液相色谱柱的清洗
液相色谱清洗流程 (1)
液相色谱清洗流程：（反相系统）
流动相：1:准备80度左右的热水，加30%左右的异丙醇，2：3% 的双氧水3:10%的硝酸。
4，纯水。
用两通代替色谱柱，流量3ml/min，把四个通道滤头全部放入准备好的流动相。
各通道25%比例。
打开排空阀，流动相冲洗5分钟。
关闭排空阀，取此流动相为样品。
进样100微升，运行10针。
每针1分钟。
（依次使用上述4种流动相处理）
更换样品瓶玻璃滤头，和排空阀过滤白头、
装上柱子，用10%水和纯乙腈或者甲醇，分别冲洗柱10分钟流量1ml/min。
再用分析方法的流动相平衡柱20-30 分钟。
液相柱反冲流程
将色谱柱出口接到进口管线上，用混合流动相，水，甲醇，乙腈等，或者反复梯度：例：
0分钟10%甲醇90%水。
120分钟100%甲醇。
240 分钟10 %甲醇。
360分钟100 %甲醇…….。
流量0.1-0.2ml/min。
柱原来的进口端侵泡在有混合液体的烧杯内。
以保证流出污染物溶解
分散。
95%乙醇冲洗色谱柱
95%乙醇冲洗色谱柱
95%乙醇冲洗色谱柱是一种常见的色谱柱清洗方法。
具体操作步骤如下：
1.关闭色谱仪电源，拆下色谱柱。
2.将色谱柱的两端连接到冲洗装置上。
3.将95%乙醇注入冲洗装置中，使其流经色谱柱。
4.调节冲洗装置的流速，使乙醇以适当的速度流经色谱柱。
5.冲洗过程中，可以观察乙醇的颜色和流速，以确保色谱柱得到充分清洗。
6.冲洗时间一般为30分钟至1小时，具体时间可以根据色谱柱的类型和使用情况而定。
7.冲洗完毕后，关闭冲洗装置，拆下色谱柱，用氮气吹干。
需要注意的是，在冲洗色谱柱之前，应该先了解色谱柱的类型和使用情况，以便选择合适的清洗方法和溶剂。
同时，在操作过程中应该注意安全，避免乙醇泄漏和火灾等危险情况的发生。
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗
液相色谱柱维护保养及仪器冲洗注意：每个色谱柱使用之前都要阅读一下使用说明书;色谱柱维护保养是很重要的,关系到色谱柱的使用寿命和检测结果的准确性,所以任何人用过色谱柱之后,一定要对色谱柱进行保养,管理人员和使用者互相监督;总的原则是色谱柱要轻拿轻放,避免损坏填料；另外没有使用的情况下,一定要保证两端的堵头封好;对于具体的色谱柱,下面列出常用色谱柱维护保养的具体方法和注意事项,以便使用者参考;min缓慢升高到min不接检测器冲洗色谱柱30分钟后,将色谱柱与检测器连上,流速调为ml/min冲洗色谱柱60分钟,然后不断降低有机相的比例如80%、50%、10%甲醇或乙腈各冲洗至少30分钟;若色谱柱暂时不用,则将色谱柱保存在高比例有机相中如80%甲醇或乙腈,或者参考该色谱柱使用说明书中建议的溶剂中；色谱柱使用时应用与分析流动相相同比例的有机溶剂将缓冲盐溶液换成水冲洗色谱柱15分钟,然后再换成流动相进行样品分析;样品分析完后,色谱柱维护与保养方法：流动相中若含酸、碱、盐类物质,则要先用10%甲醇或乙腈冲洗,min的流速冲洗至少30min,再用80%甲醇或乙腈冲洗至少30min,柱子保存在80%甲醇或乙腈里具体问题具体分析,洗脱程序可以是梯度洗脱程序,注意如果最后色谱柱保存的是高有机相,第二天用之前一定要用高水相过渡一下,再换成流动相;如柱子长时间未用,则柱子保存在100%的甲醇或乙腈里;对于含有离子对试剂的流动相如庚烷磺酸钠和十二烷基磺酸钠等,柱子应采用梯度洗脱,一般用乙腈-水系统水：90-10；乙腈：10-90冲洗时间要稍长些,然后保存于90%乙腈;需要特别强调的是,目前所有的C18柱均不能用纯水进行长时间1小时以上冲洗,除非有专门耐水的专用柱,否则,用纯水长时间冲洗色谱柱,会导致色谱柱的固定相流失和相塌陷,损坏色谱柱;大