激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
激光扫描共聚焦显微镜原理
激光扫描共聚焦显微镜原理
激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束扫描样品表面，通过共聚焦来获得高质量的图像。
LSCM的原理是利用激光束扫描样品表面，激发样品中的荧光物质发出荧光信号，然后通过共聚焦来获得高质量的图像。
共聚焦是指将激光束聚焦到样品表面上，使得样品表面上的荧光物质只在一个非常小的区域内发出荧光信号，这样就可以获得高分辨率的图像。
LSCM的优点是可以获得高分辨率的图像，可以观察到细胞和组织的微观结构，可以进行三维成像，可以观察到活细胞的动态过程。
LSCM的应用非常广泛，可以用于生物学、医学、材料科学等领域的研究。
LSCM的操作比较复杂，需要专业的技术人员进行操作。
在操作过程中需要注意保护样品，避免样品受到损伤。
此外，还需要注意激光的功率和扫描速度，以获得高质量的图像。
激光扫描共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，可以获得高质量的图像，应用非常广泛。
在使用过程中需要注意保护样品，避免样品受到损伤，同时还需要注意激光的功率和扫描速度，以获得高质量的图像。
激光共聚焦荧光通道
激光共聚焦荧光通道
激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光光源来聚焦样品表面的特定区域，通过采集经过激光激发的荧光信号来获取高质量的细胞或组织的三维图像。
在激光共聚焦显微镜中，荧光通道是指用于检测和记录样品中荧光信号的特定光学通道。
激光共聚焦显微镜通常配备多个荧光通道，每个通道可以选择特定的荧光染料来激发和检测。
通过选择不同的荧光通道，可以同时观察多种荧光标记物，或者对同一标记物的不同特性进行观察，从而获取更加丰富的信息。
这些荧光通道通常与特定的激光波长和荧光滤光片相对应，以确保精确的激发和检测荧光信号。
在实际的显微镜操作中，研究人员可以根据实验需求选择合适的荧光通道组合，以获得最佳的荧光成像效果。
不同的荧光通道可以用于观察不同的细胞器、蛋白质或其他生物分子的位置和分布，从而帮助研究人员理解细胞结构和功能。
同时，荧光通道的选择也需要考虑到荧光染料的光谱特性和相互干扰的情况，以避免信号重叠和混淆。
总之，激光共聚焦显微镜中的荧光通道是非常重要的，它们为研究人员提供了丰富的荧光成像选择，帮助揭示生物样品内部结构和功能的细节。
通过合理选择和使用荧光通道，研究人员可以获得高质量的荧光成像数据，为生物学研究和医学诊断提供重要的支持和帮助。
激光共聚焦
适合快速生理过程 如：Ca离子成像，快速z-切面
适合不规则形状的生物结构（任意手画定义）
z
发育中的果蝇胚胎
牛内皮细胞
扫描方式：任意曲线扫描
• 沿任意手画定义的曲线采集数据 • 适合不规则形状的生物结构
时间序列
• 时间序列记录（真实时间） • 在线比率 • 内/外触发（4内4外） • 荧光漂白程序 • 事件标记 • 像素时间 • 感兴趣区域/线的荧光强度平均值（在线或离线） • 最大时间分辨率：
Dyes used: DAPI (DNA), Texas Red (Par-2GFP), FITC (Tubulin)
LSM与传统光学显微镜相比，主要解决了生物样品 结构相互重叠影响观察的问题，并可形成清晰的三 维图象
扩展焦深
• 普通广视野荧光图像 • 样品的厚度大于物镜的焦深
• 共聚焦显微镜获得的样品的光学切片 • 光学切片的厚度取决于共聚焦针孔的直径
扩展焦深
一系列取自不同光学层面的的共聚焦图像，包含着整个样品的图像信息
扩展焦深
• 把这些单独的图像叠加（最大化 投影） 起来，就得到一幅扩展 焦深的图像（enhanced depth of focus）
• 这幅图像包含了样品的全部信息
所有细节都来自聚焦平面
共聚焦成像原理
位于共轭焦平面的小孔（共聚焦针孔 ），阻挡了来自焦平面以外的信号
3.一个微动步进马达控制栽物台的升降，使焦平面依次位于 标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的 图像。这称为“光学切片”。
激光共聚焦原理
激光共聚焦原理激光共聚焦（LSCM）是一种高分辨率的显微成像技术，它利用激光光源和共聚焦技术对样品进行扫描成像，广泛应用于生物医学、材料科学、生物工程等领域。
激光共聚焦显微镜具有成像分辨率高、光学切片能力强、样品透射性好等优点，成为现代生命科学和材料科学研究中不可或缺的工具。
激光共聚焦显微镜的原理基于激光共聚焦技术，其核心是激光光源和共聚焦探测器。
激光光源通过聚焦镜聚焦到样品表面，激发样品中的荧光或拉曼信号，然后通过共聚焦探测器进行信号采集和成像。
在激光共聚焦显微镜中，激光光源经过聚焦镜的聚焦后，能够在样品表面形成一个极小的激光光斑，这样可以获得非常高的横向分辨率。
同时，共聚焦探测器能够准确地收集样品表面的荧光或拉曼信号，实现高分辨率的成像。
激光共聚焦显微镜的成像原理是通过激光光源的聚焦和共聚焦探测器的信号采集，实现对样品的高分辨率成像。
激光共聚焦显微镜的成像分辨率主要受到激光光源的聚焦能力和共聚焦探测器的信号采集能力的影响。
因此，激光共聚焦显微镜的成像分辨率可以通过优化激光光源和共聚焦探测器的性能来提高。
激光共聚焦显微镜的应用非常广泛，可以用于细胞和组织的活体成像、生物分子的定位和追踪、材料表面的形貌和结构分析等领域。
