共聚焦显微镜使用技巧与心得
激光共聚焦操作步骤
激光共聚焦操作步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM），是一种光学显微镜，利用激光和扫描镜技术，能够对样品进行高分辨、高对比度的三维成像。
下面将介绍激光共聚焦显微镜的操作步骤。
1.准备工作：a.打开显微镜电源，确保仪器处于正常工作状态。
b.打开激光源电源，等待激光系统启动。
c.准备样品，将样品放置在载玻片上，并使用封口膜或密封胶固定。
2.调节孔径光阑：a.打开镜头盖，取下玻璃保护盖。
b.观察显微镜视野，调节孔径光阑的大小，以获得最佳的入射光。
c.用合适的滤光片选择适当激光激发波长。
3.调节激光功率：a.打开激光源的控制面板。
b.选择合适的激光功率，通常初次使用时可选择较低功率。
c.通过目镜观察激光处于合适的位置和方向，避免直接观察激光。
4.调节焦距：a.打开目镜盖，观察样品上的图像。
b.调节目镜的焦距，获得清晰的图像。
c.使用恰当的倍率进行观察，确保所需的细节可见。
5.调节光路：a.打开激光共聚焦显微镜软件，进行光路调节。
b.调节反射镜和聚焦镜，确保激光能够准确地聚焦在样品上。
c.通过调节扫描镜，使激光能够扫描整个样品。
6.设置扫描参数：a.在软件中选择扫描参数，如扫描速度、像素大小等。
b.减至最小的扫描区域，以便首先观察最感兴趣的区域。
c.如有需要，可以进行连续扫描或者多通道扫描的设置。
7.开始扫描：a.点击软件界面上的“开始”按钮，开始扫描。
b.观察扫描时光点在样品上的移动情况，确保图像的获取和处理是正确的。
c.根据需要调整扫描参数，以获得更好的图像质量。
8.界定感兴趣区域（ROI）：a.选择感兴趣的图像区域，用鼠标进行界定。
b.设置参数，如增益、对比度、亮度等，以便获得更好的视觉效果。
c.按下截图按钮，将感兴趣的图像保存下来。
9.分析和处理图像：a.关闭扫描功能，进入图像处理模式。
b.使用软件提供的功能分析和处理图像，如三维重建、图像拼接等。
激光共聚焦扫描显微镜使用原理讲解
1．激光共聚焦扫描显微镜的基本原理？与普通显微镜的区别？1.原理：激光共聚焦扫描显微镜利用激光束经光源前方的照明针孔（激发针孔）形成点光源，在物镜焦平面上形成一个轮廓分明的小点，激发出的荧光经原来的入射光路直接反向回到分光镜，并将荧光直接送到探测器前方的探测针孔（共聚焦针孔），通过探测针孔时先聚焦，由探测针孔后的光电倍增管逐点接收，在计算机屏幕上形成清晰的荧光图像。
照明针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭（共焦）的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时焦聚于照明针孔和探测针孔。
这样，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡。
2.区别：共聚焦显微镜与普通显微镜相比有许多独特的优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线的噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，即显微CT。
最核心的优点是降低噪音干扰：对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好地会聚，可以全部通过针孔探测器接收，而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。
而随着距离物镜焦平面的的距离越大，杂散光在探测针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，探测器上产生的信号就越小，这样就能有效防止杂质信号。
2．钙指示剂的类别和优缺点：1. 生物发光蛋白优点：不需要荧光激发系统，光毒性小。
缺点：不能通透细胞膜，对技术要求高，效率较低，需要较多的指示剂。
2. 荧光蛋白指示剂优点:比值测定，荧光信号强。
缺点：染料的信号可变度小，对PH值变化敏感。
3. Fura2（比值型）优点：避免实验设备、细胞类型、实验个体的差异，数据具有高度可比性。
