第六章工业微生物诱变育种
0710009_微生物育种学课后习题答案
0710009_微⽣物育种学课后习题答案《微⽣物遗传育种》复习思考题01 绪论1、⼯业微⽣物菌种应具有哪些基本特征？①纯种；②遗传稳定；③易⽣长发育繁殖；④抗杂菌能⼒强；⑤对诱变剂敏感；⑥⽣产产物品质好、产量⾼、产出快。
02 第四章⼯业微⽣物育种诱变剂1.紫外线诱变育种的作⽤机制及步骤。
紫外线的光谱范围为40~390nm，其中有效的诱变波长为200~300nm，DNA 吸收峰值在254nm处，此时诱变效果最好。
UV 诱变的主要原因是单链相邻碱基或双链间形成嘧啶⼆聚体。
单链TT⼆聚体易造成复制在该处停⽌或碱基错误插⼊该缺⼝形成突变；双链间TT⼆聚体交联，减弱双键间氢键的作⽤，并引起双链结构扭曲变形，阻碍双链分开，使复制⽆法进⾏。
最终引起碱基置换、缺失或移码。
A和T的⽐例越⾼，对紫外线就越敏感。
步骤：①出发菌株；②前培养（加酵母膏等，⽬的是培养细菌到对数期；霉菌、放线菌孢⼦刚萌发）；③制备菌菌悬液；④紫外线照射；⑤后培养（加⾊氨酸、异烟肼等，⽬的是抑制修复、减少死亡、促进正突变体增殖）；⑥稀释涂⽫。
紫外辐射剂量：绝对剂量单位erg/mm2，要剂量仪测定，较⿇烦；相对剂量单位⽤照射时间或杀菌率表⽰，⼀般认为以杀菌率90%~99.9%较好。
15W紫外灯波长集中在253.7nm，诱变效果⽐30W的好。
2.突变后其基因型是否会很快表现？为什么？表型延迟2代以上，原因有：1、与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关；2、当突变发⽣在多核细胞中的某⼀个核，该细胞就成为杂核细胞了；3、原有基因产物的影响。
（产⽣原因：①分离性迟延现象②⽣理性迟延现象）3.物理诱变剂主要有哪⼏类？请举例？紫外线，X射线，γ射线，快中⼦，α射线，β射线，微波，超声波，电磁波，激光射线和宇宙射线等。
4.化学诱变剂主要有⼏⼤类？碱基类似物；脱氨剂；烷化剂；羟化剂；⾦属盐类；吖啶类；秋⽔仙碱等。
5、使⽤化学诱变剂时需要注意什么？1.诱变剂量：主要取决于化学诱变剂浓度和处理时间，化学诱变使⽤剂量要以诱变效应⼤，⽽副反应⼩为原则。
微生物诱变育种技术
微生物诱变育种技术介绍了微生物诱变育种的各种方法，对经典的诱变技术、复合诱变和新型的诱变技术等处理方法进行了比较。
对离子注入法和等离子体诱变育种等新型诱变育种技术的机理进行了阐述，并对其优缺点以及潜在的研究方向进行了论述。
标签：微生物诱变；离子注入法；等离子体诱变微生物诱变育种是一种基因突变技术，通过技术手段改变微生物的遗传结构和功能，进而筛选出具有特定性状的，优良突变型微生物。
这种育种方式，具有较高的微生物变异率，变异速度快，效率高等优点，是食品加工和医药生产等工业的首选方法。
常用的微生物诱变育种方法包括物理法、化学法和生物法等，其中物理法诱变包括：紫外诱变、X射线诱变和γ射线诱变等，化学法诱变包括烷基磺酸盐和烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物、次乙胺和环氧乙烷类和芥子气类），生物法包括基因转导、基因转化和转座子诱变等。
复合诱变是指采用两种及以上的诱变方法，对微生物进行诱变，制的目标菌株。
通常仅采用一种方法进行诱变，会使微生物产生抗性，从而降低突变率，复合诱变具有补充不同诱变方法之间缺陷的优势。
近些年涌现出一批创新的诱变技术，如离子注入诱变法、大气压冷等离子诱变，其中离子注入诱变法具有与复合诱变相似的特性，日趋成为研究诱变技术的主流方向。
原生质体是包含细胞膜和膜内细胞质及其他具有生命活性细胞器的生物质，对于微生物来说即去除细胞壁的细胞。
原生质体也可以作为诱变的对象，其对外界敏感度很高，因此变异率也很高。
1 经典诱变技术1.1 物理诱变1.1.1 紫外诱变DNA由以嘌呤和嘧啶为碱基的核苷酸组成，紫外线诱变可以使嘧啶形成二聚体，DNA在复制和转录时，因存在嘧啶二聚体而不能分离，进而发生变异。
