产品应用(1)-利用Paradigm多功能检测平台同时进行细胞凋亡和细胞坏死筛选工作(Molecular Devices)
细胞凋亡、坏死、细胞活性检查常见方式及试剂
线粒体膜电位指示染料线粒体膜电位的下降是细胞凋亡初期的一个标志性事件. 它在凋亡进程中与caspase 活化同时发生并先于磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻。
基于以上研究，Biotium 研发了各类的新型的荧光探针用于测量线粒体膜电位。
MitoView ™ 633MitoView ™ 633 是一种新型的用于测量线粒体膜电位的深红染料(激发光/发射光622/648 nm)。
利用NucView ™ 488 和MitoView ™ 633 凋亡检测试剂盒能够在荧光显微镜(图.1)或流式细胞仪(图.2、3)下同时进行线粒体膜电位和caspase-3活性的检测。
图 1. 利用MitoView ™ 633进行活细胞染色:Hela 细胞图 2. 流式细胞仪分析：Jurkat 细胞一组用CCCP 使线粒体去极化，另一组利用staurosporine 作为凋亡诱导剂。
利用MitoView ™633 染色图3. 流式细胞仪分析：对照（A）与经staurosporine 处置(B)的Jurkat 细胞（JC-1 染色）. FL1 (x- 轴) 为绿色荧光; FL2 (y-轴) 为红色荧光。
(A 图) 较高的红绿荧光比例说明线粒体膜电位未下降. （B 图）较低的红绿荧光比例说明：由于staurosporine诱导了凋亡的发生，细胞的线粒体膜电位大幅下降。
JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒JC-1通常被用于检测细胞中线粒体膜电位的转变。
在健康细胞中,JC-1以聚合体(J-aggregates)，的形式存在在线粒体基质中，能够产生红色的荧光(激发光/发射光585/590nm)。
相反，在正在凋亡或坏死的细胞中，JC-1不能聚集在基质中，以单体的形式存在，从而发出绿色的荧光( 激发光/ 发射光510/527nm)，如此能够利用流式细胞仪和荧光显微镜、荧光计数仪通过测量荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的转变。
经常使用红绿荧光的相对照例来衡量线粒体去极化的比例。
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7
利用ChIPseq双荧光素酶报告基因技术验证PPAR2的靶向基因MYH7一、本文概述本文旨在利用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和双荧光素酶报告基因技术（Dual-Luciferase Reporter Assay）来验证过氧化物酶体增殖物激活受体2（PPAR2）是否直接靶向调控肌球蛋白重链7（MYH7）基因。
PPAR2作为一种核受体，在多种生物学过程中发挥着关键作用，包括脂肪代谢、炎症反应和细胞分化等。
MYH7，作为肌球蛋白家族的一员，主要参与肌肉收缩和细胞骨架组成，其表达调控对于肌肉发育和功能至关重要。
因此，探究PPAR2是否通过直接结合MYH7基因启动子区域来调控其表达，对于理解PPAR2在肌肉生物学中的作用具有重要意义。
本文首先利用ChIP-seq技术，通过高通量的方法寻找PPAR2在体内结合的DNA序列，从而确定MYH7基因是否为其潜在的靶向基因。
在此基础上，通过构建包含MYH7基因启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒，利用荧光素酶活性的变化来反映PPAR2对MYH7启动子的转录激活作用。
这种方法结合了染色质免疫沉淀的高特异性和荧光素酶报告基因技术的高灵敏度，为验证PPAR2对MYH7的靶向调控提供了强有力的实验手段。
通过本文的研究，我们期望能够明确PPAR2是否直接调控MYH7基因的表达，揭示这一调控过程的具体分子机制，并为进一步理解PPAR2在肌肉生物学中的功能提供新的线索。
二、材料与方法1 细胞系：使用人源细胞系，例如HEK293T细胞，用于后续的ChIP-seq和双荧光素酶报告基因实验。
2 ChIP-seq试剂：染色质免疫沉淀（ChIP）试剂盒、蛋白酶抑制剂、DNA纯化试剂盒、DNA片段化酶、测序引物等。