缺点：紫外激发，一定的自发荧光，损害细胞的能量代谢。
4. Fluo3（非比值型）优点：激发，自发荧光小，对细胞的损害较小。
缺点：数据直接为荧光强度值，容易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。
双光子共聚焦显微镜FV1200MPE使用说明
点击 观察透射光（倒置显微镜） 2. 选择染料 点击 跳出荧光染料选择窗口，选择对应荧光 >> Apply 3. 扫描图像
Focus X2 以 2 倍速扫描图像，适合低扫描分辨率图像的快速聚焦（忽 略 Kalman、慢速扫等功能） Focus X4 以 4 倍速扫描图像，适合高扫描分辨率图像的快速聚焦（忽 略 Kalman、慢速扫等功能） XY Repeat 可以直接高质量扫描图像，但速度略慢（使用 Kalman、 慢速扫等功能） XY 适合快速预扫描后直接高质量出图，可以执行高级 lamda/Z/Time 扫描（使用 Kalman、慢速扫等功能） 六、关机步骤： 1. 物镜 Escape，无水乙醇擦净镜头。 2. 滤光转轮放至 DICT。 3. 软件上一定要关闭双光子激光器！ 4. 关闭软件。 5. 拧闭总控器（1 把）和共聚焦激光器钥匙（2 把）。 6. 从右至左关闭电源（其中汞灯长按关闭）。 7. 关闭电脑。 8. 待汞灯 300 秒倒计时完毕，关闭两个插线板总电源。
图9 激发分色镜（图 9a）：标识数字为反射的激光波段，其余波段荧光通 过。 荧光反射镜(图 9b)：标识数字为分界波段，如图表示为<560nm 波段反射，>560nm 波段将透过该镜片。 吸收滤色镜（barrier filter）(图 9c)：用于过滤特异波段的荧光， 在光谱系统中该部分可以通过狭缝和光栅随意调节。标识一般表示为 “带通”，如图表示 505nm-525nm 波段的荧光可以通过此滤色片。 8. 物镜： 成像的决定性部件，对系统的分辨率、检测荧光强度等起决定作用。 系统分辨率(能够检测相互靠近两点的最小距离)R = k×NA/λ 物镜的数值孔径（Numerical Aperture）：NA 越高，分辨率越好。 介质折射率：折射率越高，物镜能够达到的 NA 越高。 色差校正：对可见光各波段的校对能力，使同一点发出的不同颜色的 光能够同时成像到同一平面的能力。 五、数据采集 三步骤获取图像 1. 观察 显微镜下观察标本，选择合适的物镜
共聚焦显微镜的应用
共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜是一种常见且广泛应用于生物学、材料科学和其他领域的先进显微镜技术。
它通过使用一种特殊的激光光束和精确的光学系统，可以获取高分辨率和高对比度的显微图像。
共聚焦显微镜的原理是利用聚焦在样本上的激光光束与样本中的荧光信号进行交互，然后通过成像系统收集并转换这些信号为可视化的图像。
共聚焦显微镜的应用范围非常广泛。
下面，我将从多个角度讨论共聚焦显微镜在不同领域的应用。
1. 生物学中的应用：共聚焦显微镜在生物学研究中具有重要作用。
它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。
在细胞生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞内蛋白质、细胞器和细胞核等结构的分布和运动。
共聚焦显微镜还可以用于观察细胞分裂过程、细胞内信号传导和细胞凋亡等关键生物学过程。
2. 材料科学中的应用：在材料科学领域，共聚焦显微镜被广泛应用于材料的表征和分析。
它可以提供高分辨率的表面形貌和内部结构信息。
在材料表面缺陷分析中，共聚焦显微镜能够观察到微观缺陷的形貌和位置。
共聚焦显微镜还可用于材料的化学成分分析和荧光标记探针的检测。
3. 医学领域中的应用：在医学领域，共聚焦显微镜可用于细胞和组织的诊断和研究。
在癌症研究中，共聚焦显微镜可以观察到癌细胞的形貌和分布，从而帮助医生确定病情和制定治疗方案。
共聚焦显微镜还可以用于血液和生物标本的显微观察，以及对药物在体内的分布和代谢过程的研究。
总结回顾：共聚焦显微镜是一种在生物学、材料科学和医学领域具有广泛应用的先进显微镜技术。
它通过高分辨率和高对比度的显微图像提供了对样本的详细观察。
