TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响
TET1蛋白去甲基化作用及其对肿瘤影响的研究进展
TET1蛋白去甲基化作用及其对肿瘤影响的研究进展刘玉莹;张芳林【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2018(058)004【摘要】TET (ten eleven translocation)家族蛋白是DNA甲基化过程中的重要调节因子,包括TET1、TET2和TET3,属于a-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+依赖的双加氧酶.TET蛋白能将5-甲基胞嘧啶(5mC)氧化生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),是TET 蛋白发挥去甲基化作用的基础.TET蛋白对胚胎发育、生殖细胞形成及骨髓造血等具有重要作用.TET1蛋白在癌细胞和癌组织中的含量明显低于癌旁组织,提示TET1蛋白的DNA去甲基化作用对肿瘤的发生、发展具有一定影响.文章综述TET1蛋白发挥去甲基化作用的机制及其在肝癌、胃癌和结肠癌等中的最新研究进展,为肿瘤的预后和治疗作参考.【总页数】5页(P95-98,102)【作者】刘玉莹;张芳林【作者单位】南昌大学药学院药理教研室,南昌330006;南昌大学药学院药理教研室,南昌330006【正文语种】中文【中图分类】R73;R363【相关文献】1.组蛋白H3K27去甲基化酶UTX在肿瘤研究中的作用 [J], 杨贇;黄艳2.组蛋白去甲基化酶家族中组蛋白去甲基化酶4作用机制及其应用的研究进展 [J], 叶覃;Andreana HOLOWATYJ;Roselyne BBE;刘辉;Zengquan YANG3.组蛋白赖氨酸去甲基化酶在肿瘤中的作用 [J], 李浒;张中国;周震;张红胜4.TET1蛋白去甲基化作用及其对肿瘤影响的研究进展 [J], 刘玉莹; 张芳林5.组蛋白去乙酰化酶及去甲基化酶抑制剂在胃肠道肿瘤的研究进展 [J], 陈俊豪;丁杰;李显;岑祥莹;张林;吴明;樊斐;曾家兴因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
雷帕霉素调控TRAP1_抑制三阴型乳腺癌细胞增殖
研究论著雷帕霉素调控TRAP1抑制三阴型乳腺癌细胞增殖黄思源 石雅倩 李鑫 卢敏 郭文礼 刘勇成 欧叶涛【摘 要】 目的 分析雷帕霉素通过调控肿瘤坏死因子相关蛋白1（TRAP1）影响三阴型乳腺癌细胞MDA -MB -231增殖的药理过程，探讨雷帕霉素抗乳腺癌的作用机制。
方法 将MDA -MB -231随机分为对照组和不同剂量的雷帕霉素组，随后分别在24 h 和48 h 采用四氮唑蓝比色实验检测雷帕霉素对细胞增殖的影响。
同时以半抑制浓度（IC50）为研究条件，采用流式细胞术检测雷帕霉素对MDA -MB -231细胞周期的影响；采用蛋白免疫印迹法检测雷帕霉素靶蛋白（mTOR ）、p -mTOR 、TRAP1的蛋白表达；采用定量PCR 检测mTOR 、TRAP1的mRNA ；采用ATP 试剂盒检测ATP 含量；采用乳酸试剂盒检测乳酸的含量。
结果 雷帕霉素能抑制MDA -MB -231的增殖，在24 h 时，细胞增殖率开始下降，48 h 时，细胞增殖率下降更明显，并在10 μmol/L 、48 h 的条件下达到IC50，且呈剂量及时间依赖性（P < 0.01）。
雷帕霉素可以造成细胞周期G1期阻滞（P < 0.01）。
与对照组相比，加药48 h 雷帕霉素组TRAP1的mRNA 表达下降（P < 0.05），p -mTOR 和TRAP1蛋白表达也下降（P < 0.001），而mTOR 的mRNA 和总mTOR 蛋白变化比较差异均无统计学意义（P 均> 0.05），ATP 含量上升（P < 0.001），乳酸含量下降（P < 0.001）。
结论 雷帕霉素可调控三阴型乳腺癌细胞MDA -MB -231的代谢进程而抑制细胞增殖，该过程与TRAP1的下降有关。
【关键词】 雷帕霉素；三阴型乳腺癌；肿瘤坏死因子相关蛋白1Rapamycin affects the proliferation of triple -negative breast cancer cells by regulating TRAP1 Huang Siyuan △， Shi Yaqian ， Li Xin ， Lu Min ， Guo Wenli ， Liu Yongcheng ， Ou Yetao. △Guilin Medical University ， Guilin 541004， China Corresponding author ， Ou Yetao ， E -mail:*******************【Abstract 】Objective To investigate the pharmacological process of the effect of rapamycin upon the proliferation of triple -negative breast cancer MDA -MB -231 cells by regulating tumor necrosis factor receptor -associated protein 1 （TRAP1）， and to unravel the anti -breast cancer mechanism of rapamycin. Methods MDA -MB -231 cells were randomly divided into the control group and different -dose rapamycin groups ， and then the effect of rapamycin on cell