在生命科学研究中，激光共聚焦显微镜可以实现对活体细胞和组织的高分辨率成像，观察细胞器的三维结构和生物分子的动态过程。
在材料科学研究中，激光共聚焦显微镜可以实现对材料表面的形貌和结构的高分辨率成像，观察材料的微观结构和表面形貌。
因此，激光共聚焦显微镜在生命科学和材料科学领域具有重要的应用价值。
总之，激光共聚焦显微镜利用激光光源和共聚焦技术实现了高分辨率的样品成像，成为现代生命科学和材料科学研究中不可或缺的工具。
激光共聚焦显微镜的原理基于激光光源的聚焦和共聚焦探测器的信号采集，通过优化激光光源和共聚焦探测器的性能可以提高成像分辨率。
激光共聚焦显微镜在生命科学和材料科学领域具有重要的应用价值，可以实现对活体细胞和组织的高分辨率成像，观察材料的微观结构和表面形貌。
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
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生物秀-专心做生物
Introduction
ž LSCM 是一种高科技显微镜
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在生命科学领域的分子水平,细胞
及组织水平的研究中得到广泛应 用.
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ž 在细胞原位用特异探针标
ž 记激并 镜子出素用成的核,激像定磷酸光,位脂从,扫,蛋,而定多描白实性糖共质现及生,受聚,上定物多体w焦述量肽秀等w显大 检,w酶分-微分 测.专,子bb心io做o.生co物m
集(左图) ,这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长滤片和吸收波长滤片来完成对不同的
荧光标记进行选择性的成像。
ž 最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术（右图）,配上合适的激光源后,能够摆脱 传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长) ,这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧 光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料) 和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,
②用荧光标记细胞内的离子,可以单标记一种离子也可以多标记几种离子,检测细胞内如pH 和钠、 钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。
③用荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,通过对膜上、胞浆内多种免疫物质 的标记， 可以实现在同一张样品上同时进行多重物质标记,同时观察这些物质;
④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠、重复性优良; 数据图像可及时输出或长期储存。
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理
激光扫描共聚焦荧光显微镜原理激光扫描共聚焦荧光显微镜原理一、概述激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）是一种高分辨率、高灵敏度的生物成像技术，它通过激光和荧光探针相互作用，实现对生物样品的高清晰成像。
本文将详细介绍LSCM的原理。
二、激发荧光信号的原理LSCM是基于荧光成像技术的，因此了解荧光信号的产生机制非常重要。
在LSCM中，通常使用的探针为有机染料或蛋白质标记物。
这些探针受到激发波长（通常为紫外线或蓝色激光）后会被“激发”到一个高能态，并在短时间内返回基态时释放出能量，即产生荧光信号。
三、扫描共聚焦显微镜系统结构1. 激光器：LSCM中通常使用的激光器为氩离子激光器和氦氖激光器。
它们可以提供不同波长的激发波长，以满足不同探针的需求。
2. 光学系统：光学系统包括激光束聚焦、激光扫描和探测系统。
其中，激光束聚焦是将激光束聚焦到样品上的过程，通常使用的是物镜；激光扫描是将激光束在样品表面移动的过程，通常使用的是振镜；探测系统用于收集荧光信号，并将其转化为数字信号。
3. 样品台和样品固定装置：样品台用于放置样品，通常可以进行XYZ三向移动。
样品固定装置可以确保样品不会在成像过程中移动或震动。
4. 计算机：计算机用于控制整个系统，并处理、分析和显示成像数据。
四、扫描共聚焦显微镜成像原理1. 感应体积：感应体积是指在LSCM中能够产生荧光信号的三维区域。
它由两个因素决定：一个是物镜的数值孔径（NA），另一个是激发波长。
感应体积越小，则分辨率越高。
2. 扫描方式：LSCM采用的是点扫描或线扫描方式。
点扫描方式是将激光束聚焦到样品上的一个点，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕；线扫描方式是将激光束聚焦成一条线，然后在样品表面移动，重复这个过程直到整个样品成像完毕。
3. 探测方式：LSCM采用的是共聚焦探测方式。