该方法简单、操作安全且诱变率高，其缺点：诱变原理简单，引起的突变单一，形成的突变体类型较少，而对于基因损伤及其修复的研究却很有意义。
现在，对于细菌、酵母菌或霉菌的紫外诱变往往是对其原生质体的诱变，缺少了细胞壁对细胞的保护，紫外线可以更直接的作用于DNA，提高突变率，从而产生更多的突变体和表现型。
发酵工业菌种选育 诱变育种
诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，仍是目前被广泛使用的主要育种手段。 当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外, 还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。
诱变育种的一般步骤
1）出发菌株的选择2）单细胞（或单孢子）悬液制备3）诱变剂和使用剂量的选择4）变异株的初筛5）变异株的复筛6）变异株稳定性试验7）菌种特性考察8）中试验证9）大型投产试验
得单细胞悬液的方法必须具有针对性，对产抱子或芽抱的微生物最好用其孢子或芽孢。
在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞.然后再用脱脂棉花或滤纸过滤。
常用的物理诱变剂处理方法
常用的物理诱变剂处理方法
01
02
后培养与稀释涂布
紫外线照射
处理前先开紫外灯预热20min，使光波稳定。然后，取30ml菌悬液置于7cm培养皿中，并置于诱变箱内的磁力搅拌器上，离灯管一定距离，打开皿盖，暴露子紫外线下照射一定时间，边照射边搅拌，力求使细胞均匀吸收紫外线光波。经过紫外线诱变后的菌体转入无菌试管内，置于冰水中浸1-2h，抑制修复酶类的活性，使修复难以进行，有利于提高突变率。
1.亚硝酸诱变
在多核细胞中，仍然采用高剂量，因为在高剂量诱变时，除个别核发生突变外，其他核均被致死，可形成较纯的变异菌落，同也造成遗传物质的巨大损伤，可减少回复突变。
诱变育种的一般原则
诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
4.单袍了(或单细胞)悬液的制备
细胞的生理状态对诱变处理会产生很大的影响，细菌一般在对数生长期的诱变处理效果较好，而霉菌和放线菌的分生孢子在稍加萌发时进行诱变处理可提高诱变效率。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，避免长出不纯的菌落。
第六章-工业微生物育种PPT课件
中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及
嘌原呤养、型嘧（啶pr的oto能tr力op）h）。营养缺陷型经回复突变或重组， 回[A到+B原-]来：野能生在型[+的]、营[B养]生要长求 [[AA+-BB++]]：, 可能在在[[-+]生]、长[A]生长 [A-B-]：能在[+]生长
（2）筛选步骤（5步）
诱变处理 中间培养 淘汰野生型 检出缺陷型 鉴定缺陷型
①中间培养 CM或SM培养基，培养过夜。克服表型延迟。
②淘汰野生型 即浓缩缺陷型，以提高检出率
方法
抗生素法（G+细菌：青霉素；酵母菌 和霉菌：制霉菌素）
菌丝过滤法（丝状真菌、放线菌）
饥饿培养（无N）MM 6~12 h 2N培养(2N)MM 1~2 h 加抗生素(或菌丝过滤)，培养过夜
➢ 单链断裂：DNA双螺旋结构中一条链断 裂
➢ 双链断裂：DNA双螺旋结构中两条互补 链于同一对应处或相邻处同时断裂
单链断裂 双链断裂
1、DNA链断裂的分子机制
（1）脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏 （直接） （2）碱基损伤
2、不同条件下辐射所致的 DNA链断裂
