生β￣葡萄糖苷酶ꎬ内切葡聚糖酶㊁β￣１ꎬ４￣木聚糖内切酶等纤维素酶ꎮ动物饲料中含有大量的纤维素ꎬ纤维素无法被动物高效利用ꎬ枯草芽孢杆菌可作为添加剂应用于饲料中[３０]ꎮ将枯草芽孢杆菌混入饲料后ꎬ在微生物的分解作用下纤维素能够被动物机体快速吸收ꎬ转变为动物生长发育过程中的供能物质ꎬ枯草芽孢杆菌产生的碳水化合物分解酶在这一过程中有着不可或缺的作用ꎮＧ型溶菌酶不但具有广谱抗菌作用ꎬ在抗病毒与抗肿瘤活性中也有广泛的应用[３１]ꎮ此外还注释到与几丁质酶等细胞壁降解酶相关的编码基因ꎬ推测菌株ＮＷＭＣＣ０１３７可通过降解病原真菌的细胞壁来抑制病原微生物的生命活动ꎬ从而完成抑菌作用ꎮ在抗菌物质合成方面ꎬＮＷＭＣＣ０１３７菌株有１３个合成基因簇ꎬ包括１０个已知基因簇和３个未知基因簇ꎬ菌体在生长过程中可以产生枯草菌素㊁丰原素㊁杆菌溶素㊁表面活性素等活性物质ꎬ在致病菌的防治中具有很大潜力ꎮＢａｃｉｌｌａｅｎｅ是一类能抑制蛋白质合成的聚酮类化合物ꎬ因此对细菌和真菌均有良好的抑制作用ꎮ丰原素是一种具有很强抗真菌活性的环状脂肽类物质[３２]ꎮ枯草芽孢杆菌素１６８是一类具有广谱抗菌作用的抗菌肽ꎬ在寄生虫防治方面具有突出作用[３３]ꎮ儿茶酚型嗜铁素是一种对铁离子有高亲和性的螯合剂ꎬ而铁离子是病原菌生长过程中必不可少的元素ꎬ因此在儿茶酚型嗜铁素的作用下致病菌的生长受到抑制[３４]ꎮ还有研究结果表明ꎬ儿茶酚型嗜铁素具有控制微生物间竞争的作用[３５]ꎮ杆菌溶素是一类双肽抗菌物质ꎬ对真菌和细菌都表现出强大的抑菌活性[３６]ꎮ表面活性素是由芽孢杆菌属细菌产生的一种环脂肽类小分子活性物质ꎬ不仅具有良好的抗菌㊁抗病毒活性[３７]ꎬ还展现出了灭蚊活性[３８]ꎮ抗菌物质的存在也为菌株ＮＷＭ￣ＣＣ０１３７在生物防治中的应用提供了依据ꎮ通过ＧＯ㊁ＣＯＧ㊁ＫＥＧＧ数据库注释ꎬ在Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组中发现ꎬ与氨基酸转运和代谢㊁碳水化合物运输和代谢㊁转录代谢途径有关的基因占比较多ꎮ在ＫＥＧＧ数据库注释中ꎬ还发现了７种蛋白酶编码基因ꎬ而在ＣＡＺｙ数据库注释中ꎬ发现与碳水化合物降解㊁生物合成等途径相关的编码基因也十分丰富ꎮ推测这些酶的存在是菌株ＮＷＭ￣ＣＣ０１３７能够高效水解屠宰动物血液蛋白的内在因素ꎮ表面活性素㊁丰原素㊁儿茶酚型嗜铁素和杆菌溶９６４１刘高强等:一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析素等次级代谢产物对致病菌具有较好的防控效果ꎬ在水解过程中能够抑制致病微生物的生长从而减少营养物质的损失ꎮ４㊀结论本研究采用第二代ＤＮＢＳＥＱ平台与第三代ＰａｃＢｉｏ平台高通量测序技术对ＮＷＭＣＣ０１３７进行全基因组测序ꎬ全基因组长度为４２１５５８５ｂｐꎬＧ＋Ｃ含量为４４ ２３％ꎬ同时将完整的基因组数据与ＧＯ㊁ＫＥＧＧ㊁ＣＯＧ和ＣＡＺｙ等数据库进行功能注释ꎬ从分子生物学的角度探究ＮＷＭＣＣ０１３７的生物学特性以及基因组功能特性ꎮ在ＫＥＧＧ数据库中Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组被注释到７种蛋白酶基因以及与萜类和聚酮类化合物代谢相关的基因ꎮ在ＣＡＺｙ数据库中Ｂ.ｓｕｂｔｉｌｉｓＮＷＭＣＣ０１３７基因组被注释到α￣淀粉酶㊁几丁质酶㊁分支酶㊁β￣１ꎬ４￣木聚糖内切酶㊁Ｇ型溶菌酶㊁β￣葡萄糖苷酶㊁内切葡聚糖酶等多种酶的编码基因ꎬ这些基因在菌株生长过程中发挥着重要作用ꎮ通过ａｎｔｉＳＭＡＳＨ分析ꎬ菌株ＮＷＭＣＣ０１３７含有多个次级代谢产物合成基因簇ꎬ因此对抑制致病菌的生长具有较好的效果ꎮ本研究从基因层面揭示了菌株ＮＷＭＣＣ０１３７的遗传信息ꎬ为该菌株用于降解屠宰动物血液蛋白及生物防控提供了数据支持ꎮ参考文献:[１]㊀ＢＡＨＣＳꎬＣＡＲＮＥＡꎬＭＣＣＯＮＮＥＬＬＭＡꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｒｏｍｄｅｅｒꎬｓｈｅｅｐꎬｐｉｇａｎｄｃａｔｔｌｅｒｅｄｂｌｏｏｄｃｅｌｌｆｒａｃｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｐｌａｎｔａｎｄｆｕｎｇａｌｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＦｏｏｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１６ꎬ２０２:４５８￣４６６.[２]㊀ＬＹＮＣＨＳＡꎬＭＵＬＬＥＮＡＭꎬＯᶄＮＥＩＬＬＥＥꎬｅｔａｌ.Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｂｌｏｏｄｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ:Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｔｈｅｓｔａｔｅｏｆｔｈｅａｒｔｉｎｂｌｏｏｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ[Ｊ].ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＲｅｖｉｅｗｓｉｎＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＦｏｏｄＳａｆｅｔｙꎬ２０１７ꎬ１６(２):３３０￣３４４. [３]㊀马咸莹ꎬ马石霞ꎬ周雪雁ꎬ等.一株降解牛血液蛋白细菌的筛选及酶学性质研究[Ｊ].微生物学杂志ꎬ２０２１ꎬ４１(１):４３￣５１. [４]㊀ＢＨＡＴＺＦꎬＫＵＭＡＲＳꎬＢＨＡＴＨＦ.Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆａｎｉｍａｌｏｒｉｇｉｎ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ５２(９):５３７７￣５３９２.[５]㊀ＷＡＮＧＬꎬＺＨＡＮＧＢＲꎬＨＡＮＪꎬｅｔａｌ.ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｍｅａｌｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｗｉｔｈｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ＆Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎꎬ２０１５ꎬ１０４:１１２￣１１７.[６]㊀ＺＨＥＮＧＹＢꎬＺＨＡＮＧＨꎬＷＡＮＧＤＢꎬｅｔａｌ.ＳｔｒａｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｂｌｏｏｄｍｅａｌｕｓｉｎｇＡｓｐｅｒ￣ｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒａｎｄＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１４ꎬ１０１:７０￣８０.[７]㊀郭秀云ꎬ张开臣ꎬ孟庆丰ꎬ等.饲用血粉加工工艺及其产品质量研究进展[Ｊ].中国家禽ꎬ２０１９ꎬ４１(１９):５０￣５４. [８]㊀庞㊀伟.猪血多肽的发酵法制备及其ＡＣＥ抑制活性研究[Ｄ].合肥:合肥工业大学ꎬ２００９.[９]㊀陶艳华ꎬ姚大伟ꎬ王㊀政ꎬ等.血红蛋白降解菌的分离筛选与鉴定[Ｊ].食品与生物技术学报ꎬ２００９ꎬ２８(６):８５４￣８５７. [１０]ＹＡＯＤＷꎬＱＵＪꎬＣＨＡＮＧＰＷꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒ￣ｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｆｒｏｍｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ￣ｄｅｇｒａｄｉｎｇＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓＮＪＭ４ｔｏｐｒｏｄｕｃｅｆｅｒｍｅｎｔｅｄｂｌｏｏｄｍｅａｌ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ４９(５):６２６￣６３１.[１１]崔玮琪ꎬ王红丽ꎬ王㊀莘.发酵猪血菌株Ｘ￣１７发酵条件优化[Ｊ].吉林农业大学学报ꎬ２０１５ꎬ３７(４):４８８￣４９２.[１２]马咸莹.分解牛血液蛋白菌株的筛选及其产酶特性研究[Ｄ].兰州:西北民族大学ꎬ２０２１.[１３]ＺＨＡＮＧＨꎬＺＨＡＮＧＢＲꎬＺＨＥＮＧＹＢꎬｅｔａｌ.ＮｅｕｔｒａｌｐｒｏｔｅａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｂｌｏｏｄｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｄｅｔｅｒｉ￣ｏｒａｔｉｏｎａｎｄＢｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎꎬ２０１４ꎬ９３:２３５￣２４０.[１４]马子豪ꎬ向㊀军ꎬ纪晓岚ꎬ等.１株降解牦牛血液菌株的分离鉴定[Ｊ].现代畜牧兽医ꎬ２０２２ꎬ８(８):１￣５.[１５]ＥＡＲＬＡＭꎬＬＯＳＩＣＫＲꎬＫＯＬＴＥＲＲ.ＥｃｏｌｏｇｙａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ１６(６):２６９￣２７５.