共聚焦探测可以减少背景信号和散射信号的干扰，提高成像信噪比。
五、LSCM应用LSCM广泛应用于生物学研究中，如细胞生物学、神经科学、分子生物学等领域。
激光共聚焦显微技术在药学研究中的应用
激光共聚焦显微技术在药学研究中的应用随着生物技术的不断发展，药学研究领域的技术也在不断更新迭代。
激光共聚焦显微技术（Laser Scanning Confocal Microscopy，简称LSCM）是近年来药学研究领域中广泛应用的一种高分辨率成像技术。
本文将从LSCM的原理、应用、优势等方面进行探讨。
一、 LSCM的原理LSCM是一种采用激光扫描成像的显微镜技术，它通过激光束的扫描和成像，可以在细胞或组织水平上进行高分辨率成像。
其核心技术是借助激光束扫描样品表面，从而获得三维图像。
相比于传统的荧光显微镜，LSCM的分辨率更高，且可以实现三维成像。
二、 LSCM在药学研究中的应用1. 细胞成像在药学研究中，LSCM可以用来观察细胞的形态、结构和功能。
例如，LSCM可以用于观察细胞内的亚细胞结构，如线粒体、内质网和高尔基体等。
同时，LSCM还可以用于观察细胞的代谢活动和信号通路。
2. 药物输送系统成像在药物输送系统研究中，LSCM可以用来观察药物在细胞内的运输和释放。
例如，通过在药物中标记荧光染料，可以观察药物在细胞内的分布和释放情况。
3. 组织成像LSCM可以用于观察组织的结构和功能。
例如，可以用LSCM观察组织中细胞的分布、形态和功能，以及细胞间的相互作用。
同时，LSCM 还可以用于观察组织中药物的分布和作用。
三、 LSCM的优势1. 高分辨率成像相比于传统的荧光显微镜，LSCM的分辨率更高，可以观察到更细微的结构和细节。
2. 三维成像LSCM可以实现三维成像，可以观察到细胞和组织的三维结构。
3. 非侵入性成像LSCM可以在不破坏细胞和组织结构的情况下进行成像，可以观察到细胞和组织的生理活动。
四、结论LSCM是一种在药学研究中广泛应用的高分辨率成像技术。
它可以用于观察细胞和组织的结构、功能和药物作用。
相比于传统的荧光显微镜，LSCM具有高分辨率、三维成像和非侵入性成像等优势。
在未来的药学研究中，LSCM将会扮演越来越重要的角色。
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.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
一般常用的气体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。
illuminating pinhole:照明针孔功能：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。
且与detectorpinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后,通过物镜在样品聚焦。
对标本内焦平面上的每一点进行扫描,Focal plane:焦平面功能：激光点光源照射物体在焦平面处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。
该光斑经过物镜和分光镜等一系列装置的处理，分别在照明针孔及探测针孔两处聚焦。
共聚焦的含义由此而来。
标本上的被照射点所发射的荧光沿同一光路进入物镜, 穿过分光镜后在探测针孔处成像, 该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。
然后经探测针孔后的光电倍增管(PMT) 或冷电感耦合器件(cCCD) 逐点或逐线接收,将光信号转变为电信号，传输至计算机，迅速在屏幕上形成荧光图像。
关键在于：照明针孔与detector pinhole(探测器针孔)及焦平面形成共聚焦装置。
生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o m通过调节分光镜（一般是调节反光镜），调节光路，使激发光的焦点恰好通过探测器针孔，随后进入光电倍增管。
不在针孔处聚焦的光不能通过。
生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mLSCM 对生物样品的观察的优越性：ž连续扫描三维ž离子荧光标记ž同时多重物质标记在对生物样品的观察中,激光共聚焦显微镜有如下优越性:①对活细胞和组织或细胞切片进行连续扫描,可获得精细的细胞骨架、染色体、细胞器和细胞膜系统的三维图像。
②用荧光标记细胞内的离子,可以单标记一种离子也可以多标记几种离子,检测细胞内如pH 和钠、钙、镁等离子浓度的比率及动态变化。
③用荧光标记探头标记的活细胞或切片标本的活细胞生物物质,通过对膜上、胞浆内多种免疫物质的标记，可以实现在同一张样品上同时进行多重物质标记,同时观察这些物质;④对细胞检测无损伤、精确、准确、可靠、重复性优良; 数据图像可及时输出或长期储存。
生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o m秀-专心做生物w w w.i o o.c om生物ž激发光和发射光都通过滤片来调节波长，滤片是成对的，调节起来很方便。
（左）ž科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。
