金乌健骨方对胶原诱导性关节炎大鼠血清炎症因子的影响

2结果 2. 1 一般情况变化 空白组大鼠随着饲养时间的延长，体重 增加、活动自 如、皮 毛 光 泽、精 神 状 态 良 好，无 异 常 状 态 出 现。 模型组大鼠毛发干枯无光泽、饮食量及饮水量减少、精神萎靡， 后期可见行走困难及关节活动障碍等。雷公藤多苷组及金乌 健骨方各剂量组大鼠的饮食情况、精神状态及关节活动障碍均 较模型组好。 2. 2 体重变化及左后足踝关节容积比较 造模前，各组大鼠 体重关节大小无差异（ P＞0. 05） ，灌胃 2 w 后体重比较，与空白 组大鼠比较，模型组、雷公藤多苷组及金乌健骨方低、中、高剂 量组大鼠体重增长减慢，灌胃 4 w 后模型组体重增长明显低于 空白组（ P＜0. 05） ，见表 1。关节肿胀于造模后 4 ～ 5 d 出现，模 型组大鼠于第 3 周关节肿胀达到高峰，治疗组大鼠均于第 2 周
Effects of the Miao traditional medicine Jinwu Jiangu Decoction on inflammatory factors of collagen-induced arthritis rat LONG Xiao-Qin，LU Dao-Min，MA Wu-Kai. Graduate School，Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550002，Guizhou，China
基金项目： 贵州省社会发展攻关计划课题 （ No. 2010GZ66925 ） ； 贵州省 中医药管理局课题（ No. 2010021） ； 贵州省中医药民族医药重 点学 科 项 目； 贵 阳 中 医 学 院 研 究 生 创 新 计 划 项 目 （ No. ZYYCX11006）
1 贵阳中医学院第二附属医院 通讯作者： 马武开（ 1968-） ，男，教授，医学博士，硕士生导师，主要从事
〔关键词〕 金乌健骨方； 胶原诱导型关节炎； 白介素（ IL） -1； IL-1β； 肿瘤坏死因子-α 〔中图分类号〕 Ｒ68 〔文献标识码〕 A 〔文章编号〕 1005-9202（ 2014） 15-4246-03； doi： 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 15. 065
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中国老年学杂志 2014 年 8 月第 34 卷
金乌健骨方（ 贵阳中医学院研究生院，贵州 贵阳 550002）
〔摘 要〕 目的 探讨金乌健骨方对胶原诱导性关节炎（ CIA） 大鼠血清炎症因子的影响。方法 60 只 SD 雌性大鼠随机分为空白组、模型组， 雷公藤多苷组及金乌键骨方低、中、高剂量组，每组 10 只，CIA 造模成功后，空白组和模型组给予生理盐水灌胃，雷公藤多苷组给予雷公藤多苷水溶 液，金乌健骨组分别给予 3 570、7 500、15 000 mg / kg 剂量灌胃，观察各组大鼠一般行为表现，酶联免疫蛋白吸附法（ ELISA） 法检测白介素（ IL） -1、IL1β 及肿瘤坏死因子（ TNF） -α 的水平，观察 CIA 大鼠关节病理、关节炎指数变化。结果 CIA 大鼠造模成功，金乌健骨方能够抑制 CIA 大鼠关节肿 胀，血清中 IL-1、IL-1β 及 TNF-α 表达显著降低，明显减轻关节滑膜细胞增生、滑膜层及滑膜下层淋巴细胞浸润。结论 金乌健骨方对类风湿关节炎 具有一定的治疗作用，其作用途径可能与干预血清中 IL-1、IL-1β 和 TNF-α 的水平有关。
【Key words】 Jinwu Jiangu Decoction； Collagen induced arthritis； IL-1； IL-1β； TNF-α
苗药金乌健骨方由金毛狗脊、乌梢蛇、千年健、黑骨藤、青 风藤、姜 黄、白 芍、三 七 粉 等 药 物 组 成，具 有 温 肾 助 阳、散 寒 通 络、活血止痛之功效。前期的临床研究显示苗药金乌健骨方能 够改善类风湿关节炎（ ＲA） 患者的临床症状和体征〔1〕，尤其在 降低抗风湿 药 如 甲 氨 蝶 呤 等 的 毒 副 作 用 方 面 显 示 了 较 好 疗 效〔2〕。本实验观察金乌健骨方对胶原诱导关节炎 （ CIA） 大鼠 血清炎症因子白介素-1（ IL-1） 、白介素-1β（ IL-1β） 和肿瘤坏死 因子-α（ TNF-α） 表达的影响，研究金乌健骨方治疗 ＲA 的机制。
1 材料与方法 1. 1 动物 成年健康雌性 Wistar 大鼠 60 只，体重（ 173±20） g， 由重庆 滕 鑫 生 物 技 术 有 限 公 司 提 供，合 格 证 号： SCXK （ 渝） 2009001 。各组大鼠在相 同 条 件 下 自 由 饮 食、摄 水。 饲 料 来 源 于贵阳医学院实验动物中心。 1. 2 主要试剂、仪器 牛二型胶原、完全弗氏佐剂（ 美国 Sig-
风湿免疫学研究。 第一作者： 龙小琴（ 1985-） ，女，在读硕士，主要从事风湿免疫学研究。