3 双荧光素酶报告基因系统：包含PPAR2反应元件（PPRE）的荧光素酶报告质粒，以及用于转染细胞的荧光素酶底物。
4 PPAR2特异性抗体：用于ChIP实验的PPAR2转录因子特异性抗体。
碧云天细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)说明书
细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)产品简介：碧云天生产的细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC ，是一种使用丹酰尸胺，也称单丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作为荧光探针快速便捷地检测细胞自噬的试剂盒。
自噬(autophagy)是一种在进化上高度保守的通过溶酶体吞噬并降解部分自身组分的细胞内分解代谢途径。
自噬与多种生理功能有关，在饥饿等环境条件下，细胞通过自噬降解多余或异常的细胞内组分，为细胞的生存提供能量及原材料，促进生物体的生长发育、细胞分化及对环境变化产生应答。
自噬异常与多种病理过程如肿瘤、神经退行性疾病、代谢疾病、病原体感染等都有密切关系。
由于细胞自噬在生理和病理过程中都有重要作用，自噬已经成为细胞生物学领域的一个研究热点。
MDC 是细胞自噬检测最常用的荧光探针之一。
MDC 可以通过离子捕获(ion trapping)和与膜脂的特异性结合，从而特异性标记自噬体(autophagosome)，也称autophagic vacuole ，因而常用于细胞自噬的检测。
MDC 是一种嗜酸性荧光探针，很多酸性膜性结构也会被MDC 染色，因此MDC 染色时正常的细胞也会有一定的染色背景。
本产品的染色原理决定了本产品只能用于培养的细胞或者组织的细胞自噬荧光染色检测，不能用于冻存的或固定的细胞、组织或者组织切片的染色检测。
使用本产品染色后可以通过荧光显微镜拍照观察，也可以通过荧光酶标仪或流式细胞仪进行荧光检测。
荧光显微镜观察时可以使用紫外区激发光激发，发出绿色荧光。
荧光酶标仪或流式细胞仪推荐的激发波长为335nm (330-360nm 均可)，发射波长为512nm (510-540nm 均可)。
本产品用于细胞自噬染色的效果参考图1。
图1. 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)的染色效果图。
高通量药物筛选利器——HTRF,在激酶研究(kinase)中的应用
通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是 不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系 元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子内非放射过程转移到 镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并 转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长寿命的荧光。
为了能够成功应用于生物学检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定 性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应 时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可 竞争螯合物活性基团，当与 FRET 技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素 与穴状化合物结合，许多限制因素都可去除。
一般地，在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短。传统 FRET 技术的限制因素是由背景荧光引起的，其来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、 化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实 验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂（寿命为纳秒级），可以利用时间 分辨荧光方法将其去除。