随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用,研究人员注意到,荧光显微照片的分辨率较低, 传统的荧光显微镜使用场光源,因标本邻近结构(细胞或亚细胞结构) 产生的衍射光和散射光的干扰,使标本中细微结构的成像不够清晰。
ž早期的激光扫描共聚焦显微镜采用的是扫描速度较快的狭缝扫描方式,由于其在平行狭缝的光轴面上无共聚焦原理,图像分辨率不高,而被淘汰。
随后发展起来的是阶梯式扫描技术,它克服轴外像差,平行移动工作台来逐点扫描标本,提高了图像分辨率,但是对标本制备要求太高,也难于成为成熟的技术。
现在的激光扫描共聚焦显微镜采用的是驱动式光束扫描器,具有扫描速度较快和符合共聚焦原理的特点。
ž目前激光扫描共聚焦显微镜的光源设计和分光采集技术也有较大的改进。
首先是激光器的快速发展,使得现代的激光扫描共聚焦显微镜可以根据研究需要选择不同的激光器。
选择激光光源时,一方面要满足研究工作对波长的需求,另一个方面要考虑到激光光源的寿命。
其次是近年来对于激光束分光和荧光采集原理也有较大的突破,目前大部分激光扫描共聚焦显微镜仍采用选择性波长滤片轮进行分光和荧光采集(左图) ,这样的装置完全与传统的荧光显微镜一样使用激发波长滤片和吸收波长滤片来完成对不同的荧光标记进行选择性的成像。
ž最新一代激光扫描共聚焦显微镜可以用棱镜狭缝分光的新技术（右图）,配上合适的激光源后,能够摆脱传统的波长滤片组的限制,连续和自由地选择最佳波长) ,这一特点对于现在和未来开发出的各种新的荧光标记物(特别是各种荧光蛋白和荧光染料) 和研究动植物的自发荧光物质有很高的价值,从某种意义上,这一技术革新已使新一代激光扫描共聚焦显微镜超脱了传统的荧光显微镜系统。
与此同时用于激光扫描共聚焦显微镜的物镜也做了较大的改进,可以与高速扫描功能相匹配。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m心做生物b i o o.co mž在细胞原位用特异探针标记出核酸,蛋白质,多肽,酶,激素,磷脂,多糖,受体等分子ž并用激光扫描共聚焦显微镜成像,从而实现上述大分子的定位,定性及定量检测生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m隙连接通讯脂肪DAPIž常用的荧光探针:ž1 荧光染料FITC:蓝光激发,发出明亮绿色荧光ž2 罗丹明: 比FITC 光稳定性好,在生理条件下对PH 变化不敏感,荧光强度受细胞自发荧光的干扰较小生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž通常用的方法:ž1 细胞核形态观察ž2 脱氧核苷酸未端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)ž3 Annexin-V 试剂盒是检测凋亡细胞膜损伤的新方法生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m秀-专心做生物w w w.b bi o o.c om生物ž不同实验目的,标记细胞器的方法也不同.1线粒体MitochondriaRodamin 123Mitotracker Green FMMitotracker Orange CMTMRosMitotracker Orange 2 溶酶体Lysosome 中性红AO LysoTracker Green DND-26 / Blue/ Red 3 内质网Endoplasmic ReticulumDiOC64高尔基体Golgi apparatusNBD C6-ceramie生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mž根据不同细胞的特性,将每一种细胞特有的物质用不同的荧光控针标记;ž融合操作后,确认不同的荧光信号是否发生共定位于同一细胞;ž如在同一细胞中同时检测到上述不同的荧光信号,则说明已经发生了细胞融合.生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mž骨架(微丝,微管和中等纤维)直标: 一抗+荧光探针(如:肌动蛋白actin )间标:二抗+荧光探针(如:微管蛋白tublin)生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m肌动蛋白(Actin)标记肌动蛋白是微丝的基本成分毒伞素(鬼笔环肽)---与多聚体肌动蛋白微丝专一性结合起来且亲和作用强烈.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om微管蛋白(Tubulin)标记生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž染料荧光黄(LY)---黄色带电荷的小分子强荧光物质,不通过细胞膜,但可以很容易通过GJIC,从标记的细胞(划痕法)传输到邻近细胞.ž观察LY向邻近细胞的传输速率,用以表示GJIC连接通讯功能生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om漂白细胞(箭头标记)荧光漂白前(A)及漂白后0(B)、2(C)和4(D)min 时的荧光恢复情况经瞬间漂白后细胞内荧光强度明显变弱．随着时问的推移．荧光逐渐恢复，至4 min 时(D)．可见荧光强度明显恢复．FRAP 法测定膀胱平滑肌细胞GJIC 功能生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž尼罗红(Nile red):是一个理想的脂肪染色剂,它只在疏水环境中显示很强的荧光.