lecture-28(宾夕法尼亚大学二代测序数据分析教程)
二代测序质控各参数标准
二代测序质控各参数标准一、引言二代测序（Next-GenerationSequencing，NGS）是一种高通量的基因组测序技术，广泛应用于生物医学研究、农业育种、疾病诊断等领域。
在二代测序过程中，质量控制（QualityControl，QC）是至关重要的一步，其中质控参数的设定和标准是关键。
本文将介绍二代测序质控各参数的标准。
二、样本质量评估1.完整性：样本应保持完整，无断裂或降解。
可通过测定样本的分子量、片段长度分布等指标进行评估。
2.浓度：样本浓度应在合理范围内，过高或过低的浓度都可能导致测序质量下降。
3.特异性：样本应具有特异性，不应包含其他杂质序列。
可通过序列特异性指数（Sequence-SpecificityIndex）进行评估。
三、测序数据质量评估1.序列深度：测序深度是指测得的有效序列数量。
理想情况下，测序深度应覆盖目标区域的每个碱基。
2.覆盖度：覆盖度是指测序序列对目标区域的整体覆盖程度。
理想情况下，应具有广泛的覆盖度，以保证准确性和可信度。
3.质量值分布：测序质量值应在合理范围内，过低或过高的质量值都可能导致错误率升高。
4.碱基错配率：碱基错配率是指非特异性碱基的比例。
应尽可能降低错配率，以保证结果的准确性。
四、质量控制标准1.严格控制样本质量和浓度，确保样本具有特异性。
2.确保测序深度和覆盖度达到预期要求，同时关注质量值和错配率。
3.对数据进行多维度分析，包括序列长度、GC含量、突变位点等，以确保结果的全面性和准确性。
4.根据实验需求和样本特性，制定合适的质控参数标准，并定期评估和调整。
5.建立完善的质控流程和标准，确保实验数据的可靠性和可信度。
五、结论二代测序质控各参数标准的设定和评估是质量控制的关键环节。
通过严格控制样本质量和浓度、确保测序深度和覆盖度、关注质量值和错配率、多维度分析数据等措施，可以提高二代测序的准确性和可信度。
同时，建立完善的质控流程和标准，定期评估和调整质控参数，可以确保实验数据的可靠性和可信度，为后续研究提供有力支持。
第八讲 二代测序技术(新)
• 目前高通量测序平台的代表：
2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购） 推出了454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform ）;
Illumina Solexa特点
• 原始数据准确率 ≥ 98.5%，可有效地解决了多聚 重复序列的读取问题，如 AAAAAAAAAAAAAAAAA，TTTTTTTTTTTTT
• 样本使用效率高，对少量样本也可以极灵敏精 确地检测 （1ug DNA即可以进行末端双向测序 反应）
• DNA序列的读取长度不断增加，当前达到 150bp-300bp
• 引物扩增 • 利用专利的芯片：芯片表面连接有一
层单链引物（Primer），DNA片断成 单链后通过芯片表面的引物碱基互补 被一端“锚定”在芯片上 • 其一端“锚定”在芯片上，另外一端 （5’或3’）随机和附近的另外一个引 物互补，被“锚定”住，形成“桥 “(bridge) • 这样的反应在上千万DNA单分子上发 生
• 确保高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，为同聚物和 重复序列的测序提供了一个很好的解决方案。
Solexa测序实验流程
1、样品制备 • 样品收集，基因组DNA打断 • DNA 末端修复 • 连接接头
2、DNA片段在Cluster Station上成簇扩增 • 准备Flowcell和试剂，安装到Cluster Station； • 将样品DNA连接到Flowcell； • 完全自动化完成Cluster制备；
ABI SOLiD™系统
Illumina Solexa Sequencing System
二代测序数据质控qc-简书
二代测序数据质控qc-简书摘要：一、二代测序数据质控概述二、FastQC工具的安装与使用三、FastQC质控参数解析四、质控结果的分析与应用正文：一、二代测序数据质控概述随着基因测序技术的发展，二代测序数据在生命科学研究中的应用越来越广泛。
然而，在分析这些数据之前，对其进行质量控制（QC）至关重要。
质量控制旨在确保数据质量达到研究要求，从而保证研究结果的可靠性和准确性。
本文将介绍一种常用的二代测序数据质控工具——FastQC，以及其安装、使用方法和质控参数解析。
二、FastQC工具的安装与使用1.安装FastQCFastQC是一款开源的Linux软件，可以在Ubuntu等操作系统上安装。
安装过程中，请注意将FastQC添加到系统环境变量中，以便在终端或命令行中直接运行。
具体安装方法可参考FastQC官方手册。
2.运行FastQC在命令行中，可以直接运行以下命令进行FastQC质控：```fastqc [-o output_dir] [--(no)extract] [--(no)html] [--(no)tsv] [input_files]```其中，`input_files`为待质控的FastQ文件，`output_dir`为质控结果输出目录。
可选参数`--extract`、`--html`和`--tsv`分别表示提取原始数据、生成HTML报告和生成TSV格式文件。
三、FastQC质控参数解析1.质量分数统计：FastQC会统计每个碱基的质量分数，用以评估测序质量。
质量分数越高的碱基，其测序准确性越高。
2.测序深度：统计各个碱基的测序深度，用以评估样本覆盖度。
测序深度越高，样本覆盖度越均匀。
3.序列长度分布：统计质控后序列的长度分布，用以评估序列完整性。