proliferation was detected by MTT assay at 24 h and 48 h ，respectively. Meantime ， the half -maximal inhibitory concentration （IC50） of rapamycin was considered as the research condition. The effect of rapamycin on MDA -MB -231 cell cycle was detected by flow cytometry. The expression levels of mammalian target of rapamycin （mTOR ）， p -mTOR and TRAP1 proteins were detected by Western blot. The expression levels of mTOR and TRAP1 mRNA were measured by qPCR. ATP content was detected by ATP kit. The amount of lactic acid was determined by lactate assay kit. Results Rapamycin inhibited the proliferation of MDA -MB -231 cells in a dose - and time -dependent manner （P < 0.01）. The proliferationof MDA -MB -231 cells was decreased at 24 h and significantly decreased at 48 h after rapamycin treatment. IC50 was obtained at 10 μmol/L after 48 h. Rapamycin induced cell cycle arrest at G1 phase （P < 0.01）. Compared with the control group ， the expression level of TRAP1 mRNA was significantly down -regulated （P < 0.05）， and the expression levels of p -mTOR and TRAP1 proteins were significantly down -regulated （both P < 0.001）， whereas the expression levels of mTOR mRNA and total mTOR protein were notsignificantly changed （both P > 0.05）， the content of ATP was significantly increased （P < 0.001）， and the content of lactic acidwas significantly decreased （P < 0.001） in the 48-h rapamycin group. Conclusion Rapamycin can inhibit the proliferation of MDA -MB -231 cells by regulating the metabolic process ， which is related to the decrease of TRAP1.【Key words 】 Rapamycin ； Triple negative -breast cancer ； Tumor necrosis factor receptor -associated protein 1基金项目：国家自然科学基金（81960481）乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，在我国乳腺癌的发病率增长迅速，在女性原发肿瘤中所占比例高达15%，且呈明显年轻化趋势［1］。
HER-2基因特异性核酶在MDA-MB-453细胞内的瞬时效应
HER-2基因特异性核酶在MDA-MB-453细胞内的瞬时效应姜锐;罗速;樊丽【摘要】目的确定人表皮生长因子受体-2(HER-2)特异性锤头状核酶(hammerhead ribozyme,RZ)对雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453的影响.方法应用RT-PCR、免疫细胞化学检测RZ对MDA-MB-453细胞HER-2表达的影响;MTT法检测RZ对细胞增殖的影响.结果 RZ转染入MDA-MB-453细胞中,RT-PCR检测出转染RZ的MDA-MB-453细胞中HER-2 mRNA表达量明显下降;免疫细胞化学方法检测细胞内的HER-2蛋白表达下降;MTT法检测细胞增殖活性明显受抑.结论 RZ在MDA-MB-453细胞内有效抑制靶基因HER-2mRNA和蛋白的表达,同时可抑制细胞增殖,有助于进一步研究雌激素受体阴性乳腺癌细胞HER-2信号转导通路.【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2008(009)006【总页数】3页(P510-512)【关键词】人表皮生长因子受体2(HER-2);锤头状核酶;雌激素受体阴性乳腺癌;基因治疗【作者】姜锐;罗速;樊丽【作者单位】北华大学,生命科学研究中心,吉林,吉林,132013;北华大学,生命科学研究中心,吉林,吉林,132013;北华大学,生命科学研究中心,吉林,吉林,132013;齐齐哈尔医学院,药物研究所,黑龙江,齐齐哈尔,161042【正文语种】中文【中图分类】R737.9乳腺癌是妇女中最常见的恶性肿瘤之一，在女性癌症中的发病率占30%，近20年来，我国乳腺癌发病率和死亡率均呈上升趋势[1].