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2~8,有的pH稳定范围会宽,具体pH稳定范围参照色谱柱说明书,当分析条件的pH值偏小或偏大时,可选择pH稳定范围宽的柱子进行分析,否则,会损坏色谱柱;在每次进行样品分析时,要保证流动相包括盐、缓冲盐、酸等与色谱系统及柱内的保存液要互溶,如不能互溶,则需要用一定比例的有机溶剂不低于10%或与分析流动相相当的有机溶剂对柱子进行过渡,否则,流动相中的盐会在系统与柱内析出,影响样品分析或损坏柱子;硅胶柱、正相手性色谱柱包括AS-H、AD-H、OD-H系列,5DMB、5TBB系列,OA 系列如OA-3100、OA-3300对于未启用的新的色谱柱,在保证系统是正相的情况下,可先用异丙醇小流速流速为~min冲洗色谱柱约15分钟,然后换上正相流动相平衡进行色谱分析;硅胶柱及正相手性柱不能过水相对于sepax系列的硅胶柱,可以过低比例的水相有机相不低于50%,接上色谱柱之前要保证液相色谱系统中的所有管路为正相流动相如是不含盐的反相溶液如水/乙腈；水/甲醇,先用异丙醇冲洗所有管路,然后用正相流动相冲洗所有管路,最后再接上色谱柱；若反相流动相中含有缓冲盐如缓冲盐/乙腈；缓冲盐/甲醇,先用纯水冲洗HPLC系统,然后用异丙醇冲洗所有管路,最后用正相流动相冲洗,再接上色谱柱;使用结束后,先用异丙醇冲洗色谱系统与色谱柱,再用色谱级的正己烷冲洗色谱柱,或者直接用正己烷－异丙醇90：10冲洗,并保存在正己烷－异丙醇90：10中;如长时间未用,则保存在正己烷中;需要特别强调的是,冲洗硅胶柱时,不能用纯水或含水的有机溶剂或缓冲盐体系冲洗色谱柱,只能用纯有机溶剂冲洗色谱柱对于sepax系列的硅胶柱可以用不低于50%有机相冲洗色谱柱,最后保存在纯的有机溶剂中;在进行样品分析前,一定要保证流动相与色谱系统及色谱柱柱内的保存液要互溶,如不互溶,则需要用异丙醇过度,否则,会影响色谱系统与损坏柱子;反相手性色谱柱如：CHIRALCEL OZ-3R：同C18柱阴离子柱和阳离子柱：目前常见的阴子柱有waters IC-Pak TM anion,阳离子柱有磺酸基阳离子柱与waters阳离子交换柱钙型;对于waters IC-Pak TM anion 和waters阳离子交换柱钙型,新柱子使用前用高纯水小流速min缓慢升高到min冲洗约30分钟,然后再换成流动相平衡色谱柱;在冲洗色谱柱之前,要保证整个色谱系统为纯水相;对于磺酸基阳离子柱含有硅胶基柱的,使用前用甲醇或乙腈小流速冲洗30分钟,然后高纯水替换系统冲洗,然后接上色谱柱;分析完样品后,对于waters IC-Pak TM anion和waters阳离子交换柱钙型用高纯水冲洗色谱柱,色谱柱最后保存在纯化水中;对于磺酸基阳离子柱,用50%的乙腈或甲醇冲洗色谱柱30分钟,最后保存在甲醇或乙腈中参照柱子说明书;冲洗所用流速根据柱子耐压情况进行调整;需要特别强调的是waters IC-Pak TM anion和waters阳离子交换柱钙型是不能过有机相纯有机溶剂或有机溶液,否则会损坏色谱柱;氨基柱、氰基柱、苯基柱及C8柱目前所使用的氨基柱、氰基柱、苯基柱及C8柱基本都是使用反相系统,其操作方法与维护保养与C18相同;对于新碰到的别的型号的色谱柱,如本规程没有说明时,要参照色谱柱说明书具体问题具体分析;液相仪器的冲洗1、冲洗色谱系统具体情况具体分析,可针对缓冲盐浓度较高的流动相一般做完试验冲洗完色谱柱后,换上两通,将各通道放于10%乙腈中冲洗至少30分钟若原色谱系统中流动相含盐,则用高纯水有时候用温水效果更好冲洗至少30分钟后再用10%乙腈冲洗;若仪器长时间不用,则将仪器保存于80%乙腈中; 