图 2 ：试剂盒包装
产品特点 应用单克隆抗体保证批次的一致性 在 100 多种丝氨酸/苏氨酸激酶和 60 多种酪氨酸激酶上验证过 酶用量很少 ATP 浓度没有限制，因此可以用 ATP Km 进行筛选药物 每一个底物只有一个位点可以被磷酸化 针对酪氨酸激酶有特殊的试剂可以增强底物的稳定性 整个实验少于 2 小时 反应体系可以减少到 4ul
仪器原理
双通道PAM-100测量系统商品编码：9027500000 品牌：WALZ 型号：DUAL-PAM-100原理：利用荧光发射器发射出来的光学射线来检测植物叶片细胞内叶绿体中的荧光。
功能：单独或同步测量微藻、大藻、水生植物等的叶绿素荧光和P700。
检测对象：微藻、大藻、水生植物。
详细原理：细胞内的叶绿素分子通过直接吸收光量子或间接通过捕光色素吸收光量子得到能量后，从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。
处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，在几百飞秒内，通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态。
最低激发态的叶绿素分子可以稳定存在几纳秒，重新放出一个光子，回到基态，即产生荧光，是处于较低激发态的叶绿素分子释放能量回到稳定基态的几种途径之一。
色素分子处于氧化态和还原态时，或增加/减少亚基后，其吸收峰也会有变化。
双通道PAM-100测量系统采用独特的调制技术，检测来自于植物叶片细胞内叶绿体中的光合系统复合蛋白体的叶绿素荧光，通过测量活体叶片的叶绿素荧光和P700吸收变化来全面研究植物两个光系统（PS I和PS II）的活性变化对光合作用的影响。
双通道PAM-100测量系统相当于两台脉冲-振幅-调制叶绿素荧光仪，通过远红光LED发出的远红光来激发PS I在较短的时间内到达最高氧化态，从而测得PS I 的最大能力，通过荧光发射器来发射光照强度很低的光能，进而检测初始叶绿素荧光及其他时期的荧光，蓝色LED主要提供波峰在蓝光光区的光源，很多藻类对光能的吸收利用主要在蓝光光谱区。
双通道PAM-100测量系统既可以进行复杂的叶绿素荧光分析（PS II活性），还可以通过测量P700的吸收变化来检测PS I的活性，可用于光合作用机理研究、植物生理学、农学、林学、园艺学等领域。
全自动氨基酸分析仪商品编码：9027201900 品牌：SYKAM 型号：S-433D原理：氨基酸与分离柱上的物质进行离子交换分离，与茚三酮反应后产生不同的检测信号，进而对氨基酸进行定性定量分析。
pEASYT1载体
pEASY®-T1 Cloning Kit目录号：CT101试剂盒组成1.pEASY- T1 Cloning Vector (10 ng/μl)2.Control Template (5ng/μl), Control Primers (10 μM),3.M13F (10 μM)，M13R (10 μM)4.Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell.保存Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent cell 可于–70℃保存至少六个月, 其他组分-20℃保存至少六个月。
产品说明pEASY- T1 Cloning Kits适用于TA克隆.-快速克隆基因，仅需要5分钟反应时间。
-提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记。
-对照插入片段克隆效率可达95% 以上。
-包含LacZ 基因，在含有IPTG，X-gal 的平板培养基上，可进行蓝白斑筛选。
工作原理pEASY- T1 Cloning Kits 以线性的形式提供:-3′端悬垂胸腺嘧啶(T)可用于TA克隆-拓扑异构酶与载体相互偶联（活化载体）Taq DNA聚合酶具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可在新合成双链产物的3’端加上一个碱基。