在雌激素受体阴性乳腺癌中，人表皮生长因子受体-2(HER-2)[2-4]常常呈现高表达状态，表明HER-2及其相关因子信号转导通路可能在雌激素受体阴性乳腺癌细胞生长、增殖及乳腺癌从激素依赖型转变为非激素依赖型起重要作用.进行雌激素受体阴性乳腺癌HER-2及其相关因子的研究，有助于确定HER-2在雌激素受体阴性乳腺癌细胞生长、增殖及乳腺癌从激素依赖型转变为非激素依赖型中的作用，寻找可能的治疗靶点，使提高雌激素受体阴性乳腺癌治疗有效率和生存率成为可能.本实验将已经构建好的HER-2基因特异性RZ真核表达载体转染入雌激素受体阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453中，应用RT-PCR、免疫细胞化学检测RZ对MDA-MB-453细胞HER-2表达的影响，为HER-2作为肿瘤基因治疗的靶点提供实验依据.1 材料与方法1.1 材料限制性内切酶、DNA连接试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、RT-PCR试剂盒，均购自Takara公司；MDA-MB-453细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；RPMI-1640培养基、脂质体2000、DEPC、Trizol总RNA 提取剂、MTT为invitrogen公司产品；细胞免疫化学试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品.1.2 方法1.2.1 MDA-MB-453细胞培养MDA-MB-453细胞悬浮生长于10%小牛血清的RPMI-1640培养基中(100U/mL青霉素，100 U/mL链霉素)，37 ℃，在体积分数为5%的CO2中培养. 1.2.2 pcDNA3.1(+)-RZ瞬时转染MDA-MB-453细胞实验分组：正常对照细胞组，阴性细胞组(转染空质粒)，阳性细胞组(转染核酶重组子).转染后孵育24 h后，去除转染试剂，继续培养.1.2.3 RT-PCR法检测阳性转染细胞组HER-2基因的扩增应用Trizol试剂提取转染48 h后细胞总RNA，Trizol试剂提取细胞总RNA.应用Primer Premier 5软件设计引物：上游引物：5’-GAATTCCGGCAC AGTCTACAAGGGCATC-3’，下游引物：5’-GGGG TACCCCAGGCGTCCGCGGTTT-3’.RT-PCR扩增靶基因HER-2 cDNA片段，以β-action作为内参，序列为：上游引物：5’CTGGGAACGACATGGAG AAAA 3’，下游引物：5’AAGGAAGGCTGGAAGAG TGC 3’.1.2.4 MTT法检测瞬时核酶转染MDA-MB-453细胞对核酶的敏感性设正常对照细胞组，阴性细胞组(转染空质粒)，阳性细胞组(转染核酶重组子)，另设一空白组仅加含体积分数为10%新生牛血清的RPMI1640培养液，不加细胞，共4组，每组6个复孔.放置37 ℃ CO2孵育箱孵育.取出各处理组分别培养8 d 的细胞，每孔加入MTT溶液(5 g/L)10 μL，混匀37 ℃继续孵育4 h.离心弃去旧的培养液，每孔加入150 μL DMSO，轻微震荡10 min.在酶标仪上选择570 nm 波长测量样品吸光度值，以空白组为空白对照.以时间为横轴，吸光度值为纵轴作生长曲线，观察3组细胞生长情况.1.2.5 免疫细胞化学设立空白对照组(用PBS代替一抗)、正常细胞组、空质粒转染细胞阴性组和核酶转染细胞的阳性组，作HER-2抗体组染色.2 结果2.1 核酶转染MDA-MB-453细胞HER-2基因表达的检测利用RT-PCR方法检测核酶转染细胞中HER-2基因的表达.HER-2进行逆转录和30个PCR循环，其产物为269bp，内参对照β-action在同样条件下，其产物为545bp.RT-PCR产物电泳结果如图1所示.阳性细胞组HER-2mRNA的表达量低于正常对照细胞组和阴性细胞组，正常对照细胞组和阴性细胞组无显著差异，3组间内参对照β-action的表达基本相同.图1 核酶转染RT-PCR结果Fig.1 Result of transfection of ribozyme by RT-PCR2.2 瞬时转染MDA-MB-453细胞对核酶的敏感性检测MTT法检测转染MDA-MB-453细胞对核酶的敏感性，结果如图2所示，核酶转染的阳性细胞组的增殖能力低于正常组和阴性组的增殖能力.图2 MTT测定细胞生长情况比较Fig.2 Comparison of cell growth detected by MTT2.3 核酶转染MDA-MB-453细胞HER-2蛋白表达的检测免疫细胞化学空白对照组以PBS代替一抗，可见细胞内无明显颜色变化.HER-2蛋白染色：正常细胞组细胞胞浆有明显棕红色物质，表明细胞内富含HER-2蛋白；而阴性细胞组与正常细胞组内细胞棕红色物质基本相同，表明HER-2蛋白表达基本无明显变化；阳性细胞组细胞棕红色染色变浅，表明HER-2蛋白表达下降，如图3所示.图3 HER-2蛋白表达结果Fig.3 Results of HER-2 protein expression3 讨论核酶是一类具有催化活性的RNA分子，其具有很多独特的特点.核酶的作用底物为RNA，不仅能与特异性的靶基因结合，而且能切割靶基因，因此具有很强的抑制效率，能够调控靶基因的表达水平，可被应用于特定的细胞类型或细胞的不同发育阶段.其分子小，易操作，并可重复使用.其中由于锤头状核酶分子较小，结构简单，其催化活性中心只含13个保守序列，加上两端与靶基因结合的结合臂，即组成了与靶基因GUC序列结合的具有催化活性的核酶，故广泛应用于基因治疗领域[5-8]. 本实验设计构建了HER-2特异性锤头状核酶载体中的特异性核酶，可与HER-2mRNA的酪氨酸激酶功能区相结合，将其转染入MDA-MB-453细胞中观察该核酶对于HER-2mRNA和HER-2蛋白的作用及其对细胞增殖的影响.