• 1）充氧溶液中 DNA双链上引起SSB的概率均等，产生与
（五） 诱变处理方法
单因素处理或多因素的复合处理： ①同一诱变剂的重复使用； ②两种或多种诱变剂的先后使用； ③两种或多种诱变剂的同时使用； ④紫外线光复活交替处理 ⑤诱变剂处理时间与诱变效应的关系
（六）影响突变率的因素 1、菌种遗传特性不同 2、菌体细胞壁结构不同 3、环境条件的影响 1）诱变前预培养 2）温度、pH、氧气等外界条件对诱变
微生物 诱变育种
紫外损伤的光复活作用
DNA损伤的修复
切补修复 切补修复是在内切核酸酶、
外切核酸酶、DNA聚合酶以及 连接酶的协同作用下将嘧啶 二聚体酶切除去，继而重新 合成一段正常的DNA链以填补 酶切所留下的缺口，使损伤 的DNA分子恢复正常的修复方 式。由于整个过程不依赖于 可见光，所以切补修复也称 暗修复。切补修复几乎存在 于所有的微生物中。
也可用长了菌落的平板直接照射。 一般照射剂量4~10万伦琴。
此外还能引起染色体畸变，即因 染色体断裂引起染色体的倒位、 缺损和重组等。但发生了染色体
断裂的细胞常常不稳定。
化学诱变因素
化学诱变剂用量很少，诱变时设
备简单，只要一般实验室的玻璃 器皿就行，所以其应用发展较快。
碱基类似物
碱基类似物是指与DNA结构中的四种碱基 A、T、G、C在化学结构上相似的一类物 质。如5-溴尿嘧啶（BU）和5-溴脱氧尿
紫外损伤的切补修复
紫外线照射的操作方法
在暗室中安装的15瓦紫外线灯管最 好装有稳压装置，以求剂量稳定。
处理时，可将5毫升菌悬液放在直径 5厘米的培养皿中，置磁力搅拌器上， 使培养皿底部离灯管30厘米左右， 培养皿底要放平，处理前应先开灯 20~30分钟预热稳定。照射时启动磁 力搅拌器，以求照射均匀。
诱变育种
第一节基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒 内）的遗传物质的分子结构或 数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基 因及新的表现型。狭义的突变 专指基因突变，也称点突变， 而广义的突变则包括基因突变 和染色体畸变。
突变的几率一般很低，约为106~10-9。
突变是工业微生物产生变种 的根源，是育种的基础，但 也是菌种发生退化的主要原 因。
第六章诱变育种
2. 出发菌株的选择
⑴ 选择纯种作为出发菌株 ⑵ 选择具备一定生产能力或某些特性的菌株为出发菌株
⑶ 选择出发菌株应考虑其稳定性
⑷ 选择连续诱变过的作为出发菌株 ① 选择在表型上有改变，并伴随产量有显著提高的菌株。
② 选择具有增变基因变异的菌株作为出发菌株。
⑸ 选择出发菌株的其他因素
如：产孢子较多、不产或少产色素、生活能力强、 生长速度快、周期短以及糖氮利用快、耐消泡、粘度小
酵母菌：106个/mL。
菌悬液制备方法 ⑴细 菌 预培养 同步化 经20-24h培养的斜面移接到盛有基本培养 基的摇瓶中35-37℃培养到对数期。 3-6℃培养1h 在同步化的菌液中加入一定浓度的Pu、Py 或酵母膏，继续培养20-60min，置于2℃下 保藏10min，离心洗涤，用预冷的缓冲液或 生理盐水制成悬液，加入玻璃珠振荡10min， 用无菌脱脂棉或滤膜过滤，调整浓度，备 用。
后培养的重要作用
后培养是指诱变后的菌悬液不直接涂平板分离，
而是立即转移到营养丰富的培养基中培养数代。目的：
①是诱变处理后发生的突变，通过DNA修复、繁殖，
才能形成一个稳定突变体；
②使各种表型都有充分表达的机会，避免表型延迟现 象。
2. 温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响
