NGS测序技术与分析流程图
pcr-ngs原理
pcr-ngs原理
PCR-NGS (Polymerase Chain Reaction - Next Generation Sequencing) 是一种结合了PCR技术和高通量测序技术的方法，用于对DNA或RNA样本进行大规模测序。
PCR-NGS的主要步骤如下：
1. DNA扩增：首先，使用PCR技术对DNA样本进行扩增。
PCR使用DNA聚合酶，引物和dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）来选择性地扩增目标DNA序列。
PCR的扩增过程包括反复进
行变性（DNA双链解开），引物结合和扩增（DNA合成）。
2. DNA片段准备：扩增得到的DNA片段会被切割成短片段，通常长度为200-600碱基对。
这些片段之后会被连接到DNA
片段适配器上。
3. DNA库构建：将连接上适配器的DNA片段进行纯化和富集，以去除未连接的适配器和剩余的引物。
4. 测序：准备好的DNA库会被加载到测序平台上，如
Illumina或Ion Torrent等。
在测序过程中，DNA片段会通过序列化反应产生荧光信号，这些信号会被靶向测序仪器检测和记录。
5. 数据分析：测序仪器获得的原始序列数据将通过生物信息学分析进行处理，包括序列拼接、去除低质量碱基、去除适配器序列以及比对到参考基因组等步骤。
最后，通过与参考序列比
对，识别和注释样本中的基因变异。
PCR-NGS技术组合了PCR的高特异性和高敏感性以及NGS 的高通量测序能力，可以广泛应用于基因组学、转录组学、表观遗传学等领域的研究和疾病诊断中。
《NGS基础培训》课件
数据分析
对原始数据进行处理、分析和 解读，提取有用的信息。
样本准备
样本类型
根据研究目的和实验需 求选择合适的样本类型
，如血液、组织等。
样本采集
确保采集过程的无菌操 作，避免污染和交叉感
染。
样本保存
选择适当的保存方式， 确保样本在实验前后的
稳定性和一致性。
样本量
根据实验需求确定所需 的样本量，确保实验结 果的可靠性和可重复性
伦理问题
隐私权保护
NGS技术可能涉及个人基因信息，需 确保这些信息不被滥用或泄露。
基因歧视
防止基于基因信息的歧视，确保公平 对待。
临床试验和患者权益
确保临床试验的公正性和患者的知情 同意权。
基因编辑技术的伦理界限
关于基因编辑技术的使用范围和目的 ，应明确其伦理界限。
法律问题
知识产权保护
法律责任和赔偿
对基因的表达产物转录本进行注 释，包括转录本的序列、表达量
、变异等信息。
蛋白质注释
对蛋白质进行注释，包括蛋白质 的序列、结构、功能等信息。
变异检测
单核苷酸变异（SNV）
检测基因组中单个碱基的变异。
结构变异（SV）
检测基因组中的大片段结构变异，如拷贝数 变异、倒位、易位等。
插入和缺失（INDEL）
检测基因组中的片段插入和缺失。
。
数据质量控制
数据完整性
评估原始测序数据的完整性， 确保数据没有缺失或损坏。
数据准确性
对测序数据进行质量评估，确 保数据的准确性和可靠性。
数据重复性
评估测序数据的重复性，确保 数据的一致性和可重复性。
数据可比性
对不同样本或实验条件下的数 据进行可比性分析，确保数据
二代测序原理和流程
二代测序原理和流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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二代测序（Next-Generation Sequencing，NGS）是一种高通量测序技术，具有平行化、高效率、低成本的特点。
2015高通量测序培训课程-常见NGS方案实验流程及常见问题解析-讲义
8000rpm，30sec
离心力不可过大！
倒废液：倒前准备吸水纸；切勿伸入废液瓶；沾液时不同样 品管切勿使用同一位置。
×
√
洗涤
操作方法：
加入740ml PW溶液 8000rpm，30sec 倒废液（要求同前）
操作要求：
悬空滴加 尽量只使用1个枪头 枪头一旦触碰样本，立刻弃掉，严段化 STEP2 • 末端修复加dATP STEP3 • 连接测序接头 STEP4 • PCR扩增
DNA片段化
末端修复加 dATP