尽管4种碱基均可被聚合到3’端，但Taq酶对dATP的聚合能力远高于其他3种dNTP.所以，在标准PCR条件下，PCR产物3’端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A。
pEASY- T1 Cloning Kits在3’端提供一个悬垂的T碱基，这样的结构使PCR片段可以高效的和载体进行连接。
牛痘拓扑异构酶I型可以与DNA 双链的特定位置结合并切割特异位点5’-(C/T)CCTT-3’, 与3‘T的磷酸基团性成共价键，并切断其中一条DNA链，使DNA解链。
磷酸二酯键断裂释放的能量储存于3’磷酸与拓扑异构酶氨基酸残基（Tyr-274）形成的共价键中。
贝克曼生化 CX5PRO产品介绍
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微量试管和样本杯同样本试管一同放入样本架上 将样本架直接放进SPINCHRONTM DLX 离心机里 离心后，将样本架直接放在分析仪上 具备样本条码扫描功能，减少劳动力及人为错误
带条码的试剂盒
• 三个联体独立的试剂仓，使在机试剂稳定性最 大化，并使操作更简便 • 自动跟踪在机试剂的总量，条码试剂显示:
– – – – 批号和序列号 失效日期 校准频率 试剂盒内测试量
• 试剂盒存储于4℃冷藏室内
液体ห้องสมุดไป่ตู้试剂、校准品和质控品 液体的试剂、
• 试剂、校准品和质控品均为液体，开瓶即用， 免除复溶步骤及由于复溶的等待时间
干式免维护的孵育系统
• 以紫铜为介质的接触型干式保温系统 • 相面接触的保温环套环绕比色杯，控温精确， 减少光散射，信号衰减少，确保结果的准确性 • 消除普通空气浴系统的温度的波动 • 免除水浴系统的日常维护
增加不确定性 增加不确定性
二级校准品
贝克曼库尔特 工作校准品 贝克曼库尔特 产品校准品
MFR 厂商） （厂商）
用户常规样本
用户常规方法
测定结果
LAB （实验 室）
总 结
• 悠久的专业历史背景 历史背景 • 行业领先的全球性的检验专业品牌 专业品牌 • 技术先进，性能 性能卓越 技术 性能
– 准确度：系统化、标准化、结果可溯源的检测系统；先进而独特的技术 准确度： 和功能（血清外观检测功能；凝块检测与自动重检功能；多波长同时检 测技术等），保证了检验质量 – 高效率：两大分析技术的应用（光谱分析和离子选择性电极）；标配样 高效率： 本及试剂条码阅读器；可离心的样本架；可以不停机连续装载样本，并 可以在运行中装载试剂；样本预稀释功能；超范重检功能；自待机（ STANDBY）到运行（加试剂或样本）仅需2分多钟；在1分钟内处理5项 电解质项目；24小时不停机运行，满足临床常规和急诊的需要，真正实 现一机多用；半导体接触式传导恒温系统，免除日常维护保养；远程通 讯功能 – 低成本：长寿命的光源（闪烁式氙灯）；永久性的石英反应比色杯；高 低成本： 质量的电极和试剂；最少的用水量（每小时用水量小于7.0升），使耗材 更少，使用成本更低
MD酶标仪介绍
卡盒 – “系统的心脏”
“plug-n-screen”
(1) 用户配置组合
用户可根据需要购买和安装卡盒
(2) 双PMTs
适用于有双发射波长分析实验
(3) LEDs 荧光激发
同一块板实时调节强度以适合不同浓度而达到 最大动态检测范围
• 手动或自动调节获取最佳信号 • 唯一底部Z轴高度聚焦酶标仪 – 增强灵敏度 • 振荡功能提供均相检测 • 3 种速度等级，圆周或线性振荡方式 • 温度控制 环境 (+2 ℃) to 45 ℃ – 细胞应用分析理想选择 • CO2 浓度环境应用于细胞分析
提高检测速度同时不牺牲数据质量?
• 高速检测模式 (“On-the-fly”) - 提高 速度同时保证数据质量
(4) 底部直接激发
底部激发同时聚焦以达最大动态范围
(5) 近距信号收集
针对化学发光和AlphaScreen的专有检测读头 以近距接近微孔板而达到最大信号和最小的邻 孔干扰
卡盒技术
检测卡盒包含:
1. 最佳的光源 2. 特殊的电子检测元件 3. 染料特异性光学元件
• 激发滤光片 • 发射滤光片 • 二色镜 • 偏振片 • 光栅 (ABS)
每个卡盒就是一台单独的酶标仪!
优化的滤光片 & 光源组合达到灵敏度和速度相结合 检测信号产生的位置 预储存的应用程序 单功能和多功能卡盒可选
用户自升级!
只需点击 硬件、预存指令 & 软件升级 “plug-n-screen”
未来无限扩展!