温度的影响： 随着菌种特性和诱变剂种类不同而异。化 学诱变因子的反应速度在一定范围内随着温度的提高而加 速。 pH效应： 化学诱变剂作用时，需要在最适的、稳定pH值 范围才表现出良好的诱变效应。某些诱变剂在不同pH值下 会形成不同分解产物，如亚硝基胍，在pH 6.0时可分解成 亚硝酸，在pH 8.0以上，会形成重氯甲烷，因而产生不同 的诱变效应。 供氧情况：一些辐射因子和紫外线的诱变效应与供氧有密 切的关系，如 x 射线辐射大肠杆菌时，在相同剂量条件下， 供氧充足时，与 DNA 作用剧烈，损伤力大，反之则损伤小。
微生物育种――诱变育种
微生物育种――诱变育种微生物育种――诱变育种摘要分析了近几年国内外对微生物诱变育种领域的研究新进展，对生物学效应及诱变微生物机理进行总结。
从物理诱变、化学诱变方面的诱变效应和作用机制及育种在酶制剂、抗生素、氨基酸、维生素及杀虫剂等高产菌种选育中的应用；对该技术与空间技术的结合在微生物菌种选育中的应用前景进行了分析。
关键词诱变微生物育种展望诱变育种是通过诱变剂的处理提高菌种突变的几率，从中筛选出具有优良特性的变异菌株，也是通过诱发基因突变为手段的微生物育种技术。
1927年发现X射线具有增加突变率的效应；1944年发现氮芥子气的诱变效应；其后，人们陆续发现了许多物理的和化学诱变因素。
诱变育种其操作简便，突变率高，突变谱也广，不仅提高产量，改良质量还可以扩大产品的品种和简化工艺条件，随着新的诱变因子不断发现和筛选体系进一步的完善，微生物的诱变育种有了开展。
一、诱变方法物理诱变1、紫外照射：是诱发微生物突变的常用的非常有用的物理诱变方法之一，紫外辐射的作用有许多解释，比拟确定的作用是能够使DNA 分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基也碱基之间正常配对。
2、电离辐射：是电离生物学上有高能量的产生电离作用，应用最广泛的电离射线之一，可直接或间接的变化DNA 结构。
直接效应可以氧化脱氧核糖的碱基，间接效应是使水或有机分子产生自由基。
3、激光：是一种光量子流，能量密度高、靶点小而且单色性与方向性都好的光微粒。
这种辐射通过产生光、热等效应的综合应用，直接、间接影响有机体，从而引起细胞染色体畸变效应和酶的激活与钝化。
4、微波：是一种有较强生物效应的低能电磁辐射，对生物体有热效应或非热效应。
热效应指它能引起生物体局部温度上升，非热效应是在其作用下，生物体产生非温度关系的各种反响。
所以，微波也被用作多个领域的诱变育种。
化学诱变1、烷化剂：诱发突变中一类相当有效的化学诱变剂，引起DNA 复制碱基配对的转换而遗传变异。
常用的烷化剂都有甲基磺酸乙酯、亚硝基胍或硫酸二乙酯等。
微生物诱变育种的方法
微生物诱变育种的方法微生物，这小小的生物世界里的居民，有着大大的能量。
而诱变育种呢，就像是给微生物来一场奇妙的变身之旅。
物理诱变是一种常见的法子。
紫外线就像是微生物世界的严厉教官。
微生物们在紫外线的照射下，就如同小士兵接受艰苦的训练。
紫外线那强烈的能量，会打乱微生物内部的基因结构。
比如说一些细菌，原本规规矩矩地按照自己的基因蓝图进行生长繁殖，紫外线一照，就像打乱了建筑图纸一样，基因里的一些部分发生了错乱。
有的微生物在这错乱中就产生了新的特性，也许原本不会产生某种特殊酶的，经过紫外线照射后就有了这种能力。
还有X射线，这可是更厉害的家伙。
如果把微生物比作是一个精密的小机器，X射线就像一把强力的干扰器。
它能深深钻进微生物的内部，对基因进行破坏和重组。
就像把小机器里的一些零件拆下来又重新组装，只不过这里是在基因层面。
有的微生物经X射线诱变后，抗逆性变强了。
原本在稍微恶劣一点的环境里就奄奄一息的，现在能坚强地活下去，而且还活得挺好。
化学诱变也不甘示弱。
化学诱变剂就像是给微生物的基因施魔法的小巫师。
像亚硝酸，它悄悄地接近微生物的基因，把基因里的一些碱基偷偷换掉。
这就好比在密码锁上换了几个密码数字，整个密码锁的开锁方式就可能完全变了。
微生物的基因表达也就随之改变。
一些霉菌经过亚硝酸诱变后，产孢子的能力可能大大增强，原本产一点点孢子的，现在像开了挂一样大量产孢子。