2、清洗进样针、柱塞杆洗针液应选择能较好溶解样品的溶剂如该样品在70%甲醇中溶解,则洗针液应选择70%甲醇或更高比例的甲醇；清洗柱塞杆的溶剂为了清洗流动相中析出的盐,一般选择低比例的有机相,如10%甲醇或乙腈;3、仪器的钝化色谱泵溶剂过滤头、进出口阀及管路包括进样器和检测池若被污染,系统应做清洗和钝化处理;一般采用30%磷酸水溶液作为清洗剂,用6mol/L硝酸作为钝化剂,先清洗再钝化;清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢;钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜;30%磷酸水溶液制备：取85%浓磷酸35ml与65ml水混匀;6mol/L硝酸的制备：取浓硝酸40ml与60ml水混匀;方法：将色谱柱取下,用两通连接进样器和检测器,将所有吸滤头放入高纯水中,以min流速过渡至少30分钟,待管路中有机溶剂洗脱干净；再换用30%磷酸清洗系统约45分钟,再换高纯水冲洗,直至出口水pH值约为6～7用pH试纸测试,清洗完成；然后换用6mol/L硝酸冲洗系统约45分钟,再换高纯水冲洗,直至出口水pH值约为6～7,钝化完成;用纯甲醇过渡,浸润泵头及管路,备用;。
液相色谱柱的维护与保养
液相色谱柱的维护与保养
液相色谱柱的维护与保养非常重要，可以延长柱的使用寿命并保证分离效果的稳定性。
以下是液相色谱柱的维护与保养的一些建议：
1. 保持柱的洁净：在使用结束后，及时用纯水和有机溶剂洗净色谱柱。
可以采用逆向流动的方法，即用纯水从柱底往上流动直到洗净。
避免使用酸碱溶液以及有机溶剂中的含有杂质的溶液来清洗，避免杂质残留。
2. 避免干燥：柱在储存或者不使用时要避免干燥。
可以用保湿的方式，例如在储存时使用密封塑料袋或保湿剂。
避免长时间暴露在空气中，避免干燥引起的柱损坏。
3. 正确使用柱：避免使用超过柱最大压力或流速的方法进行色谱分离，这会导致柱壁破裂或分离效果恶化。
遵守柱的使用说明和规格。
4. 定期检查：定期检查柱的使用情况，例如检查是否有柱壁表面损坏或吸附物的形成。
如果发现有问题，应及时更换色谱柱。
5. 柱的再生：某些类型的液相色谱柱可以通过柱的再生来延长使用寿命。
具体的再生方法可以参考柱的使用说明书或与供应商咨询。
6. 注意避免柱受到冲击：在搬运和使用过程中要轻拿轻放，避免柱受到冲击造成损坏。
总之，正确的维护与保养可以延长液相色谱柱的使用寿命并保证其分离效果的稳定性。
根据柱的材质和类型，还可以采取适当的措施进行再生以延长柱的使用寿命。
液相色谱柱使用注意事项
色谱柱使用注意事项
一、色谱柱有方向：
柱子标签上箭头指示方向为，流动相溶液流动方向。
若方向
反，会影响柱效和使用寿命。
二、新柱子使用：
新柱子使用前，先要活化，具体方法：
1、把柱子接在泵上，检测器一端不接（注意）。
废液直接从
柱子另一端流出。
2、用纯甲醇溶液，以1ml/min，流速冲洗20—30分钟，即
可。
三、日常保养及维护（柱子连接色谱系统）
要根据不同的情况对色谱柱进行保养：
①反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，
实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30min，洗掉色谱柱中的
盐，再用色谱甲醇冲洗30min。
注意：不能用纯水冲洗柱子，
应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。
②长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的
溶剂下。
对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，并将购买