ma 公司） ； 醋酸（ 无锡飞鹏精细化工有限公司） ； IL-1、IL-1β 及 TNF-α 酶免免试剂盒（ 北京惠康生物科技有限公司） ； 低温冷冻 离心机（ 德国 eppendorf） ； 冰箱（ 日本三洋） ； 酶标仪（ BioTek 品 牌，型号： Synergy 2 TM） ； 电子秤（ 上海酬勤实业有限公司） ； 大 鼠足趾容积测量仪（ 淮北正华生物仪器设备有限公司） 。 1. 3 实验药物 ①金乌健骨方： 金毛狗脊 15 g，乌梢蛇 10 g， 千年健 15 g，黑骨藤 9 g，青风藤 30 g，姜黄 20 g，白芍 30 g，三七 粉 3 g（ 生药购自贵阳中医学院第二附属医院） 等 8 味中药组 成。金乌健骨方浓缩液按处方比例提取，浓缩至 1. 5 g / ml，4℃ 冰箱保存供实验用。②雷公藤多苷： 湖南协力药业有限公司生 产，临 用 时 充 分 研 磨 后 用 蒸 馏 水 配 成 混 悬 液，浓 度 为 1. 2 mg / ml。 1. 4 动物分组 60 只 SD 雌性大鼠，适应性喂养 3 d 后，随机 分为空白组，模型组，雷公藤多苷组及金乌健骨方低、中、高剂 量组共 6 组，每组 10 只。 1. 5 造模 实验前 1 d 用牛Ⅱ型胶原溶于 0. 1 mol / L 醋酸中， 4℃ 冰箱过夜，按 2 mg / ml 比例与弗氏不完全佐剂 1 ∶1充分混 合乳化。取适量牛Ⅱ型胶原溶液（ 浓度 2 mg / ml） 逐滴加入至 等容积的不完全弗氏佐剂中，终浓度为 1 mg / ml。冰浴中充分 乳化，以滴入水中不扩散为度，取乳化后的混合物按 0. 3 ml 注 射。7 d 后按 0. 2 ml / 只，于尾根部皮下加强免疫 1 次〔3〕。 1. 6 给药 从第 2 次免疫后第 1 天开始给药，空白组和模型 组大鼠给予蒸馏水灌胃，2 ml / 次，1 次 / d； 雷公藤多苷组给予雷
龙小琴等 金乌健骨方对胶原诱导性关节炎大鼠血清炎症因子的影响 第 15 期
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公藤多苷水溶液，剂量为 6 mg / kg，2 ml / 次，1 次/ d； 金乌健骨方低、 中、高剂量组分别给予不同质量浓度的金乌健骨方浓缩液 （ 3 570、7 500、15 000 mg / kg） ，2 ml / 次，1 次/ d，各组均连续灌胃 28 d。 1. 7 观察指标 ①一般行为表现： 动物神态、毛色、活动情况、 饮食及饮水量、大小便。②体重： 分别于造模前 1 d 用电子天平 称量各组动物体重以后每周称量 1 次。③关节肿胀程度： 分别 于造模前 1 d 用大鼠足趾容积测量仪测量各组大鼠左后足踝关 节容积。肿胀率 = 造模后足踝关节容积 －造模前足踝关节容 积 / 造模前足踝关节容积×100% 。末次灌胃 24 h 以后，予乌拉 坦按大鼠体重以 0. 4 ml /100 g 予腹腔内注射麻醉，股动脉抽血 4 ～ 6 ml，室温静置 30 min 后 3 000 r / min 离心 15 min，用吸液管 取血清，置于冻存管－20℃ 冰箱待测。④放射酶联免疫学方法 （ ELISA） 测定血清 IL-1β、IL-1、TNF-α 水平（ 严格按照说明书操 作） ⑤取 CIA 大鼠右膝关节滑膜及部分软骨放于 4% 甲醛固 定，8% EDTA 溶液脱钙，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，HE 染 色。光镜下观察普通病理变化。 1. 8 统计学方法 采用 SPSS17. 0 统计软件分析，计量资料采 用x±s 表示，符合正态分布和方差齐性组间比较应用单因素方差 分析，不符合正态分布的组间比较应用多个样本的非参数检验。
【Abstract】 Objective To explore the effect of the Miao traditional medicine Jinwu Jiangu Decoction on serum inflammatory factors in collagen-induced arthritis （ CIA） rat. Methods CIA models were established to observe the Miao traditional medicine Jinwu Jiangu Decoction on CIA rat ankle pathology，arthritis index and serum TNF-α，IL-1，IL-1 β levels. Ｒesults Miao traditional medicine Jinwu Jiangu Decoction could inhibit CIA rats toe swelling，reduce arthritis index，and reduce the serum levels of TNF- α，IL-1and IL-1β，reduce the synovial cells proliferation，synovial layer and synovial lower lymphocyte infiltration. Conclusions Miao traditional medicine Jinwu Jiangu Decoction can treat rheumatoid arthritis，whose function may be related to its prevention from serum IL-1，IL-1β and TNF-α.