再说说碱基类似物，它们是伪装高手。
它们混入微生物的基因大厦里，伪装成正常的碱基。
可是一旦到了基因复制的时候，就开始捣乱了。
就像一个假零件混进了真零件堆里，在机器组装的时候就会出问题。
这种捣乱会导致基因复制出错，从而产生突变。
有的酵母菌经过碱基类似物的诱变后，发酵能力变得超强，能产生更多的酒精或者其他有用的代谢产物。
复合诱变就像是给微生物来一套组合拳。
先给微生物来点物理诱变，就像先给它一个下马威，打乱它的基因阵脚。
然后再用化学诱变，进一步在混乱的基因里搞点新花样。
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4、紫外线光复活交替处理 经紫外线照射后的菌体或菌悬液，暴露在日 光中一定时间，接着用剂量更大的紫外线继续 照射，然后再让其光照复活，经多次紫外线照 射和光照复活交替，可以增加变异率，提高变 异幅度。
5、诱变剂处理时间与诱变效应的关系
在头孢菌素C产生菌选育中用甲基磺酸乙 酯低浓度、长时间处理与高浓度、短时间处理 的诱变效应是不同的，在致死率大致相同的情 况下，前者比后者不仅正突变率高，而且提高 的幅度也大。
六、摇瓶数据的调整和有观菌株 特性的观察分析
对摇瓶发酵液的测试数据要尽量应用生物学 统计方法来处理，以便从复杂的差异中，去伪 存直，由比及彼，抓住本质，找出其中真正的 规律性。
七、培养基和培养条件的调整
培养基和培养条件的调整，常采用正 交法和二次旋转均匀设计。
八、变种的特性研究与鉴定
要研究菌种的纯度、遗传稳定性、菌落类 型、群体的形态、生活能力、产孢子多少，保 藏培养基及保藏方法、菌种碳、氮源利用情况、 菌丝生长速度、菌丝量、发酵液粘度、过滤难 易状况；注意考察菌种抗生素的组分变化，色 素等质量问题；研究最适移种期、移种量、通 气搅拌、温度、pH等。 优良菌株选育后，还应该从分子水平 进一步对变株的生理生化特性加以鉴定以全面 了解菌株各种属性．这是考核菌株突变的重要 指标，也是为菌株迸一步的研究和应用提供有 指导意义的参考数据。
四、摇瓶液体培养
常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培 养，而平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后， 弃去大量低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜 面，然后再迸行摇瓶液体培养；才艳逐步地筛 选出高产菌株。
五、产物活性测定
1、琼脂平板活性圈法 2、滤纸片法 3、琼脂薄层纸片法 筛选菌种为一种重复性和计量性的工作， 所以必须应用统什方法。区别并肯定其产量上 的差异。以便迸行下轮育种的评估。
诱变育种的步骤和方法包括： 出发菌株的选择； 单孢子（或单细胞）菌悬液的制备； 诱变剂及诱变剂量的选择； 诱变的处理方法； 以及菌种的纯化分离等。
一、出发菌株
1、对一般出发菌株的要求 2、选择具有一定生产能力或某种特牲的菌株作为 出发菌株 3、选择纯种作出发菌株 诱变中要选用单倍体、单核或少核的细胞为出 发菌株。
4、选择出发菌株应考虑其稳定性 5、连续诱变育种如何选择出发菌株 “增变菌株” -缺乏DNA修复机制 6、选择出发菌株的其他因素 7、采用多出发菌株 8、菌种代谢特点
二、出发菌株的纯化
纯种分离方法: 常用划线分离法和稀释分离法。 显微镜操纵器分离单孢子
三、单孢子（或单细胞）悬液的制备
1、供试菌株的孢子或菌株要年轻、健壮。
一、诱变前对出发菌株的了解
1、区分不同菌落类型 一般情况下在同一种培养基和培养条件下往往会 出现多种形态类型的菌落（约有2～5种），不同类 型的菌落其代谢产物的生产能力有较大的差异。 2、出现不同菌落的原因 遗传因素决定； 常因为培养基组成或培养条件等的改变，引起菌 落形态的变化 。