新色谱柱时附送的堵头堵上。
储存温度: 室温。
液相色谱的维护保养
液相色谱的维护保养
液相色谱(LiquidChromatography,简称LC)是一种常用的色谱分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
为了保证LC的分析结果准确可靠，必须对仪器进行定期的维护保养。
1. 液相色谱系统的清洁
在使用液相色谱前，必须对系统进行清洁，以避免污染对结果的影响。
清洁步骤包括：
- 清洗色谱柱：根据柱子类型选择合适的洗涤溶液，如纯水、乙腈、甲醇等，按照厂家提供的清洗步骤进行操作。
- 清洗进样器：将进样器从系统中拆下来，用洗涤溶液进行清洗，再用纯水冲洗干净。
- 清洗管路：将管路中的溶液排空，并用纯水进行多次冲洗，确保管路干净。
2. 液相色谱系统的保养
液相色谱系统的保养包括：
- 定期更换耗材：如柱子、进样器、滤膜等。
- 定期校准：校准泵的流量、检测器的灵敏度等参数，保证仪器的准确性。
- 定期检查电子元件：如检测器的灯管、电极等，保证其正常工作。
3. 液相色谱系统的存储
如果液相色谱系统长时间不用，必须进行正确的存储，以避免损
坏设备。
存储步骤包括：
- 将溶液从系统中排空，清洁干净。
- 拆下柱子和进样器，将其分别用保护塞封住。
- 将检测器的灯管、电极等拆下，放在干燥、通风的地方存放。
以上是液相色谱维护保养的主要内容。
只有定期进行维护，才能保证液相色谱系统的精准度和稳定性，获得准确可靠的分析结果。
液相色谱柱的日常维护保养
液相色谱柱的日常维护保养液相色谱柱是一种常见且重要的分析仪器，在实验室中被广泛应用。
为了保证液相色谱柱的良好工作状态和分析结果的准确性，日常维护保养是必不可少的。
预测维护在实验过程中，对液相色谱柱的使用会产生一定程度的损耗。
因此，在使用液相色谱柱的过程中，需要对其进行预测维护。
预测维护包括以下几个方面：1.液体进样器：每天使用前需要使用5%甲酸或醋酸水溶液进行清洗，冲洗10次；2.处理样品之前，需要使用纯水冲洗固相萃取（SPE）柱，以避免在反相色谱柱中残留的盐和其它非极性化合物损害色谱柱；3.沉淀时，孔径小的使用 0.45 微米滤膜；4.在一次实验操作中，同一规格的 Sample Loop 的使用次数不要超过30 次。
使用前，需要用洗针液清洗洗针头和 Sample Loop；5.使用过程中，如果发现色谱图出现异常，或者分离峰出现交叉、拖挂的情况，则需要对色谱柱进行常规维护。
常规维护常规维护主要涉及以下方面：色谱柱的清洗准备工作：1.将色谱柱固定在色谱仪上；2.关闭色谱仪，并将系统空气排出。
清洗步骤：1.用离子交换水（或去离子水）进行快速洗脱。
每 10 分钟换一次水，连续换 3 次；2.用5%甲酸（或乙酸）水溶液和纯水依次进行梯度洗脱，各洗 10 分钟，共需进行 20 分钟；3.用离子交换水（或去离子水）进行冲洗达 20 分钟，温度一般设置为室温；4.最后用重组缓冲液冲洗至少 30 分钟，直到色谱图正常为止。
清洗完毕后，需要用纯氮对色谱柱进行干燥，再关闭系统气路。
柱的保存柱的保存需要在低温，干燥，阴凉和避光的环境下进行。
存储柱的时间不宜过长，建议每次使用后立即保存，并在下次使用前先进行重新均衡。
色谱柱的更换在使用一段时间后，液相色谱柱的效果会逐渐降低，这时需要进行更换。
在更换时，需要注意以下几点：1.需要按照生产厂家提供的说明书进行更换；2.更换前需要对新柱进行校准；3.更换完成后，需要重新运行QC 样品，验证新柱的分离效果是否正常。
液相色谱柱清洗活化再生
1.色谱柱的活化30个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡30柱体积。
=9：1冲洗30倍柱体积，再流动相平衡30个柱体积。