研究结果表明，转染HER-2特异性核酶的细胞中HER-2mRNA和HER-2蛋白的表达量较空白对照组和空载体转染组明显降低，增殖能力较其余两组弱.由此可见，本实验设计的锤头状核酶具有较强切割HER-2的能力，不仅使HER-2表达降低，且降低HER-2蛋白功能活性，进而抑制靶细胞增殖作用.实验表明，具有较强的抑制作用的核酶可作为有效的基因治疗手段，通过抑制雌激素受体阴性乳腺癌中HER-2的表达，有效抑制雌激素受体阴性乳腺癌细胞的增殖，为HER-2作为雌激素受体阴性乳腺癌基因治疗的靶点提供实验依据.【相关文献】[1] 李少林，陈晓品，吴凯南.乳腺癌的生物学特性和临床对策[M].北京：科学出版社，2004：65-67.[2] 田秀娟.乳腺癌C-erbB-3、C-erbB-4和C-erbB-2癌基因蛋白的表达及临床意义[J].肿瘤研究与临床，2005，17(1)：16-17.[3] 杨金巧，陈琳，幸天勇，等.乳腺癌中C-erbB2癌基因与雌、孕激素受体和PS2的关系及其预后意义[J].四川大学学报：医学版，2004，35(3)：334-336.[4] Suzuki T，Anderegg B.Adenovirus-mediated Ribozyme Targeting of HER-2/neu Inhibits in Vivo Growth of Breast Cancer Cells[J].Gene Ther，2000，7(3)：241-248.[5] 石建林，章为，周雪.核酶技术简介[J].四川解剖学杂志，2002，10(1)：25-29.[6] 程晋，张学庸，胡家露，等.核酶技术研究进展[J].国外医学肿瘤学分册，1997，24(1)：32-34.[7] Tuschl T，Eckstein F.Hammerhead Ribozymes：Importance of Stemloop Ⅱ for Activity[J].Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：6991.[8] McCall MJ.Minimal Sequence Requirements for Ribozyme Activity[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：5710-5714.。
Tet调控的乳腺癌耐受蛋白表达细胞系的建立及功能研究
Tet调控的乳腺癌耐受蛋白表达细胞系的建立及功能研究袁建辉;贺智敏;余艳辉;陈主初【期刊名称】《癌症（英文版）》【年(卷),期】2004(023)010【摘要】背景与目的:乳腺癌耐受蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)是1998年发现的新的ATP结合盒式(ATP binding cassette,ABC)跨膜转运蛋白超家族成员.本研究拟建立Tet调控的具有功能的BCRP表达细胞系,为研究BCRP 介导的药物耐受机制和探寻耐受逆转方法提供理想的实验平台.方法:利用Tet-on 基因表达调控系统,先后将调控质粒pTet-on和反应质粒pTRE-BCRP转染人PA317细胞,并用G418和潮霉素分别进行二轮筛选,挑取6个单细胞克隆并扩增培养;不同浓度的强力霉素(doxycycline,Dox)诱导后,用RT-PCR和Western blot检测并选取BCRP表达量与Dox剂量具有较好量-效关系的PA317/Tet-on/TREBCRP细胞克隆;采用MTT方法检测米托蒽醌(mitoxantrone)对不同浓度Dox诱导下的PA317/Tet-on/TRE-BCRP克隆细胞的杀伤作用;采用BCRP特异性抑制剂Ko143的干扰试验来检测PA317/Tet-on/TRE-BCRP细胞对米托蒽醌的药物敏感性;米托蒽醌处理不同BCRP表达量的细胞后,利用流式细胞仪检测细胞内存留米托蒽醌所释放出来的荧光强度.结果:发现5号PA317/Tet-on/TRE-BCRP克隆细胞BCRP表达量与Dox诱导剂量具有较好的量-效关系;其药物耐受性与BCRP 表达量呈正相关(r=0.995,P=0.002);Ko143能显著增强PA317/Tet-on/TRE-BCRP细胞对米托蒽醌的药物敏感性(P＜0.05);流式细胞术进一步证实在A317/Tet-on/TRE-BCRP细胞内不同浓度Dox诱导的BCRP不同表达能引起细胞内米托蒽醌存留量的变化.结论:成功地建立了Tet调控的具有功能的乳腺癌耐受蛋白(BCRP)表达细胞系,为进一步研究BCRP提供了理想的实验平台.【总页数】7页(P1127-1133)【作者】袁建辉;贺智敏;余艳辉;陈主初【作者单位】中南大学湘雅医学院肿瘤研究所,湖南,长沙,410078;中南大学湘雅医学院肿瘤研究所,湖南,长沙,410078;中南大学湘雅医学院肿瘤研究所,湖南,长沙,410078;中南大学湘雅医学院肿瘤研究所,湖南,长沙,410078【正文语种】中文【中图分类】R73-3因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
比卡鲁胺对乳腺癌细胞株MDA-MB-453的作用机制及与依维莫司联用的效果评估