[１６]ＣＨＡＴＴＥＲＪＥＥＪꎬＧＩＲＩＳꎬＭＡＩＴＹＳꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＡＴＣＣ６６３３)ｆｒｏｍｏｐｔｉｍｉｚｅｄｓｏｌｉｄ￣ｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏ￣ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１５ꎬ６２(５):７０９￣７１８. [１７]ＭＯＲＩＫＡＷＡＭ.ＢｅｎｅｆｉｃｉａｌｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎｂｙｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｂａｃｔｅｒｉａＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓａｎｄｒｅｌａｔｅｄｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２００６ꎬ１０１(１):１￣８.[１８]袁㊀萍ꎬ江明锋ꎬ官久强ꎬ等.基于枯草芽孢杆菌多组学数据全基因组规模代谢模型与蛋白质降解模拟[Ｊ].东北农业大学学报ꎬ２０２０ꎬ５１(１１):６１￣６９.[１９]ＧＵＯＸＨꎬＬＩＤＦꎬＬＵＷＱꎬｅｔａｌ.ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｔｒａｉｎｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｖｉｖｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓＭＡ１３９ｉｎｐｉｇｓ[Ｊ].ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋꎬ２００６ꎬ９０(２):１３９￣１４６.[２０]ＤＥＬＣＨＥＲＡＬꎬＢＲＡＴＫＥＫＡꎬＰＯＷＥＲＳＥＣꎬｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｅｓａｎｄｅｎｄｏｓｙｍｂｉｏｎｔＤＮＡｗｉｔｈＧｌｉｍｍｅｒ[Ｊ].Ｂｉｏｉｎ￣ｆｏｒｍａｔｉｃｓꎬ２００７ꎬ２３(６):６７３￣６７９.[２１]ＬＡＧＥＳＥＮＫꎬＨＡＬＬＩＮＰꎬＲØＤＬＡＮＤＥＡꎬｅｔａｌ.ＲＮＡｍｍｅｒ:ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔａｎｄｒａｐｉｄａｎｎｏｔａｔｉｏｎｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｎｕ￣ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００７ꎬ３５(９):３１００￣３１０８.[２２]ＬＯＷＥＴＭꎬＥＤＤＹＳＲ.ＴＲＮＡｓｃａｎ￣ＳＥ:ａｐｒｏｇｒａｍｆｏｒｉｍｐｒｏｖｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｆｅｒＲＮＡｇｅｎｅｓｉｎｇｅｎｏｍｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ１９９７ꎬ２５(５):９５５￣９６４.[２３]ＧＡＲＤＮＥＲＰＰꎬＤＡＵＢＪꎬＴＡＴＥＪＧꎬｅｔａｌ.Ｒｆａｍ:ｕｐｄａｔｅｓｔｏｔｈｅＲＮＡｆａｍｉｌｉｅｓｄａｔａｂａｓｅ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００９ꎬ３７(ｓｕｐｐｌ１):１３６￣１４０.０７４１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第７期[２４]ＢＥＮＳＯＮＧ.Ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｓｆｉｎｄｅｒ:ａｐｒｏｇｒａｍｔｏａｎａｌｙｚｅＤＮＡｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ１９９９ꎬ２７(２):５７３￣５８０. [２５]孙悦龙ꎬ刘㊀浩ꎬ朱宝成ꎬ等.枯草芽孢杆菌Ｎ２￣１０的基因组测序和比较基因组分析[Ｊ].微生物学通报ꎬ２０２３ꎬ５０(１):１３１￣１４７.[２６]熊㊀科ꎬ邓㊀蕾ꎬ柳佳芸ꎬ等.蛋白酶水解底物特异性机制研究进展[Ｊ].食品与发酵工业ꎬ２０１９ꎬ４５(１９):２９２￣２９８.[２７]ＣＯＮＴＥＳＩＮＩＦＪꎬＭＥＬＯＲＲＤꎬＳＡＴＯＨＨ.