100%甲醇或乙腈冲洗30个柱体积，然后转换到流动相平衡。
用于反相色谱时，先用异丙醇或乙醇冲洗色谱柱50-100个柱体积，然后用甲醇/乙腈：水（50:50）冲洗10个柱体积，然后再用流动相平衡30柱体积。
50倍柱体积50/50乙腈/水活化平衡，然后再用流动相平衡30柱体积。
2.色谱柱的清洗保存和再生清洗：如使用缓冲盐，先用高比例水相冲洗30个柱体积，然后再转换到80%有机相冲洗30个柱体积。
再生：用95%水，甲醇，异丙醇，甲醇，95%水分别冲洗30个柱体积，在第一次用95%水时，进样10次100 μL DMSO。
清洗：100%乙醇0.3ml/min 3h，再用正己烷：异丙醇=9：1冲洗30倍柱体积并保存。
再生：根据不同类型正相柱选择。
[常规正己烷/异丙醇的柱子，乙醇（0.1%三氟乙酸）0.3ml/min 3h，乙醇0.3ml/min 3h，乙醇（0.1%二乙胺）0.3ml/min 3h，乙醇0.3ml/min 3h，正己烷：异丙醇=9：1冲洗30倍柱体积]清洗：用100%水冲洗30个柱体积去除盐，然后用100%甲醇或乙腈冲洗30个柱体积后保存在50%甲醇或乙腈中。
再生：先用高浓度盐的缓冲液清洗（浓度可以是5-10倍，不超过1M），然后再用100%水洗，50%乙腈或甲醇保存。
清洗：反相使用时同反相C18色谱柱，如短期不用，可用95%甲醇或乙腈保存;长期不用时需用异丙醇置换，最后用正己烷保存。
再生: NH2柱用于反相条件时，NH2键会水解，先用含1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液冲洗30个柱体积，乙腈-水(50:50)冲洗30个柱体积，95%水/5%乙腈冲洗30个柱体积，异丙醇冲洗30个柱体积，95%乙腈/5%水冲洗30个柱体积并保存。
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液相色谱柱的清洗
一、液相色谱柱按基体成分的分类
1、硅胶基体：不键合任何化学基团的为硅胶柱，键合的化学基团有C18 、C8、C4、氨基、氰基、苯基等。
2 、聚合物基体：常见的聚合物基体为聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇。
聚合物上再键合化学基团。
根据填料基体的成分不同可以分为：
二、色谱柱常见问题的成因
1、硅羟基的死吸附：硅胶粒子表面存在硅羟基，这些硅羟基会吸附样品和流动相中的很多物质，当吸附达到饱和时就会出现柱效下降、峰形劣化的现象。
有些吸附是可逆的，可以通过清洗解决。
2、重金属离子：重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,造成峰形劣化。
3、缓冲液中盐的析出：当流动相中含有缓冲盐溶液，而且分析结束后,如果没有先用水进行冲洗,而是直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。
这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐份,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。
4、色谱柱变干：如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,会影响分离效果。
三、对色谱柱进行适当清洗的意义
以上提到的部分故障可以通过适时、适当的清洗得到解决，恢复色谱柱的功能，延长色谱柱的使用寿命。
下面对比较常见的几种型号的色谱柱的清洗方法进行讨论，具体的冲洗方法要根据实际情况作适当的选择和调整。
当然，不同的用户和色谱产品厂商对自己的色谱柱会有不尽相同的处理方法。