doi:10.3971/j.issn.1000-8578.2021.20.0819比卡鲁胺对乳腺癌细胞株MDA-MB-453的作用机制及与依维莫司联用的效果评估张玉琴1，陆云飞2，张海添1Mechanism of Bicalutamide to Breast Cancer Cell Lines MDA-MB-453 and Inhibitory Effects of Its Combination with Everolimus ZHANG Yuqin 1, LU Yunfei 2, ZHANG Haitian 11. Department of Breast Disease, Guangxi International Zhuang Medical Hospital, Nanning 530201, China;2. Gastrointestinal and Gland Surgery, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, ChinaCorrespondingAuthor:ZHANGHaitian,E-mail:********************Abstract: Objective To investigate the effect of bicalutamide on migration and invasion of androgen receptor(AR) positive breast cancer cells and related mechanism, and the effect of mTOR inhibitor everolimus combined with bicalutamide on the proliferation of MDA-MB-453 cells. Methods Western blot was used to detect the expression change of mTOR, p-mTOR and p-S6 in breast cancer cell lines before and after bicalutamide treatment. Transwell assay was used to detect the cell viability. MTT assay was used to detect the proliferation of MDA-MB-453 cells treated by the combination of bicalutamide and everolimus. The combined effect of the two drugs was calculated by Jin Zhengjun’s method. Results After six days of bicalutamide treatment, the expression of mTOR, p-mTOR and p-S6 were decreased in MDA-MB-453 cells (Ρ=0.034, 0.05, 0.03). The invasion and migration were inhibited in MDA-MB-453 cells (migration: t =4.88, P =0.001, invasion: t =2.684, P =0.028). The proliferation of MDA-MB-453 cells was inhibited after the treatment of bicalutamide combined with everolimus, and the Q value were all greater than 1.15. Conclusion Bicalutamide could inhibit the invasion and migration of MDA-MB-453, and the inhibition effect is affected by the expression level of AR. The combination of bicalutamide and everolimus could synergistically inhibit the proliferation of AR positive breast cancer cells. Key words: Bicalutamide; Everolimus; Breast cancer; Drug combination Competing interests: The authors declare that they have no competing interests.摘 要：目的 探讨比卡鲁胺对雄激素受体（AR ）阳性乳腺癌细胞侵袭迁移能力的影响及相关作用机制，以及mTOR 抑制剂依维莫司联合比卡鲁胺对MDA-MB-453细胞株增殖作用的影响。
端粒结合蛋白CTC1提高人乳腺癌细胞放射抗性的潜在作用机制
能失调 ，细胞的放射敏感性增加 。因此 ，端粒是 衡 量肿 瘤 细胞放 射 敏感 性 的一个 重要 指标 。我们 推 测 端粒 结合 蛋 白 ＣＴＣ１可能 参 与人 乳 腺 癌细 胞放 射 敏 感 性 的 调 节 作 用 。基 于 以上 考 虑 ，２０１６年 ｌ－＿４ 月 ，本 研究 首先 构建 了人 乳腺 癌 放射 敏感／放 射抗 拒 细 胞模 型 （ＭＤＡ —ＭＢ一４３５／ＭＤＡ —ＭＢ一４３５Ｒ）， 并 探讨 端粒 结合 蛋 白 ＣＴＣ１与 人乳 腺 癌 细胞 放 射 敏 感 性 的关 系及其 潜在 的作 用 机制 。
华中科技 大学 同济 医学院附属武 汉中心医院肿瘤科 （湖北武 汉 ４３００பைடு நூலகம்２）； 武汉生 物工程 学院药 学院（湖北 武汉 ４３０４１５）