4.质量分布：统计各个质量等级的碱基比例，用以评估整体测序质量。
5.碱基含量分布：统计各个碱基在序列中的含量分布，用以评估碱基组成。
6.序列一致性：统计多个测序结果显示相同碱基的比例，用以评估测序重复性。
高通量测序数据分析-环境样品数据处理方法
高通量测序数据分析-环境样品数据处理方法环境微生物群落多样性分析QQ空间新浪微博腾讯微博微信更多71微生物群落多样性的基本概念环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。
长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。
但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。
第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。
在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。
以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。
研究方法进展环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。
近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。
目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。
DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种16S rDNA序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做到绝对定量。
高通量测序技术的数据分析方法教程
高通量测序技术的数据分析方法教程随着生物技术的发展，高通量测序技术（high-throughput sequencing technology）已成为生物学、医学和生物信息学研究中的重要工具。
高通量测序技术可以快速而准确地测定DNA或RNA序列，透过大量的数据来揭示生物体的基因组、转录组以及其他生物学过程中的变化。
然而，正确且高效地分析测序数据是高通量测序技术应用的关键一步。
本文将介绍高通量测序技术的数据分析方法教程。
首先，分析高通量测序数据前，我们需要了解常见的测序平台和数据格式。
当前常用的高通量测序平台包括Illumina、ABI SOLiD、Ion Torrent等，而测序数据通常以FASTQ、SAM/BAM和VCF等格式存储。
FASTQ格式用于存储原始测序数据，其中包含了每个测序读段的序列信息及其对应的质量分数。
而SAM/BAM格式则是将测序读段比对到参考基因组之后的结果，其中SAM是比对结果的文本格式，而BAM则是对应的二进制格式。
VCF（Variant Call Format）格式则用于存储基因型变异信息。
接下来，我们将介绍高通量测序数据的基本分析流程。
通常，测序数据分析可以分为质控、比对、变异检测和功能注释几个主要步骤。
在质控步骤中，我们需要对测序数据进行质量评估和过滤。
质量评估可以通过查看测序数据的质量分数、GC含量、碱基分布和测序错误率等指标来判断测序数据的质量。
使用质量评估工具如FastQC和NGS QC Toolkit可以帮助我们快速准确地评估测序数据的质量，并进行相应的过滤工作，去除低质量的测序读段。
接下来，我们需要将测序读段比对到参考基因组上。
比对工作可以通过软件如Bowtie、BWA和HISAT等进行。
比对结果通常以SAM格式存储，然后可以进行排序、去重和索引等处理，生成最终的BAM格式文件。
在变异检测步骤中，我们需要从比对后的BAM文件中检测样本中存在的变异信息。
变异检测可以通过多种工具来实现，如GATK、Samtools和VarScan等。
深度测序数据分析部分
1基因数据库的建立1.1建立病原体数据库肺炎的发生是有很多原因所致。
病因可分为以下几类：①细菌性肺炎，可分为肺炎链球菌肺炎、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性莲球菌、肺炎克雷白杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌肺炎等。
②非典型病原体所致肺炎，如军团菌、支原体和衣原体等。
③病毒性肺炎，如冠状病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、麻疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等。
④真菌性肺炎，如白色念珠菌、曲霉、放线菌等。
⑤其他病原体所致肺炎，如立克次体（如Q热立克次体）、弓形虫（如鼠弓形虫）、原虫（如卡氏肺囊虫）、寄生虫（如肺包虫、肺吸虫、肺血吸虫）等。
⑥理化因系所致的肺炎如放射性损伤引起的放射性肺炎，胃酸吸入引起的化学性肺炎，对吸入或内源性脂类物质产生炎症反应的类脂性肺炎等。
凡是能引起肝脏损害、出现肝功能异常的肝脏炎症性疾病，称之为肝炎。
它是一类严重危害人体健康的疾病。
我们常说的肝炎，主要是指病毒性肝炎。
据近几年科学研究，因其致病病原体的不同而有甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、己型肝炎、庚型肝炎等。
另外，因大量、长期饮酒引起的肝炎，叫做酒精性肝炎；对肝脏有损害的药物引起的叫做药物性肝炎；还有由于机体免疫功能紊乱引起的叫做自身免疫反应性肝炎。