四、新柱使用前的冲洗
新柱在使用前应先认真阅读说明书及性能测试报告,了解柱子的性能指标。
分析用的流动相往往与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。
要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。
1、反相柱如岛津C18、C8等柱保存在70%甲醇中，可用10〜20倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。
流速应缓慢提高，如开始0.3mL/min,10〜15min 后可慢慢加快。
2、正相柱或称极性色谱柱一般保存在正庚烷或正己烷中。
如果分析时的流动相含有极性溶剂,应使用乙醇或异丙醇冲洗,流速0.1 〜0.3mL/min , 将保存液冲洗干净后,再用流动相平衡。
3、钙柱等糖柱只能用纯水作流动相进行冲洗，有机溶剂会造成色谱柱损坏，尤其要注意。
冲洗后可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。
分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。
一般用流动相平衡的时间为30min, 若系统中有盐或水,平衡时间应延长。
五、反相柱日常清洗
色谱柱清洗是日常的重要维护工作。
分析工作结束后,要用适当的溶剂清
洗系统中残留的样品。
在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用甲醇冲洗30〜60min ；若含酸、碱、盐类物质,应先用10 %甲醇,或用与分析用流动相相同比例的不含酸、碱、盐的溶液,冲洗30〜60min , 再用甲醇冲洗。
直接用纯甲醇冲洗,会导致缓冲盐沉淀于柱子或检测池中。
关于纯水的问题：纯水极性很强,ODS 等填料的硅烷键是非极性的,在纯水中各键合基团会因疏水作用而改变空间构型, 使柱效很快降低。
很多公司推出可以使用100% 纯水进行冲洗的柱子,原理是键合基团互相之间有排斥力,这类柱子一般键合相比较丰富，游离硅羟基比较少，从而阻止了键合基团性能的改变。
能否用纯水冲洗要参考该色谱柱的说明书。
关于离子对试剂：常用的离子对试剂有烷基磺酸钠等, 这时通常采用pH3〜5的缓冲盐体系。
对于酸性样品一般使用常用四丁基铵盐，这时采用碱性体系。
容易出问
题的是前一种情况。
分析结束后,柱子应先用有机溶剂-水体系冲洗,再用水冲洗,最后用有机溶剂冲洗。
这是因为烷基磺酸钠都是表面活性剂, 可以洗掉脂肪油（如烷烃及其衍生物）在水的环境下烷基磺酸钠会将键合的烷烃基洗脱下来,造成固定相的流失。
所以应该先用有机溶剂-水体系冲洗柱子,表面活性剂会溶解在有机相中逐渐被冲洗出来,从而减少表面活性剂对键合相的洗脱。
六、反相柱的修洗复清
1、如果柱子污染严重可以使用以下方法清洗：
2、以水、甲醇、乙腈、氯仿依次清洗，再以相反的顺序清洗。
3、氯仿的作用是洗去残留的非极性杂质。
4、在用甲醇冲洗时可以将四氢呋喃作为样品注射，有助于去除强疏水性杂质。
5、四氢呋喃和甲醇的混合溶液可以去除类脂类污染物，也可同时注射二甲亚砜。
6、乙腈、丙酮、三氟乙酸（0.1% ）的混合溶液有助于去除蛋白类污染物。
七、正相柱的清洗
1、硅胶柱可以用以下方法清洗：
2 、正己烷（正庚烷）、二氯甲烷、甲醇依次清洗，再按照相反顺序冲洗。
3、甲醇的作用是洗去残留的强极性杂质。
4、正己烷可以使硅胶表面重新活化。
5、注意试剂的脱水处理，尤其是甲醇容易与水混溶，所用试剂应现用现开，试剂瓶加盖。
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