【摘要 】 目的 探讨端粒结合蛋白 ＣＴＣ１提 高人乳腺癌细胞放射抗性的潜在作用机制。方法 以单纯 转染试 剂 的细胞 作 为空 白对照 （Ｍｏｃｋ组 ），ｓｉＮＣ转 染细胞 作 为 阴性 对照 （ｓｉＮＣ组 ），ｓｉＣＴＣＩ＃３转染 细胞作 为 实 验 组 （ｓｉＣＴＣ１档 组 ）。ＭＤＡ—ＭＢ一４３５／ＭＤＡ—ＭＢ一４３５Ｒ 细胞分 别 以 ３×１０ 个 细胞 浓 度接 种 于铺 有 细 胞爬 片的 ６孔细胞 培养皿 中 ，待 ６ ｈ左 右 细 胞 贴壁 后 ，将 细 胞 分 为 未 处理 组 （ｕｎｔｒｅａｔｅｄ组 ）、单 纯射 线 照射 组 （ＩＲ 组 ）、ｓｉＣＴＣ１＃３干扰 组和射 线 照射联 合 ｓｉＣＴＣ１＃３干扰 组 （ＩＲ＋ ｓｉＣＴＣ１＃３组 ）。将 ｓｉＲＮＡ （ｓｉＣＴＣ１＃３和 ｓｉＮＣ） 利 用脂质体 转 染至 ＭＤＡ—ＭＢ一４３５／ＭＤＡ—ＭＢ一４３５Ｒ 细胞 ４８ ｈ后 ＣＣＫ８试 剂 盒检测 细胞 增 殖及 细胞 毒 性 ； 台盼蓝 染 色测定 细胞增 殖动力 学；Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ检 测细胞 相对 端粒 长度 ；免疫 荧光 检测 细胞 的 ＤＮＡ 损 伤 修 复 能 力及 ＣＴＣ１蛋 白与 ｙＨ２ＡＸ 的共 定位情 况 ；流 式细胞 术检 测 细胞周 期和 细胞 凋 亡情 况 ；检 测 细胞 Ｃａｓｐａｓｅ一３ 的 活性 以明确 细胞早期 凋亡 事件 的 触发 情况 。结果 ｓｉＣＴＣＩ＃３组 与 ｓｉＮＣ组、Ｍｏｃｋ组 增殖能 力、相 对端粒 长度 相比，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ｓｉＣＴＣ１＃３组 并没有 明显引起 细胞周期 时相的改 变（Ｐ＞０．０５）；ＭＤＡ— ＭＢ一４３５Ｒ细胞 与 ＭＤＡ—ＭＢ一４３５细胞相 比，对数 生 长期 的增 殖速度 、相对 端粒 长度 、￣／Ｈ２ＡＸ 焦点 的数 量 差 异 有统 计 学意 义（Ｐ＜０．０５）；ＩＲ＋ｓｉＣＴＣ１＃３组与 ＩＲ组相 比 ，７Ｈ２ＡＸ 的数 量 、细胞 凋 亡 率 、坏 死 率差 异 有 统计 学意 义（Ｐ＜０．０５）；在 转 染后 ２４ ｈ，ＭＤＡ—ＭＢ一４３５和 ＭＤＡ—ＭＢ一４３５Ｒ细胞 中 ｓｉＣＴＣＩ＃３组 Ｃａｓｐａｓｅ一３的 活 性 分别 为相 应 Ｍｏｃｋ组 的（４．３６±０．５３）倍 和（３．２１±０．２４）倍 （Ｐ＜０．Ｏ１）。结论 端粒 结合蛋 白 ＣＴＣ１提 高人 乳腺癌 细胞 放射 抗性 的机 制与 该蛋 白促 进肿 瘤 细胞 增 殖 、促 进 ＤＮＡ 损 伤修 复 、抑 制 端粒 缩 短 和抗 细胞 凋 亡 有 关 。而与调 节细胞 周期 进程 无 关。
常见几个乳腺癌细胞的表达的基因及培养
常见几个乳腺癌细胞的表达的基因及培养展开全文三连一下，了解更多精彩内容乳腺癌(mammary carcinoma)是女性最常见的恶性肿瘤之一。
因地理环境、生活习惯的不同...40%～50%的乳腺癌含有孕激素受体（PR），这类乳腺癌称为PR阳性乳腺癌。
实验常用的乳腺癌细胞有:MCF-7，MCF-10A，MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-435S，MDA-MB-436，MDA-MB-453，MDA-MB-468，MDA-MB-157，MDA-MB-361，SK-BR-3，SUM159PT，T-47D，ZR-75-30，ZR-75-1，Hs 578T，HCC1937，HCC 38，HBL100，BT-549，BT-474，BT-20，Bcap-37，DU4475等等。
不同的细胞株所表达的基因都会不同，以下，是我们整理的这些常见的细胞所表达的基因，也是我们公司可以提供的乳腺癌的细胞种类，乳腺癌研究方面的老师记得收藏哦：部分细胞形态细胞名称来源/形态培养基细胞表达BT-20腺癌细胞浸润性导管癌乳腺/上皮细胞样培养基：90%MEM 10%FBSG/A完全培养基：MEM完全培养基（货号：MD0301）气相：37℃, 5% CO2ER(-); PR(-);TP53 WT贴壁生长；该细胞表达WNT3和WNT78。
TNFalpha抑制该细胞生长。
该细胞雌激素受体阴性，但表达5＇外显子缺失的雌激素mRNA。
BT-474导管癌细胞乳腺;乳房/导管；上皮细胞样培养基：90%1640 10% FBSG/A完全培养基：1640完全培养ER( ); PR( );HER2( )；TP53浸润性导管癌 基（货号：MD0201）气相：空气95% ; 37℃, 5%CO2BT-549 导管癌细胞 乳腺；乳房/上皮细胞 培养基：90%1640 10% FBS G/A 完全培养基：1640完全培养基（货号：MD0201）气相：空气95% ; 37℃, 5%CO2ER(-); PR(-);TP53 WTHBL100胸腔积液 培养基：DMEM 基础培养基 , 90%；胎牛血清，10%。
泌乳素诱导蛋白表达下调对乳腺癌MDA-MB-453细胞迁移、粘附和侵袭的影响
照组 （ 未转 染 ） 荧 光 显 微 镜 观 察 转 染 效 率 ， 转 录 Ｐ Ｒ和 免 疫 细胞 化 学 技 术 检 测 转 染 ４ ｈ各 组 的 ＰＰ表 达 。 通 过 细 胞 实 验 分 ， 逆 Ｃ ８ Ｉ
别检测转染 ＰＰｓ Ｎ ８ Ｉ—Ｒ Ａ ４ ｈ乳腺癌细胞 的迁 移 、 附和侵袭 能力 。结果 ｉ 粘
ｇ ａｉ ｎ，ａ ｈ ｓｏ ｎ ｎ ａ ｉｎ ｏ ｕ ｎ ｂ ｅ ｓ ａ ｃ ｒ ＭＤＡ— ｒｔ ｏ ｄ ｅ ｉｎ ａ ｄ ｉｖ ｓｏ ｆｈ ｍａ ｒ ａ ｔｃ ｎ ｅ ＭＢ４５ ｅ ｌ．Ｍ ｅ ｈ ｄ Ｐ Ｐ ｓＲＮＡ，ｃ ｎ ｒ ｌｓＲ ｎ ｌｎ —ｉ ３ｃｌ ｓ ｔｏ ｓ Ｉ —ｉ ｏ ｔ —ｉ ＮＡ ａ ｄ ｂ ａ ｋ ｓＲＮＡ ｏ ｗｅｅ ｔ ｎ ｆｃ ｅ ｎ ｏ ｈ ｍａ ｒ ａ ｔｃ ｎ ｅ ｒ ｒ ｓｅ ｔｄ ｉ ｔ ｕ ｎ ｂ ｅ ｓ ａ ｃ ｒＭＤＡ— ４５ ｅｌ ｈ ｏ ｇ ｉ ｏ ｏ ｓｅ ｐ ｒ ｎ ｒ ｕ ａ ＭＢ ３ ｃ ｌ ｔ ｒ ｕ ｈ ｌｐ ｓ ｍｅ ａ ｘ ｅ ｉ ｓ ｍｅ ｔ ｏ ｐ，ｎ ｇ ｔ ｅ ｃ ｎ ｒ ｌ ｒ ｕ ｎ ｌｎ ｇ ｅ ａｉ ｏ ｔｏ ｏ ｐ ａ ｄ ｂ ａ ｋ ｖ ｇ
【 ｂｔａ ｔ Ｏｂｅｔ ｅ ｏｉ ｅｔ ａ ｅｉ ａｔ ｏ ｒｌ ｔ — ｄｃｂ ｒｔ ｎ（ Ｉ ）ｄｗ ｒ ｕａｉ ｎｃｌ ａｉｔ ｓ ｆ ｉ Ａ ｓ ｃ】 ｒ ｊｃ ｖ Ｔ ｖｓｇｔ ｔ ｃ ｆ ｏ ｃｉ ｉ ｕｉｌ ｐｏ ｉ ＰＰ ｏ ｎｅ ｌ ｏ ｏ ｅ ｂｌｉ — ｉ ｎ ｉ ｅ ｈ ｍｐ ｓ ｐ ａ ｎ ｎ ｅ ｅ ｇ ｔｎ ｌ ｉｅ ｏ ｍ