ＡｎｏｖｅｒｖｉｅｗｏｆＢａ￣ｃｉｌｌｕｓｐｒｏｔｅａｓｅｓ:ｆｒｏｍｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅ￣ｖｉｅｗｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ３８(３):３２１￣３３４.[２８]ＴＯＹＭＥＮＴＳＥＶＡＡＡꎬＭＡＳＣＨＥＲＴꎬＳＨＡＲＩＰＯＶＡＭＲ.Ｒｅｇｕ￣ｌａｔｏｒｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｕｓｐｒｏｔｅａｓｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ７４:５５０￣５５９.[２９]贾仲昕ꎬ赵佳男ꎬ季㊀芳ꎬ等.芽孢杆菌蛋白酶基因的比较基因组学分析[Ｊ].广东农业科学ꎬ２０２２ꎬ４９(５):１１０￣１１７. [３０]王宏浩ꎬ张高瑜ꎬ逯梦凡ꎬ等.枯草芽孢杆菌ＺＸ￣１１培养条件及抑菌性能研究[Ｊ].中国酿造ꎬ２０２２ꎬ４１(７):１３８￣１４３. [３１]赵春晖ꎬ徐㊀玮ꎬ冯㊀斌ꎬ等.七鳃鳗ｇ型溶菌酶的分子特征和抗菌活性[Ｊ].中国生物化学与分子生物学报ꎬ２０１５ꎬ３１(５):４９５￣５０４.[３２]ＧＩＭＥＮＥＺＤꎬＰＨＥＬＡＮＡꎬＭＵＲＰＨＹＣＤꎬｅｔａｌ.Ｆｅｎｇｙｃｉｎａａｎ￣ａｌｏｇｕｅｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄａｎｔｉｆｕｎｇａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ[Ｊ].ＯｒｇａｎｉｃＬｅｔｔｅｒｓꎬ２０２１ꎬ２３(１２):４６７２￣４６７６.[３３]刘扬科ꎬ赵天效ꎬ卢晓颖ꎬ等.枯草芽孢杆菌ＹＴ１６８￣６产抗菌肽ｓｕｂｌａｎｃｉｎ的发酵工艺优化及培养基筛选的研究[Ｊ].中国畜牧兽医ꎬ２０２１ꎬ４８(９):３２３２￣３２４１.[３４]戚家明ꎬ孙杉杉ꎬ张东旭ꎬ等.芽孢杆菌ＢＳ￣６基于全基因组数据的分类鉴定及拮抗能力分析[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１９ꎬ３５(１０):１１１￣１１８.[３５]ＤＩＭＯＰＯＵＬＯＵＡꎬＴＨＥＯＬＯＧＩＤＩＳＩꎬＢＥＮＡＫＩＤꎬｅｔａｌ.ＤｉｒｅｃｔａｎｔｉｂｉｏｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｂａｃｉｌｌｉｂａｃｔｉｎｂｒｏａｄｅｎｓｔｈｅｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌｒａｎｇｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓＭＢＩ６００[Ｊ].ｍＳｐｈｅｒｅꎬ２０２１ꎬ６(４):ｅ００３７６２１.[３６]ＮＡＮＮＡＮＣꎬＶＵＨＱꎬＧＩＬＬＩＳＡꎬｅｔａｌ.ＢａｃｉｌｙｓｉｎｗｉｔｈｉｎｔｈｅＢａ￣ｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｇｒｏｕｐ:Ｇｅｎｅｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｖｅｒｓｕｓａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙａ￣ｇａｉｎｓｔｇｒａｍ￣ｎｅｇａｔｉｖｅｆｏｏｄｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ３２７:２８￣３５.[３７]ＳＡＮＴＯＳＶＳＶꎬＳＩＬＶＥＩＲＡＥꎬＰＥＲＥＩＲＡＢＢ.Ｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄａｐ￣ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｕｒｆａｃｔｉｎｆｏｒｈｅａｌｔｈａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈꎬＰａｒｔＢ:Ｃｒｉｔ￣ｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓꎬ２０１８ꎬ２１(６/７/８):３８２￣３９９.[３８]ＧＥＥＴＨＡＩꎬＭＡＮＯＮＭＡＮＩＡＭ.Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ:ａｎｏｖｅｌｍｏｓｑｕｉｔｏｃｉｄａｌｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓｓｓｐ.ｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＶＣＲＣＢ４７１)ａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆａｂｉｏｔｉｃｆａｃｔｏｒｓｏｎｉｔｓｐｕｐｉｃｉｄａｌｅｆｆｉｃａｃｙ[Ｊ].ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ５１(４):４０６￣４１２.(责任编辑:成纾寒)１７４１刘高强等:一株高效降解血液蛋白的枯草芽孢杆菌ＮＷＭＣＣ０１３７全基因组测序及分析。