除了在所需显示的脂质中被溶解外,尼罗红与组织不发生任何反应.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž利用相应的特异荧光控针标记后ž观察单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž(一)实时定量测定细胞内Ca2+的变化ž(二)测定细胞内PH 变化ž(三) 检测膜电位的变化ž(四)检测细胞内活性氧物种的产生ž(五)检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及其定位ž(六)检测荧光共振能量转移(FRET)ž(七)检测荧光漂白恢复(FRAP)生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž基本原理:ža 其乙酰羟甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,无荧光,为不带电荷的亲脂性化合物,易于渗透脂膜进入活细胞内žžb 在胞内被非特异酯酶水解,释放出游离酸形式的荧光探针分子,此游离态也无荧光,不易漏出胞外žc 一旦与Ca2+结合后便形成复合物,并有较强的荧光产生,从而发挥其钙探针的作用.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mKCLKCL生物秀-专心做生w ww .b b i o o .c o mž常用的荧光探针有BCECF 和6-COFDAžBCECF 的激发光谱是PH 依赖性的ž比例法:即分别用490nm 和440nm 光激发BCECF 所得到的发射荧光之比(比例荧光与PH 有很好的线性关系)ž最大分辩率为0.4PH 单位.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž快响应探针: 膜电位直接影响探针分子的电分布而改变其光谱,响应快ž慢响应探针: 主要通过改变其在膜内外的分布来对膜电位的变化作出反应.跨膜运动需要一定的时间,所以反应慢.依探针对电位变化响应速度,将电位敏感探针分为快响应探针和慢响应探针生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž基本原理:ža DCFH-DA 进入细胞后žb 经酯酶作用脱去二酯,生成不发荧光的DCFH žc 被超氧阴离子,过氧化氢等活性氧化生成发荧光的DCF žd 活性氧自由基的含量与荧光探针之荧光强度成正相关DCFH-DA 常用于直接测定细胞内活性氧自由基的动态变化生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž为检测药物分子,病毒,细菌等外界物质能否跨膜进入细胞/组织,需利用这些物质特异性自发荧光/对其进行荧光标记.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c omž由于荧光蛋白的独特优点,其特定的荧光对理论上可用于活细胞中实时研究大分子间的相互作用.生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om供体荧光素受体荧光素生物w w wžFRAP:是将待测细胞用荧光物质标记,借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭;通过低强度激光扫描成像,可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率.ž从理论上讲,凡是能够标记待测分子,并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mIntensityBefore bleach After bleach90 min after生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o m多光子激光扫描显微镜—Multiphoton Laser Scanning Microscopy ž在生物及医学成像,单分子探测,三维信息存储,微加工等领域得到广泛应用,展示了广阔的发展前景.生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m1.多光子激光器波长从700-1000nm 连续可调双光子波长：350-500nm 连续三光子波长：230-330nm 连续应用：可直接清晰活体观察某些非标记神经递质的分泌(5-HT ) 或NADPH 的分布生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o m秀-专心做w w w.b bi o o生物ž优点:ž1 对生物样品的光损伤小ž2 有效观测时间长ž3 穿透深度深ž4 荧光收集率高ž5 对探测光路的要求低ž6 适合多标记复合测量ž局限:ž1 只能对荧光成像ž2 样品可能受到热损伤.(若样品含吸收激发光的色团,如黑色素)ž3 超快激光器较为昂贵生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om生物秀-专心做生物w ww.b bi o o.c om秀-专心做生物w w w.b bi o o.c om生物。