二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关 系 1、考查菌种的生活史，了解它们的形态、 生理，生化等生物学特性，以及这些特性 与代谢产物合成的关系。 2、菌种的某些生物学特性与产量合成的相 关性 。
3、制备原主质体作为诱变材料
（1）在丝状真菌中 （2）细胞具有细胞壁
（3）不产生孢子丝状菌
四、诱变剂及诱变剂量
（一）诱变剂种类的选择
实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都 是有效的。一种诱变剂对A菌株有较高的诱变效应； 对B菌株则可能相反。不同微生物对同一种诱变剂 敏感性有很大区别。
1、选择诱变剂 选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱 变剂。
2、温度、pH值、氧气等外界条件对诱变效应的 影响 3、பைடு நூலகம்皿密度效应
第三节
突变株的分离与筛选
对抗性突变株或营养缺陷突变株， 常常用选择性培养基进行筛选。 对产量突变来说，由于高产菌株 和负变菌菌株都能在同一个培养基上生 长，难以采用选择性培养法进行筛选。
筛选突变株，首先根据筛选目的进行。 由于微生物正突变概率极小，仅0.05 ％～0.2%，产量提高10％以上突变株也 只有1/300，所以挑选的菌落愈多，概率 就愈高。
处理具体方法 1、直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处理， 然后分离，直接处理是最常用的方式。 2、生长过程处理，适用于诱变作用强的而杀菌率较 低的诱变剂，或在分裂过程中只对DNA起作用的诱 变剂，如NTG、秋本仙碱等。
六、影响突变体的因素
（一）菌种遗传特性不同 （二）菌体细胞壁结构
丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗 人细胞，减弱与DNA的作用。一般加大诱变剂量， 效果会好一些。有的微生物细胞壁含有蜡质，常 用一定浓度的洗衣粉、脂肪酶处理，除去蜡质， 提高诱变效果。
诱变育种工作包括诱发突变、突变株的筛选和高 产突变株最佳环境条件的调整。
诱发突变包括出发菌株、诱变剂及其剂量的选 择、影响诱变效果的因素。 突变株的筛选包括筛选培养基和培养条件及选 择一个简便、快速、有效的筛选方法。 环境条件调整是突变株的最佳培养条件改变。
具体要选育怎样的菌种，在诱变育种前， 应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和 全面的了解。 诱变育种工作量大，周期长，对一般周期 为7-10d的抗生素菌种来说，一代诱变需2-3个 月。
复合因子处理是指两种以上诱变因子共同诱发菌 体突变。 又可以分为以下处理方式： 1、两种以上因子同时处理 2、不同诱变剂交替处理 通常以化学因子和物理因子交替进行效果较 好。
3、同一种诱变剂连续重复使用
经过一种诱变剂处理后的菌悬液，培养数小时 之后（细菌或酵母），使细胞分裂1-2代，接着再 处理，有时还可反复多次，最后进行分离筛选。 诱发能力强的、对基因作用较为广谱的诱变剂可 连续重复使用，有益于变异乎的提高。但是单因 子连续使用代数不能过多，否则也会出现“钝化” 现象。
设计或采用高效筛选方案或方法 第一轮
诱变剂 一个出 发菌株 处理 第二轮
选出200个单 孢子菌菌株
选出5 株 选出50株 （每株1瓶） （每株4瓶）
初筛
复筛
五个出发菌株 诱变剂 处 理
40株 初筛 复筛 40株 选出50株 选出5 株 40株 （每株1瓶） （每株4瓶） 40株
三、分离和筛选
多级水平筛选中经过平板筛选。留取 5-10%，约挑选200株；第二阶段是摇瓶 初筛，选取25 ％-30％，第三阶段摇瓶 复筛，选出1-3株高产变株。有条件再进 行小型发酵罐试验。
一、诱变育种的基本环节
出发菌株
诱 大多死亡 变
