顶空气相色谱_质谱联用法分析粪便中挥发性脂肪酸_江振作

江振作1,2,3
2
王跃飞 * 1,2
1
陈荣荣1,2
朱 彦1,2
3
张 蕾1,2
刘 双1,2
刘海利3
（ 天津市现代中药重点实验室， 天津中医药大学， 天津 300193 ） （ 瀚盟生物技术（ 天津） 有限公司， 天津 300457 ）
（ 中药新药研发中心， 天津国际生物医药联合研究院， 天津 300457 ） 摘 要
2013 11 07 收稿； 2013 12 02 接受 国家自然科学基金（ No. 81202877 ） 、 天津市滨海新区专业性科技服务业项 本文系重大新药创制科技重大专项（ No. 2012ZX09304007 ） 、 目（ No. 2012 XJR13006 ） 资助 * Email: wangyuefei_2006@
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分析化学
第 42 卷
～ 性强、 无紫外吸收和荧光基团， 故多采用 GC 法分析。目前， 挥发性脂肪酸多需进行衍生化处理 [12 14] ， 或 [15,16] 经过液液萃取法 处理后再进行 GC 分析， 存在操作繁琐、 萃取效率低、 操作时间长、 提取歧视效应、
重复性较差、 试剂毒性较大等不足。 因此， 需要建立一种简单、 快速检测粪便中挥发性脂肪酸的方法。 本研究建立了一种快速分析粪便中挥发性脂肪酸 （ Volatile fatty acids, VFAs ） 的顶空气相色谱质谱联用 GC/MS） 。 粪便样品用 6% H3 PO4 溶液混悬后即 法（ Headspace gas chromatography mass spectrometry, HS可分析， 无需进行复杂的前处理。 而 Gao 等 [12] 对粪便水溶液进行氯甲酸乙酯化处理后进行 GCMS 分 析， 采用两步衍生化向粪便水溶液中依次加入 L2 氯苯丙氨酸、 乙醇吡啶 （ 6∶ 1 ，V/V） 、 氯甲酸乙酯， 超 用 NaOH 溶液调节上清液至 pH 9 ～ 10 ， 再加入氯甲酸乙酯混合超 声 1 min 后加入正己烷萃取并离心， （ 甲硫基） 丙酸乙酯的正己烷终止反应， 声， 加入含 3 再进行分析； 又如贾益群等 [15] 在酸性条件下用乙醚 萃取粪便水溶液中， 首先用纯水溶解粪便， 离心过膜后， 取适量粪便水溶液加入 H2 SO4 溶液后再加入乙 醚， 振荡 30 次后离心 5 min， 置 4 ℃ 冰箱 30 min， 取上层乙醚溶液进行 GC 分析。 本方法与衍生化法或 液液萃取法相比， 操作简单、 处理时间短， 能最大限度的保留粪便中的挥发性成分， 不存在衍生化或提 减少处理过程中挥发性成分的损失 ， 所用试剂安全易得， 可用于人和大鼠粪便中挥发性 取的歧视效应， 。 脂肪酸的快速测定
2.2
标准溶液配制
准确称取适量上述 7 个对照品于 10 mL 容量瓶中， 以 6% H3 PO4 溶液定容， 制成每 1 mL 含乙酸 、 、 、 、 、 、 5.02 mg 丙酸 2.58 mg 异丁酸 4.53 mg 丁酸 4.72 mg 异戊酸 4.25 mg 己酸 4.25 mg 庚酸 5.97 mg 的混合 对照品溶液。 H3 PO4 溶液的配制： 精密移取 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 和 1.0 mL H3 PO4 ， 分别置于 10 mL 容量瓶中， 用超纯水 定容， 超声混匀， 得到 2% , 4% , 6% , 8% , 10% H3 PO4 溶液。 2.3 样品处理方法 收集人和 SD 大鼠的新鲜粪便置于具塞广口瓶中 ， 于!80 ℃ 冰箱保存备用。本研究采用的大鼠粪便 经动物中心负责人审批后收集； 研究用人粪便的收集经自愿者同意并签署了知情同意书 。 HSGC/MS 分析： 取!80 ℃ 冻存的人或 SD 大鼠粪便， 用研钵立即研碎并混匀， 精密称取 2.0 g， 置于 20 mL 顶空进样瓶中， 加入 6% H3 PO4 溶液 4 mL， 密封， 超声 1 min， 置于顶空进样器中。 粪便缓冲能力的测定： 精密称取 6 份研碎的大鼠粪便 0.5 g， 分别加入不同浓度的 H3 PO4 溶液1 mL， 超声 1 min 使混匀， 立即用精密 pH 试纸检测。 2.4 HSGC/MS 条件 2.4.1 2.4.2 顶空进样条件 顶空振荡室加热温度： 80 ℃ ； 加热时间： 30 min； 加热方式： 震荡加热； 1.0 mL 顶空 进样针温度： 80 ℃ ； 进样量： 1 mL， 不分流模式； 用高纯氩气推动和清洗顶空针； 清洗时间： 0.5 min。
第 42 卷 2014 年 3 月
分析化学 （ FENXI HUAXUE）
研究报告
第3 期 429 ～ 435
DOI： 10.3724/SP.J.1096.2014.31077
Chinese Journal of Analytical Chemistry
顶空气相色谱 质谱联用法分析粪便中挥发性脂肪酸
3
3.1
结果与讨论
样品处理方法优化