扩展所需要的功能
重要特点
• 高速飞行检测模式 (“On-the-fly”) 保证速度但不牺牲性能 • 1, 6, 12, 24, 48, 96, 384 1536, 3456 微孔板格式 • 微孔板高度探测 – 更佳的信号 & 减少干扰 • Z 轴高度自动调整（顶部阅读和底部阅读）
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利用SpectraMax Paradigm 多功能检测平台同时进行细胞凋亡和细
胞坏死的筛选工作
简介：
细胞凋亡和细胞坏死的本质均为细胞死亡，但我们可以通过其发生机制和病理形态学方面所表现出的特征加以区别。
细胞凋亡指的是细胞程序性的死亡，不会发生细胞膜损伤，细胞坏死则被认为是因病理而产生的被动死亡，会伴随发生细胞膜损伤，导致细胞质因子的释放并引起炎症反应。
进行抗肿瘤药物筛选过程中，区分引起的是细胞调亡和细胞坏死变得非常重要，因为后者的主要副作用是引起细胞的炎症反应。
这里我们介绍了利用SeptraMax Paradigm（Molecular Devices）和Vybrant 凋亡检测试剂盒（Invitrogen）进行这方面的研究。
试验描述：
Vybrant细胞凋亡检测试剂盒是基于Annexin V 和Sytox Green两种标记物的基础上开发出的，可以快速和简便的区分肿瘤细胞的凋亡和坏死情况，Anne xin V一种人类血管抗凝剂，标记有藻红蛋白（R-PE）后通常用来检测凋亡细胞的发生，其工作原理是正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双分子层的内侧，当细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，A nnexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸具有高度的亲和力。
相反，Syt ox Green染料不能渗透进入活细胞和凋亡细胞，但可以进入坏死细胞并对其细胞核进行染色，发出很强的绿色荧光。
我们提前将肿瘤细胞种在384孔板中，然后分别使用肿瘤坏死因子（TNF）和更生霉素（Actinomycin-D）来诱导细胞凋亡，使用聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)诱导细胞坏死。
此外，我们可通过检测细胞组织表达的不同物质其抗肿瘤特性和分化特性来区分细胞凋亡和细胞坏死。
使用不同的检测方法来检测肿瘤细胞的凋亡及坏死
SpectraMax Paradigm是美国Molecular Devices公司推出的一种全新概念的多功能检测平台（如图一）。
它将光源系统和检测系统独立分开，多套检测器同时固定在主机上，针对不同实验要求选用不同的卡盒，每一种卡盒其实就是独立的光路系统，可以提高了检测针对性和灵敏性。
针对此试验特点，如仪器具有能够同时检测Annexin V和Sytox Green两种标记物发射荧光强度话可大大提高检测的效率（如图二），而Paradigm所具有的双通道检测器可同时工作，非常适合此类试验要求。
图一：SpectraMax Paradigm多功能检测平台
图二. 1:HepG2细胞提前24小时种在平底的384孔板中，这些孔中的一部分细胞未经任何处理，而另一部分细胞试验前18小时分别用TNF(25ng/ml)、Actinomycin-D（1ug/ml）和Triton X-100(0.1%)孵育，然后去除微孔板中培养基，将两种标记物分子溶解在缓冲液中，37度孵育20分钟。
染色后，分别使用SpectraMax Paradigm 多功能检测平台的single-point(1a)、on-the-fly(1b)和area-scan(1c)模式检测结果，每个柱高度代表着平均荧光强度值（RFU）和5个重复孔的标准偏差。
可以看出扫描孔内面积越大，得出结果就会更加的精确，尤其适合像肿瘤细胞的这种单层不均一类型细胞的检测试验。
结论
综上我们可以发现，SpectraMax Paradigm是基于细胞学应用的理想检测平台，如使用Vybrant细胞凋亡检测试剂盒所呈现的结果中发现，孔内细胞层的变化非常快速而且对整个试验结果的影响较大，Paradigm所具有的”On-the-fly”数据收集模式可以很好的解决此问题。
高速的双发射检测器可针对每个孔测量的多数据点画出线性图，从而得到一个更大测量区域的数值，将会得出更好的数据统计结果。
当使用“area scan”功能后可以进一步提高基于细胞学应用试验数据的质量。
此外，此款仪器所具有的双通道同时检测的功能可以大大缩短检测时间，提高工作的效率。
致谢
非常感谢奥地利克雷姆斯高等专业学院医药生物技术部门所提供的研究数据。