本项目不考虑由理化原因引起的肺炎和肝炎疾病，因此，只需建立目前已知的所有肺炎和肝炎致病基因的数据库。
1.2建立人体常见的微生物基因组数据库人体有四个大的细菌储存库，即皮肤、口腔、结肠、泌尿生殖道。
种类繁多，多与人类能和平共处，少数是条件致病菌。
论个难以数计，论重量，据估计每个活的个体可达3-4公斤。
人类体表和肠道是无数微生物的居所。
Elizabeth Costello及其同僚对多达27个身体部位的微生物进行了调查，其中包括肠道、口腔、耳朵、鼻子以及多达18个区域的皮肤表面。
研究人员还发现，某些皮肤部位，如食指或膝盖的背侧常常比肠道或口腔能容留更为多元的微生物。
他们的数据所强调的事实是，我们身体的个体化的微生物随着时间的推移仍然保持着相对的稳定，而且它们展现了在我们身体各个位置生长的可预测的模式。
DNA第2代测序技术ppt课件
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一 直具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包 含了整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基 因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的 复杂性和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要 的角色。
微生物遗传学时期
• 大致是1940～1960年，在这一时期中，采用微生物作为 材料研究基因的原初作用、精细结构、化学本质、突变机 制以及细菌的基因重组、基因调控等，取得了已往在高等 动植物研究中难以取得的成果，从而丰富了遗传学的基础 理论。
分子遗传学时期 • 这一时期从1963年沃森和克里克提出DNA的双螺旋模型 开始，但是50年代只在DNA分子结构和复制方面取得了 一些成就，而遗传密码、mRNA、tRNA、核糖体的功能 等则几乎都是60年代才得以初步阐明。 • 20世纪70年代初，建立了遗传工程这一新的研究领域。 遗传工程是在细菌质粒和噬苗体以及限制性内切酶研究的 基础上发展起来的，它不但可以应用于工、农、医各个方 面，而且还进一步推进分子遗传学和其他遗传学分支学科 的研究。
• 在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀— 深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色 质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以 直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip， ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、 结合位点内的突变情况和蛋白亲合力较低的区段。
• 孟德尔于1866年发表了论文《植物杂交试验》，首次提 出分离和独立分配两个遗传规律，并认为性状遗传是受细 胞里的遗传因子控制的。 • 但是，孟德尔的这一重要理论当时未能收到重视，直到 1900年，狄· 弗利斯﹑柴马克和柯伦斯三人才同时发现。 • 1900年孟德尔遗传规律的重新发现，被公认为遗传学建 立和发展的一年，并于1906年将遗传学作为一个学科的 名称。
基因组数据分析
2 第二代测序分析工具
3 第二代测序平台数据
• illumina Hiseq2500 (solexa)
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读长： 250nt 格式： fastq 读长： 50nt 格式： csfasta
• ABI SOLiD
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• Roche GS FLX (454)
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读长： 800~1000nt 格式： sff/fasta
• runAssembly -o outputdir (-large) 1.sff • Result files
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454AllContigs.fna 454LargeContigs.fna 454ReadStatus.txt (Assembled/Singleton/Repeat) 454Contigs.ace
• Soapdenovo
/soapdenovo.html
• Velvet
/~zerbino/velvet/
• ABySS
http://www.bcgsc.ca/platform/bioinfo/software/abyss
小 RNA 测序
2 第二代测序分析工具
• 超过 1000 种分析工具
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/wiki/Software/list
• 常规分析 – calling, quality control, alignment/assembly, SNP/Indel discovery, SNP annotation • 高级分析 – functional polymorphism, disease/phenotype, genomic coordinate
*Linux, 64bit CPU, 4G-256G memory