3.1.1 稀释液的选择 挥发性脂肪酸的极性较大、 在水中易发生电离， 在水溶液中以 HA （ 游离型 ） 和 ! A （ 离子型） 两种形式存在， 两者存在的量可以用分布系数 （ δ ） 表示， 由解离常数 Ka （ 或其负对数值 pKa ） 和溶液的 pH 决定。当用水作为稀释液时， 由于水的 pH （ ～ 6.5 ） 大于挥发性脂肪酸的 pKa 值 （ 如甲 酸 pKa = 3.74 ） ， 因此挥发性脂肪酸主要以 A ! 形式存在； 若直接用 HSGC/MS 检测， 由于 A ! 不易气化， 导致测定结果偏低， 甚至无法被检出； 当改用酸作为稀释液时， 由于溶液的 pH 值较低， 挥发性脂肪酸主 要以 HA 形式存在， 可以采用 HSGC/MS 进行准确分析。 考虑稀释液所用酸的挥发性及酸度对样品的 ， （ 影响 故采用非挥发性中强酸 H3 PO4 ） 作为酸性调节剂。 图 1 为加 H3 PO4 前后样品的总离子流图。 由 图 1 可知， 样品用 H3 PO4 稀释液处理后， 各挥发性脂肪酸的响应均明显提高 。
建立了一种快速分析粪便中挥发性脂肪酸（ Volatile fatty acids, VFAs ） 的顶空气相色谱质谱联用法
（ Headspace gas chromatographymass spectrometry, HSGC/MS） 。粪便样品用 6% H3 PO4 溶液按 1∶ 2 （ m/V） 混悬 后密封于顶空进样瓶中， 直接进行 HSGC/MS 检测。顶空振荡室加热温度为 80 ℃ ， 振荡加热时间 30 min， 顶 不分流进样 1 mL； 采用 DBFFAP 毛细管柱（ 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm） ， 进样口温度 空进样针温度为 80 ℃ ， 为 250 ℃ ， 升温程序（ 初始温度 50 ℃ 保持 1 min， 以 10 ℃ /min 升至 200 ℃ ） ， 载气（ 高纯氦） 流速为1.0 mL/min； 使用电子轰击（ Electron impact, EI） 离子源， 电子能量为!70 eV， 离子源温度为 250 ℃ ， 传输线温度为280 ℃ ， 电 全扫描模式， 扫描范围 m/z 33 ～ 200 。结果表明, 本方法能够应用于人及大鼠粪便中 子倍增器电压为 0.95 kV， 挥发性脂肪酸的分析， 通过 NIST 标准谱库检索， 采用对照品比对以及质谱数据解析的方法， 在人的粪便样品 中检测到 9 种挥发性脂肪酸： 乙酸、 丙酸、 异丁酸、 丁酸、 异戊酸、 戊酸、 异己酸、 己酸、 庚酸； 在大鼠粪便中检测 丙酸、 异丁酸、 丁酸、 异戊酸、 戊酸、 己酸、 庚酸。通过峰面积归一化法， 计算得到乙 到 8 种挥发性脂肪酸： 乙酸、 丙酸、 丁酸的相对百分含量约占挥发性脂肪酸总量的 85% 。本方法简单、 灵敏， 可用于人和大鼠粪便中挥 酸、 发性脂肪酸的快速检测 。 关键词 顶空气相色谱质谱联用法； 粪便； 肠道菌群； 挥发性脂肪酸
GC 条件 DBFFAP 色谱柱（ 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm） ； 升温程序： 初始温度 50 ℃ 保持 1 min， 以 10 ℃ /min 升至 200 ℃ ； 进样口温度： 250 ℃ ； 载气： 高纯氦（ He） ， 纯度 ＞ 99.999% ； 流速： 1.0 mL/min。 2.4.3 MS 条件 电离方式： EI； 电子能量： !70 eV； 离子源温度： 250 ℃ ； 传输线温度： 280 ℃ ； 电子倍 增器电压： 0.95 kV； 全扫描模式，扫描范围 m/z 33 ～ 200 。
[17 ～ 19] [12 ～ 16]
、 高效液相色
、 毛细管电泳法 （ Capillaryelectrophoresis, CE） [20] 谱法（ High performance liquid chromatography, HPLC） 和原子吸收分光光度法（ Atomic absorption spectrophotography, AAS） [21] 。由于挥发性脂肪酸极性大、 挥发
第3 期
江振作等： 顶空气相色谱质谱联用法分析粪便中挥发性脂肪酸
431
2.5

数据处理
样品中未知挥发性成分的定性分析 ： 通过计算机检索 NIST 标准质谱库得到化合物信息， 统计 R 和 F 匹配度（ 其中， R 匹配： 样品谱图与标准谱库检索得到结果的相似度； F 匹配： 标准谱库逆向检索得到 结果与样品谱图的相似度， 两者最大值均为 1000 ） 均大于 700 的挥发性成分。
2
2.1
实验部分
仪器、 材料与试剂 GC450 MS320 型气相色谱质谱联用仪（ 美国 Varian 公司） ， 配有 CombiPAL 顶空进样器， Varian MS Workstation 6.92 工作站； DBFFAP 毛细管柱（ 30 m × 0.25 mm × 0.25 μm， 美国 Agilent 公司） ； MilliQ超 纯水系统（ 美国 Millipore 公司） ； AL 204 万分之一天平（ 瑞士 METTLER TOLEDO 公司） ； SCIENTZ 25 12 超声仪（ 宁波新芝生物科技股份有限公司 ） ； pH 0.5 ～ 5.0 和 pH 5.5 ～ 9.0 精密试纸 （ 天津市塘沽区鹏达化 工厂） 。 乙酸、 丙 酸、 异 丁 酸、 丁 酸、 异 戊 酸、 己 酸、 庚 酸 对 照 品 （ 纯 度 ≥ 99% ， 美 国 Sigma 公 司 ） ； H3 PO4 （ ＞ 85% ，天津市光复精密化工研究所） 。