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直径
0.05 0.10 0.50 1.0 5.0
表面积cm2
11428 5714 1143 714 127
数量(×109)
145513 18189 145.51 18.19 0.1455
注：浩源使用200ul血样，加入6ul Beads，其表面积约为 30cm2； ( 可随意放大体积，血样承载量易调整 )
6
手工DNA提取方法——沉淀法或硅胶膜柱法
硅胶膜：高盐低pH值结合核酸， 低盐高pH值洗脱。 可减少有机溶剂的使用 纯度高，得率好 需要多步离心 硅胶膜易堵塞 柱内硅胶膜面积有限，核酸吸附 有限
7
核酸提取的标准
P8
以磁性微粒为载体提取核酸
磁粒的类型：按需要包被不同材料 磁粒的面积：与颗粒大小和数量有关
17
P18
Applied Biosystems 7500实时定量PCR系统
ABI 7500 Real-Time PCR System
18
P19
低成本
适应国内临检使用的PCR技术及国产试剂
19
低成本
P20
20
21
临检PCR中的几大技术矛盾
21
谢谢!
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全自动核酸提取技术 在临床PCR中的应用
2013月11月 黄道培
1
© 2009 PerkinElmer
核酸检测在临检PCR中的十二字经
2
可用于临检二种PCR技术
•实时荧光检测法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
•终点检测微流芯片技术
3
病毒载量：HBV，HCV，HIV
检测目标：DNA, RNA 检测标准：Real Time 检测下限：1000IU/ml 检验准确性：比较差
9
Pre-NAT全自动核酸提取及PCR前处理工作站
10
Pre-NAT工作站特点和优势
全自动化： PCR反应体系构建 高通量：96个/次 高得率高纯度：专利亲水性磁珠 多种起始样本：血清、拭子... 提取时间：< 1.5h 临床PCR实验室及科研用途
11
试剂
HBV高灵敏定量试剂
HCV高灵敏定量试剂
50℃ 2分钟
94℃ 3分钟
（94℃ 10秒
50℃ 10秒
65℃ 35秒）
45个循环
15
P16
COBAS AmpliPrep / TaqMan 系统
COBAS® AmpliPrep / COBAS® TaqMan® System
16
P17
PCR体系移动工作站
Eppendorf epMotion 5075
12
HBV/HCV高灵敏定量试剂-特点
高灵敏：
HBV 检测下限：50 IU/ml（ 20 IU/ml 注册 中） HCV 检测下限：100 IU/ml（ 50 IU/ml 注册
•国家SFDA技术审评中心《HBV DNA定量试剂技术审 中） 评指导原则》中指出： HBV DNA最低检测限应 ≤30IU/ml
8
磁珠法核酸提取
主要的磁珠法提取技术
转移磁珠
Kingfisher技术：永磁铁，磁棒上下往复运动 PPS技术：洗头吸取液体，磁铁吸附
chemagic技术：电磁铁，磁棒可旋转 转移液体： 底部法,磁珠被吸附在管/板底部,用吸头转移液体
磁珠法技术要点
转移液体/转移磁珠：提取时间的差异 磁珠的重悬方式：纯度和得率的差异 最大样本体积：处理能力 所使用磁珠的差异
13
HBV/HCV高灵敏定量试剂-特点
独家内标系统-防止假阴性：
内标设计理念符合SFDA及CNCCL要求； 提取、扩增 全程参与监控；
内标名称 DNA-IC RNA-IC
监控反应类别 HBV DNA HCV, HIV-1 RNA
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HBV/HCV高灵敏定量试剂-特点
符合国际标准的 UNG-dUTP防污染系统 防止假阳性
检测目标：DNA，RNA 检测标准：Real Time /End Point 检测下限：30IU/ml 检验准确性：优良 使用全自动设备
4
题目
PCR技术在血液筛查中的应用
核酸样品制备对临检PCR的重要性
• 尽可能用完样品 (100ul) • 固化样品及增加洗脱率 • 通用捕集法
5
P6
样品制备主要方法