ｎ ａ ｇ Ｍ ｉ ｔ ｒ ｍｍａｎ ｙ ｎ ｌ ａ ｙ Ｃｏ ｉ ｄ，Ｓ ｅ ｙ ｎ ０８ ｈ ｎ ａ ｇ １ ４０，Ｃｈ ｎ １ ｉａ Ｃｏ ｒｓ ｎ ｉｇ ｕ ｈ ｒ ｒｅｐｏ ｄ ｎ ａ ｔ ｏ ：ＸＩ Ｘｉ 一 ， ，Ｅ— ｉ ：ｘ ｅ ｉ ｏ ｏ ｇ＠ ＣＣ ．ｏｇ． ｎ Ｅ ａｏ ｍａ ｌ ｉｘ ａ ｄ ｎ ＳＯ ｒ ｃ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响作者：陈舒颖廖明杨丽娜来源：《中国实用医药》2019年第28期【摘要】目的探讨TET1蛋白对乳腺癌细胞株MDA-MB-453增殖的影响。
方法将TET1的稳转细胞株（MDA-MB-453-TET1）和其阴性对照组稳转细胞株（MDA-MB-453-NC）通过慢病毒载体构建出来，采用RNA的反转录（RT）-聚合酶链式反应（PCR）及蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测TET1的表达情况。
细胞增殖实验（CCK-8法）检测细胞增殖;Western blot检测上皮间充质转化（EMT）相关蛋白[上皮细胞钙粘蛋白（E-cadherin）、N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、β-链蛋白（β-catenin）]的呈现。
结果阴性对照组与空白对照组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
MDA-MB-453-TET1组E-cadherin（2.98±0.11）、TET1 mRNA（5.36±0.02）及TET1（12.3±0.41）均显著高于阴性对照组的（0.98±0.21）、（1.25±0.08）、（4.21±0.09）与空白对照组的（0.95±0.2）、（1.23±0.04）、（4.19±0.10）， N-cadherin（0.08±0.02）、Vimentin（4.41±0.18）、β-catenin（0.05±0.002）均低于阴性对照组的（0.10±0.01）、（9.98±0.52）、（0.11±0.02）与空白对照组的（0.11±0.02）、（9.97±0.45）、（1.23±0.04），差异均有统计学意义（P<0.05）。
阴性对照组與空白对照组OD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
MDA-MB-453-TET1组OD值低于阴性对照组与空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
结论 TET1可抑制MDA-MB-453细胞增殖，其机制可能与通过Wnt/β-catenin通路抑制EMT的发生相关。
【关键词】乳腺癌;细胞株MDA-MB-453;TET1蛋白;细胞增殖DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2019.28.113TET蛋白是存在于生物体内的一种双加氧酶，其不但能使5-甲基胞嘧啶转变为5-羟甲基胞嘧啶，同时还是DNA去甲基化过程中必不可少的一种酶，这种酶在保持干细胞的多能性时也有着相当重要的用处[1]。
该家族主要包括3种蛋白酶，即TET1、TET2和TET3，其中TET1蛋白参与肿瘤的增殖及侵袭转移过程[2]。
通过体外实验研究TET1对乳腺癌细胞增殖能力的影响，为研究乳腺癌的发生提供一定的参考。
1 材料与方法1. 1 试剂人乳腺癌细胞株MDA-MB-453与人胚肾HEK 293T慢病毒包装细胞（深圳市百恩维生物科技有限公司提供）;DMEM培养液（武汉普诺赛生命科技有限公司提供）;胎牛血清（武汉普诺赛生命科技有限公司提供）;Ⅱ型胶原酶（上海玉博生物科技有限公司提供）;胰蛋白酶及基质胶与Mdivi-1（上海玉博生物科技有限公司提供）;兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin一抗、羊抗兔荧光二抗、羊抗鼠荧光二抗均购自美国Sigma公司。
1. 2 方法根据慢病毒的包装试剂外壳的使用说明来操作，把转染的293T细胞培育72 h，然后将培育中的清液收集起来，即是慢病毒液。
然后把感染靶细胞（MDA-MB-453）用嘌呤霉素做一次详细的挑选，从中取得MDA-MB-453-TET1组和阴性对照组（MDA-MB-453-NC）;最后用未感染的细胞作为空白对照组。
三组分别选取2×106个细胞进行分析，对三组细胞进行增殖实验。
按照TET1试剂盒说明书进行操作。
制备电泳胶，将电泳胶放入电泳槽，在聚合酶链式反应（PCR）热循环仪中将其逆转录为互补脱氧核糖核酸（cDNA）。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，上游5'-GAAGTCACCCGCGTGCTAAT-3'，下游5'-TCACTGCTCCCGAATGTCT-3';TET1上游5'-GTGTGATGAGCCCAAGGA-3'，下游5'-GCAGTTGGCTCGCATCATAG-3'。
PCR反应条件：在95℃10 min， 95℃50 s， 52℃50 s，72℃3 min，重复37个循环， 72℃延伸反应20 min，计算TET1信使RNA（mRNA）水平相对表达量。
提取细胞总蛋白，然后作十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），再转膜，在其中添加对应一抗，以4℃的温度放置一晚。
第2天进行含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBST）漂洗，加入二抗，室温孵育2 h，增强化学发光法（ECL）显色，计算蛋白水平的相对表达量。