多数未变 少数存活 少数突变 多数负变 多数幅度小 少数正变 少数幅度大 少数适宜投产 存活率 突变率 正变率 高产率 投产率 多数不宜投产
二、筛选的程序
1、常规筛选程序 这是传统选育中常用的方注，挑选的菌落 直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。 2、简便法筛选程序 在常规筛选法甚础上进一步改进：一方面 分离在平皿上的菌落采用琼脂块法，每代诱变处理 后打1000—3000块琼脂菌落，甚至更多、另一方面， 初筛摇瓶发酵液中产物分析，采用简便、快速的琼 脂平板测定祛或其他简便方法。
目的： 1、提高有效产物的产量 2、改善菌种特性、提高产品质量 3、简化工艺条件 4、开发新品种
第一节 诱变育种的试验设计和准备 工作
变异对微生物本身来说使其代谢向着异常 方向发展，必然引起菌体基本代谢失调，此时 菌体虽然具有生活能力，但细胞的某些功能却 显著地降低了。 高产突变型是一种数量性状的遗传变异， 是由多基因决定的。结构基因、调节基因、渗 透基因、辅助基因等，这些基因不可能通过一 次诱变全部引起突变。
三、了解影响菌种生长发育的主要因素 1、培养基 2、培养基斜面制备技术 3、移种的密度 4、温度 5、湿度 6、药品和原材料质量
四、了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合 成过程中与培养条件的关系。 五、建立一个准确、简便、快速检测产物的方 法 六、研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件
第二节
诱变育种的步骤与方法
第六章 工业微生物诱变育种
微生物的诱变育种是以人工诱变手段诱 发微生物基因突变，改变遗传结构和功能， 通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出 产量高、性状优良的突变株，并且找出发 挥这个突变株最佳培养基和培养条件，使 其在最适的环境条件下合成有效产物。
工业微生物育种过程分为三个阶段: 1、菌种基因型改变； 2、筛选菌种，确认并分离出具有目的基因 型或表型的变异株； 3、产量评估，全面考察此变异株在工业化 生产上的接受性。
• 2．采用定向控制的理性筛选—抗阻遏和解除反馈 抑制筛选模型 • 脂肪酶和其他水解酶类同样受终点产物或分解代谢 产物阻遏的调节，琥珀酸钠是脂肪酶的产物类似物， 是该酶合成的阻遏物结构类似物，因此．可以用琥 珀酸钠来筛选抗阻遏突变株。筛选高渗透性菌株以 解除胞内产物反馈抑制作用，达到提高酶产量的目 的。 • 制霉菌素能抑制真菌细胞膜麦角固醇的合成，引起 胞膜透性的改变，可以用它师选高渗透型突变株。 将琥珀酸钠和制霉菌素分别以一定浓度加人到分离 平板、有抗性的菌落陆续长出，这样大幅度的浓缩 了所需要筛选的菌株，加速育种的进度,从75U/ml逐 步提高到7800U/m。
（一）随机筛选 也称摇瓶筛选。主要是随机挑选的平皿菌落 进行摇瓶筛选。初筛挑选菌落起码要200个。 （二）平板菌落预筛 1、根据形态筛选变株 2、根据平皿生化反应筛选突变株 透明圈、显色圈、抑制圈及混浊圈等生化反应来筛 选。 3、采用冷敏感菌筛选抗生素突变株 4、浓度梯度法 5、应用复印技术快速筛选突变体 6、琼脂块法筛选变株
五、诱变剂的处理方式
可分为单因子处理和复合因子处理。
单因子处理，是采用单一诱变剂处理，一般认为单 因子不如复合因子处理效果好，这己经被很多事实 所证实。 但当一种诱变剂对某个菌株确实是有效的诱变 因子，那么单因子处理同样能够引起基因突变，效 果也不错．单一诱变剂处理，还可以减少菌种遗传 背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工 作趋向简单化。当然单因子处理，一般情况突变率 比复合因子要低，而且突变类型也比较少。