在生物学中，共聚焦显微镜可以用于观察细胞结构、蛋白质分布和细胞内过程。
在材料科学中，共聚焦显微镜广泛应用于材料的表征和分析。
在医学领域，共聚焦显微镜对癌症诊断和研究具有重要意义。
通过综合利用共聚焦显微镜的特点和功能，我们可以更深入地理解和研究生物、材料和医学等领域的重要问题。
观点和理解：共聚焦显微镜作为一项先进的显微镜技术，为我们提供了探索微观世界的窗口。
激光共聚焦显微镜的使用和管理
科技资讯 SC I EN C E &TE C HN O LO G Y I NF O R MA T IO N 工 业 技 术激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)是随着计算机技术和光电技术的飞跃发展,在20世纪80年代后期发展起来的。
在生命科学研发中, LSCM技术已经成为生物医学中一个标准的研究工具。
目前共聚焦显微镜的功能非常多,好像是一个科研工作站,其应用也大多在生命科学研究领域。
围作为大型贵重精密仪器,LSCM的日常使用的管理需要按照严格的规程来实施,LEICA TCS SP5共聚焦显微镜的使用及管理方法如下。
1 了解仪器的组成所有上机操作的人员必须经过培训,了解仪器组成、工作原理和操作规范方可上机。
1.1仪器的组成LEICA TCS SP5主要由四部分组成:(1)显微镜光学系统。
为倒置显微镜;镜头包括共聚焦专用平场复消色差10×,20×,40×, 63(油镜),100×(油镜)镜头;(2)扫描装置;(3)激光光源。
本机器包含4个激光器:405nm激光,氩离子激光(457,476,488和514nm), 561nm激光,氦氖633nm激光,共四个检测通道;(4)检测系统。
整套仪器由计算机控制,各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活进行。
由于激光器在工作时散发大量的热,需要风扇降温,突然断电可能烧坏激光器,因此还需要配备稳压电源和不间断供电装备。
1.2工作原理LSCM的工作原理是:照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的,激光光源经照明针孔,经由分光镜反射至物镜,并聚焦于样品上,对标本内焦平面上的每一点进行扫描。
然后,激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜,通过探测针孔时先聚焦,聚焦后的光被光电倍增管(PMT)探测收集,并将信号输送到计算机,在这光路中,焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的,不能通过小孔,只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔被观测到。
激光共聚焦使用技巧和注意事项
犹他大学神经生物与解剖学 美国犹他州盐湖城 样品：斑马鱼胚胎视网膜神经轴突 技术：共聚焦显微镜
吉森大学生殖生物学系解剖学与细胞生物学中心 德国吉森 样品：大鼠睾丸冰冻切片 技术：共聚焦显微镜
德国汉堡大学医学中心 德国汉堡 样品：端复胞器 技术：共聚焦显微镜
显微镜常用观察方式：
BF-明场
PH -相差
光谱拆分（Unmixing）
光谱反卷积（deconvolution）
各种荧光蛋品，普遍存在着荧光发射光谱重叠 染料串色（DAPI/FITC… ） 背景自发荧光 （组织FISH、植物标本…）
Spectral Unmixing
YOYO-1 (nuclei) 515-nm emission before unmixing Alexa488 (F-Actin) Colour merged after unmixing
分辨率∝物镜数值孔径（NA） 荧光亮度∝NA4/M2
UPLFLN40XO UAPO40XO PLAPON60XO UPLSAPO60XW UPLSAPO100XO
:NA1.30 :NA1.30 :NA1.42 :NA1.20 :NA1.40
正确使用物镜
低倍至高倍找标本、观察、扫描成像
针孔、激光强度和检测器灵敏度
针孔
一般情况Pinhole处于 Auto状态
实际使用中：