将对数生长期细胞，按1×103个细胞的量加入到96孔板里面，放入CCK-8后进行细胞培养，时间的设定为0、12、24、36和72 h，根据时间长短的排序依次放入CCK-8试剂10 μl/孔， 37℃、5%CO2细胞培养箱中过夜培养;酶标仪上检测各孔450 nm处的光密度（OD）值。
这一实验过程最少要进行3次以上，然后根据实验结果对实验数据作统计学分析和研究。
1. 3 观察指标比较三组RT-PCR及Western blot法检测结果以及细胞增殖能力检测结果。
1. 4 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。
所获数据均符合正态分布规律，计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示，采用t检验;计数资料以率（%）表示，采用χ2检验。
P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果2. 1 三组RT-PCR及Western blot法检测结果比较阴性对照组与空白对照组E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-catenin、TET1 mRNA及TET1表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
MDA-MB-453-TET1组E-cadherin、TET1 mRNA及TET1表达水平均显著高于阴性对照组与空白对照组， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表达水平均低于阴性对照组与空白对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。
见表1。
2. 2 三组细胞增殖能力检测结果比较阴性对照组与空白对照组OD值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
MDA-MB-453-TET1组OD值低于阴性对照组与空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论研究表明[3]， TET1可以调控DNA去甲基化，参与肿瘤的侵袭和转移。
EMT可导致肿瘤细胞离开原发部位，经过血液循环或淋巴循环移动到其他地方。
在这个过程中，肿瘤细胞得到了间质细胞才有的迁徙能力，这是由于肿瘤细胞的上皮型标志物E-cadherin的表达呈下降趋势，间质型标志物Vimentin和N-cadherin的表达呈上升状态而导致的。
大量研究表明， E-cadherin的启动子区域有超甲基化这一现象，这也被视作是引起E-cadherin表达呈下降趋势的一大主要影响因素。
TET1经过调整EMT相关蛋白的表达来影响乳腺癌的侵袭和移动[4-6]。
本研究中TET1在MDA-MB-453-TET1组出现高表达，阴性对照组与空白对照组出现低表达，说明MDA-MB-453-TET1的构建比较成功。
MDA-MB-453-TET1细胞中E-cadherin表现是一种高表达， N-cadherin、Vimentin、β-catenin表现是一种低表达。
实验表明， TET1能经过调节EMT影响乳腺癌的侵袭和移动，然后经过推进乳腺癌细胞向上皮样表型转化，提高E-cadherin的表达增强细胞间的黏附能力，最终使N-cadherin、Vimentin和β-catenin減少，从而抑制EMT发生。
CCK-8法进行检测乳腺癌细胞株增殖能力实验中，在接种细胞24、36、72 h后MDA-MB-453-TET1组的细胞生长速度明显减慢。
说明TET1的过表达抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞的增殖。
综上所述， TET1可抑制MDA-MB-453细胞增殖，其机制可能与通过EMT相关蛋白通路抑制EMT的发生相关。
参考文献[1] 段红洁，张爱民，牛秀珑，等. IFN-γ和IL-4对人乳腺癌细胞系MCF-7成瘤性、黏附能力的影响及其机制. 中国肿瘤生物治疗杂志， 2015， 22（5）：597-602.[2] Chen HF， Wu KJ. Epigenetics， TET proteins， and hypoxia in epithelial-mesenchymal transition and tumorigenesis. BioMedicine（Taipei）， 2016， 6（1）：1-8.[3] Huang Y， Chavez L， Chang X， et al. Distinct roles of the methylcytosine oxidases Tet1 and Tet2 in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（4）：1361-1366.[4] 张萌萌，李雅琪，张硕，等. TET1蛋白对人乳腺癌MDA-MB-231细胞株增殖和侵袭能力的影响及其相关机制. 肿瘤防治研究， 2017， 44（7）：447-453.[5] Jeschke J， Collignon E， Fuks F. Portraits of TET-mediated DNA hydroxymethylation in cancer. Curr Opin Genet Dev， 2016， 36（36）：16-26.[6] Yang H， Liu Y， Bai F， et al. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation. Oncogene， 2013， 32（5）：663-669.[收稿日期：2019-03-06]。