连接测序接 头
PCR扩增
打断方法
Covaris System (AFA)
Nebulizer
打断范围 100bp-500bp 400bp-800bp
Ta序
25℃ 30min 72℃ 20min
连接测序接 头
PCR扩增
DNA磷酸化 激酶
P P
磷酸化的目的 填补连接缺口，提高连接效率
DNA片段化
末端修复加 dATP
连接测序接 头
PCR扩增
Illumina 接头
P5 Index
Rd1 Seq Primer
T
Y型接头的目的 减少接头自连的可能性！
转录因子研究 ➢ RIP-Seq
NGS基本流程
ST4 •生物信息分析
样本前处理
样本前处理都做些什么？ 核酸提取（DNA/RNA)
样本类型有哪些？ 1. 人，动物的血液及器官组织等。 2. 植物（根茎叶，胚芽，种子等）。 3. 微生物（细菌，真菌）。
SDS
ProteinaseK
Tris-HCl (pH 8.0)：提供碱性反应条件，防止DNA酸解。 EDTA终(p浓H度8.0)：大分子10螯0m合M 二价阳离子5，0m抑M 制DNase加活样1性%本(w前。/v加) 入
二代测序分析流程
二代测序分析流程Next-generation sequencing (NGS) has revolutionized the field of genomics by allowing researchers to rapidly sequence large amounts of DNA and RNA. 二代测序（NGS）已经彻底改变了基因组学领域，使研究人员能够快速测序大量的DNA和RNA。
This technology has enabled the analysis of entire genomes, transcriptomes, and epigenomes, providing a wealth of data that can be used to study genetics, disease, and evolution. 这项技术使得对整个基因组、转录组和表观基因组的分析成为可能，为研究遗传学、疾病和进化提供了大量的数据。
One of the key challenges in NGS is the analysis of the data generated, which requires a complex and multi-step process to extract useful information. 二代测序面临的关键挑战之一是分析生成的数据，这需要复杂且多步骤的过程来提取有用的信息。
The NGS analysis pipeline typically involves several key steps, including quality control, read mapping, variant calling, and downstream analysis. 二代测序分析流程通常包括几个关键步骤，包括质量控制、读片段比对、变异检测和下游分析。
NGS基础培训课件
生物信息分析问题
总结词
生物信息分析是ngs数据分析的核心步骤，但也存在一些问题。
详细描述
生物信息分析主要包括数据预处理、比对、变异检测和注释等方面。数据预处理主要包括质量控制、降噪和过 滤等步骤；比对主要包括与参考基因组进行比对和可视化等步骤；变异检测主要包括单核苷酸变异、插入缺失 和结构变异等检测；注释主要包括基因和通路富集分析、疾病关联分析和突变类型分析等步骤。
建库原理
核酸提取
核酸提取的目的是富集目标序列，去除其他杂质。
末端修饰
在建库过程中，需要将DNA或RNA某种方法将中的序列进行富集和去除不需要的序列。
03
ngs数据分析流程
下一代测序技术是继第一代测序技术Sanger后，发展起来的 高通量测序技术，能够一次处理大量序列信息。
测序流程
下一代测序的流程主要包括样本准备、构建、测序反应 、数据分析等环节。
测序原理
链终止法
链终止法是利用核苷酸特异性的终止剂，使得ddNTP可以终止DNA聚合酶的 延伸反应。
高通量测序
高通量测序是下一代测序技术的主要特点，能够在短时间内对大量序列进行 测序。
数据预处理
质量控制