薄标本（活细胞等）：增大针孔，提供图像亮度 ，得到更好反差的图像，有效的保护标本。 厚标本（厚组织切片等）：减小针孔，获取更薄 的图像，更好细节的图像。
针孔大小关系
检测器：PMT
HV推荐值：不高于700
CTRL+H
激光等级:Class 3B
共聚焦显微镜平台安全操作及保养规程
共聚焦显微镜平台安全操作及保养规程1. 前言共聚焦显微镜（confocal microscopy）是高级显微技术的一种，可以用来观察细胞和分子级别的细节。
共聚焦显微镜平台的安全操作和保养是使用共聚焦显微镜的基本要求，可以最大程度地保护设备并确保观察结果的准确度和可靠性。
本文列出了一些共聚焦显微镜平台的安全操作和保养规程，以便用户参考并遵守。
2. 安全操作2.1 设备准备在使用共聚焦显微镜之前，需要确保设备处于正确的位置，并且连接好所有的电缆。
检查设备的耗材，例如镜片、滤光片、探头等是否已经清洗并准备好。
2.2 操作之前在操作共聚焦显微镜之前，需要知道所有操作的步骤，并了解如何使用软件进行图像采集、存储和处理。
检查所需的光源是否已经打开，并确保所有必需的设置均已经完成。
2.3 操作时在操作过程中，需要注意以下事项： - 不要在显微镜周围分散存放物品； - 在操作过程中，不要使用酒精或酚酞等溶剂，以防损坏显微镜； - 不要长时间使用显微镜，以防止灯泡过热引起损坏； - 遵循设备操作手册，防止任何操作引起机械损坏。
2.4 操作完成后在使用共聚焦显微镜完成所有操作之后，需要将设备调整到其初始位置。
彻底清洗设备，以防止污染和损坏。
关闭所有灯泡和电源，并将所有电线纠缠在一起并收拾好。
3. 保养规程3.1 每日保养在每次使用共聚焦显微镜之后，需要进行以下保养： - 清洁设备的各部分； - 更换一次使用的滤光片； - 检查设备的光源是否工作正常。
3.2 周期性保养每隔一段时间需要进行以下保养： - 清洗设备的各部分； - 更换已经磨损的设备部件； - 调整设备的各项参数。
3.3 定期保养定期保养需要进行比较复杂的修理与调整。
建议每隔6个月使用专业维修工对设备进行定期保养和检查。
4. 总结共聚焦显微镜是一种非常先进的显微技术，但是它不仅价格昂贵，而且使用起来比较复杂，因此需要注意安全操作和保养规程。
只有正确使用并保养该设备，才能确保共聚焦显微镜的寿命和性能，并获得准确的观察结果。
leica共聚焦显微镜使用说明
Leica共聚焦显微镜使用说明Step 1: 打开PC电源——“1”Step 2: 打开汞灯控制开关——“2”Step 3: 打开中控盒——“3”Step 4: 打开计算机主机——“4”，启动计算机。
注：计算机操作系统启动后方可继续开机！！Step 5: 顺序打开激光器电源Scanner—“5”，激光冷却系统LASER Ar/ArKr—“6”★注：须确认冷风开启后方可打开激光电源！！！！！Step 6: 将上图虚线框中激光功率控制旋钮——“6.5”顺时针旋转60°左右。
Step 7: 将上图所示488 nm激光管开关——“7”钥匙沿顺时针旋转约120°至显示灯亮，再将钥匙旋回竖直位置Step 8: 依次将上图所示543/594 nm激光管开关——“8”和633 nm 激光管开关——“9”钥匙沿顺时针旋转约90°至显示灯亮。
Step 9:依次打开半导体激光器电源——“10”和405 nm激光管开关——“11”，（“11”的开启方式同“8”、“9”。
）Leica共聚焦显微镜关机顺序及注意事项Step 1: 关闭软件→拷贝Data→关闭计算机Step 2: 依照开机顺序倒序关闭各个开关，由”11”→”7”, ”5”→”1”。
★注：（1）冷风——”6”不能立即关闭！！须在关闭所有硬件设备30min 后方可关闭，以使激光管完全冷却，延长使用寿命。
（2）PC电源——“1”须在电脑确定关闭后方可关闭！！数据采集Step 1: 实验前扫描样本片观察激光通路是否正常工作。
Step 2: 上样，须轻起轻落科勒照明系统，选择合适倍数物镜，通过FLUO键选择相应荧光通道，调节载物台和焦距，找到合适视野。
Step 3: 点击由Visual→Scan，点击选择扫描模式，如xy, xyz, xyt, xyzt, xyλ etc..点击选择扫描格式（一般为默认值512*512）。
Step 4: 点击打开Beam path setting窗口，对光路和检测器进行设置。