使用FastQC等工具对原始数 据进行质量控制，检测数据中 是否存在可疑序列、高通量测
序的偏差等。
去除批次效应
将不同批次的数据进行归一化处 理，以去除批次效应，便于后续 分析。
数据过滤
根据质量控制结果，对数据进行过 滤，去除低质量的数据。
序列比对
选取比对算法
使用比对算法将序列与参考基 因组进行比对，如Bowtie、
随着技术的不断进步，NGS在生命科学研究中的 应用领域越来越广泛，从基因组学到转录组学、 表观组学等多个领域。
NGS与感染性疾病医学课件
通过NGS技术，医生可以精确地检测出患者细胞中的基因突变，并利用基因编辑技术修复这些突变，提高细胞的 健康和功能，从而达到治疗疾病的目的。同时，这些经过基因编辑的细胞也可以作为载体，为患者输送健康的基 因或药物。
04
ngs在感染性疾病防控中 的应用
疫情监测
实时监测病毒传播
通过NGS技术，可以对病毒进 行实时监测，及时发现和追踪 病毒的传播路径，为采取有效
NGS技术可以检测出传统方法难以检测出的病原体，如新型病毒、耐药菌株等。
对于传统方法无法确诊的疑难病例，NGS技术可以提供更准确的病原学诊断。
耐药性分析
NGS技术可以快速、准确地检 测出病原菌的耐药基因，从而判 断其对哪些抗生素具有耐药性。
NGS技术可以检测出多重耐药 菌株的耐药性，对于控制多重耐
它能够同时对大量的DNA或RNA分子进行序列测定，获取基 因组的全面信息。
ngs的技术原理
NGS技术主要基于半导体芯片或毛细 管电泳技术。
每个反应孔内进行独立的PCR扩增和 测序反应，得到大量短序列。
在NGS中，DNA或RNA样本被打断 成小片段，这些片段在芯片上被排列 成数百万个反应孔。
通过与参考基因组比对，这些短序列 可以组装成完整的基因组序列。
药菌的传播具有重要意义。
通过NGS技术对耐药性的分析 ，可以指导医生合理使用抗生素 ，避免滥用抗生素导致耐药性的
产生。
病毒基因分型
NGS技术可以对病毒基因进行分 型，帮助判断病毒的来源和传播
途径。
对于某些病毒，如流感病毒、新 型冠状病毒等，NGS技术可以快 速地检测出其变异情况，为防控
和治疗提供依以快速、准确地检测和识别病 原菌的耐药基因，帮助研究人员了解和预 测病原菌的耐药性发展趋势，为耐药性研 究和防控提供有力支持。
《NGS基础培训》课件
2023《ngs基础培训》课件contents •ngs基本概念及发展历程•ngs工作原理及测序技术•ngs在临床疾病研究中的应用•ngs在生物进化研究中的应用•ngs在环境科学中的应用•ngs技术在未来医学中的应用前景目录01ngs基本概念及发展历程下一代测序技术(NGS)是一种高通量的生物学技术，可以对基因组进行大规模、并行、快速、准确的测序。
NGS技术具有高速度、高通量、高灵敏度、高准确性、低成本和可重复性等优点。
ngs定义与特点ngs发展历程人类基因组计划完成了人类基因组的初步测序。
2005年2007年2010年2012年第一台下一代测序仪(Solexa)问世，标志着NGS时代的到来。
测序技术的快速发展，使得一天内能够完成人类基因组的测序。
单分子测序技术(PacBio RS)的出现，打破了基因组测序的限制。
ngs应用领域生物进化研究等药物研发和个性化治疗罕见疾病研究遗传疾病诊断和预防肿瘤诊断和治疗02ngs工作原理及测序技术总结词双端测序技术是NGS中应用最为广泛的技术之一，可以有效测定生物体基因组的变异情况。
详细描述双端测序技术是一种基于高通量测序平台的技术，它可以从生物体的两端同时进行测序，从而获得基因组的正反方向序列。
这种方法可以大大提高测序的精度和效率，同时减少测序成本。
双端测序技术总结词单端测序技术是一种简单有效的NGS技术，适用于对特定基因或DNA片段进行深入研究。
详细描述单端测序技术只对DNA的一条链进行测序，因此可以快速获得大量序列数据，并且可以有效降低测序成本。
但是这种方法无法测定基因组的整个序列，需要结合其他技术进行分析。
单端测序技术序列组装和基因组构建是NGS技术的关键环节，对于后续的基因组分析和研究至关重要。
详细描述序列组装是将测序得到的数千个序列片段进行拼接和排列，从而得到完整基因组序列的过程。
基因组构建是在序列组装的基础上，根据生物体的基因组结构特点构建基因组图谱的过程。