链霉素发酵工艺验证方案要点
链霉素的生产工艺
链霉素的生产工艺1. 引言链霉素是一种广泛应用于临床的抗菌药物，具有广谱的杀菌作用，特别对革兰氏阳性细菌具有较强的抑制作用。
链霉素的生产工艺是一个复杂的过程，涉及到选材、培养、分离提取、精制等多个步骤。
本文将详细介绍链霉素的生产工艺。
2. 选材链霉素的生产一般选用链霉菌（Streptomyces sp.）作为生物发酵的菌种。
选材时，需要从自然环境中筛选出链霉菌，通过生化和遗传性状鉴定确定其属于链霉菌属。
在选择菌种时，需要考虑菌株的抗性、生长速度、产量等因素。
3. 培养链霉菌的培养过程一般包括前处理、发酵、产霉和分离等步骤。
3.1 前处理前处理的目的是为了提高菌种的活力和发酵能力。
首先，将菌种预培养于适宜的培养基中，培养时间为24-48小时。
然后，将菌种转移到发酵培养基中，再次培养24-48小时，使菌种适应发酵培养条件。
3.2 发酵发酵是链霉菌生产链霉素的关键步骤。
发酵培养基的组成对链霉素的产量和质量有着重要影响。
发酵培养基一般包括碳源、氮源、矿质盐和调节剂等成分。
发酵过程一般分为两个阶段：生长期和产霉期。
生长期主要是链霉菌的生长和繁殖，产霉期主要是链霉菌产生链霉素的阶段。
发酵过程需要控制温度、pH、氧气供应等条件，以保证菌体的生长和链霉素的产量。
3.3 产霉产霉是指在发酵完成后，将产生链霉素的链霉菌和发酵液分离的过程。
产霉一般通过离心、过滤、提取等方法实现。
离心可以将链霉菌从发酵液中分离出来，过滤则可去除菌体，提取则能将链霉素从菌体中提取出来。
4. 分离提取分离提取是将链霉素从发酵液中纯化的过程。
分离提取一般包括固液分离、溶剂提取、浓缩纯化等步骤。
固液分离通过离心或过滤将发酵液中的固体菌体分离出来。
溶剂提取是利用溶剂对发酵液进行提取，一般采用醇类、酮类、醚类等有机溶剂。
浓缩纯化是将溶剂提取得到的链霉素溶液通过浓缩器等设备进行浓缩和纯化，以获得链霉素的纯品。
5. 精制链霉素的精制是指对链霉素进行进一步纯化和提升质量的过程。
灰色链霉菌生产链霉素的发酵工艺优化
０． ７ ５、 Ｎａ Ｃ１ ２， Ｃａ ＣＯ ０． ７， ｐ Ｈ ７． ５。
发酵 水平 徘 徊 不 前 ， 普遍存在生产成 本高、 发 酵 周 期长 、 产量 稳定 性差 等 问题 。 近年来 ， 人 们 对 无 公 害 农 产 品 的需 求 不 断 增
法， 研 究摇 瓶发 酵 中菌龄 、 接 种量 、 装液量 、 温度 、 初
１ ． ３ 培 养条件
１ ． ３ ． １ 菌种 的斜 面培 养
无菌条件下 ， 一 ８ ０ ｏ 【 ＝ 超低温冰箱保藏的孢子甘
油管 ， 取２ ０ ０ Ｉ ． Ｌ Ｌ涂 布 于斜 面 ， 置于 ３ ０℃ 的培 养 箱 中， 相对湿 度 ４ ０ ％ 一６ ０ ％， 依 菌 落 生长 情 况 培养 ７～
为２ ８℃ ， 在此条件下发酵液 中链霉素产量 约为 ８ ８ ０ Ｕ ／ ｍ Ｌ ， 较优化前提高近 １ ０ ％。
关键词
链霉 素
灰 色链 霉菌
发酵工艺 文献标 志码
优化 Ａ
中图法分类号
Ｔ Ｑ ４ ６ ５ ． ２ ；
链霉 素 （ Ｓ ｔ ｒ ｅ ｐ ｔ ｏ ｍ ｙ ｃ ｉ ｎ ） 是 一 种 由灰 色 链 霉 菌 发 酵产 生 的氨基 糖苷 类 抗 生 素 ¨ Ｊ ， 它 主要 是 与原 核 细 胞（ 如细 菌 ） 核 糖体 ３ ０ Ｓ亚单 位 结 合 ， 干 扰 细 菌蛋 白 质 的合成 ， 从 而杀 灭 细 菌或 抑 制 细 菌 生 长 Ｊ 。在 医 学上 ， 主要 用 于 治 疗 结 核 杆 菌 感 染 Ｊ ， 还 可用 于 治 疗多 种 革 兰 氏 阴性 菌 所 引 起 的 感 染 ， 如 大 肠 埃 希 菌、 克 雷 伯 菌属 、 变形 杆 菌 属 等 Ｊ 。２ ０世 纪 ５ ０—８ ０ 年代 ， 链霉 素 的大 规模 发 酵 生 产 发 展 迅 速 ， 为人 类 作 出了不 可磨 灭 的 贡献 。但 近几 十 年 来 ， 由于 链 霉 素耳 毒性 的发 现 ， 其 应 用 受 到 了极 大 限 制 Ｊ ， 致 使
以黄豆饼粉为原料的链霉素工程发酵设计
以黄豆饼粉为原料的链霉素工程发酵设计以以黄豆饼粉为原料的链霉素工程发酵设计为标题，本文将介绍该工程发酵的设计过程和相关要点。
第一部分：引言链霉素是一种广泛应用于畜禽养殖和人类医药领域的抗生素，其生产通常通过微生物发酵得到。
而黄豆饼粉作为一种廉价的原料，具有丰富的蛋白质和碳水化合物，成为链霉素工程发酵的理想选择。
本文将围绕以黄豆饼粉为原料的链霉素工程发酵设计展开讨论。
第二部分：黄豆饼粉的优势黄豆饼粉作为链霉素发酵的原料，具有以下几个优势：1. 丰富的蛋白质：黄豆饼粉中含有丰富的优质蛋白质，可为链霉素的合成提供充足的氮源。
2. 合适的碳源：黄豆饼粉中的碳水化合物可以作为链霉素合成过程中的碳源，提供能量和碳骨架。
3. 廉价易得：黄豆饼粉作为农产品副产物，价格相对较低，易于大规模应用。
第三部分：工程发酵设计1. 菌种的选择：链霉素的生产菌株通常选择链霉菌属中的某些菌株，如Streptomyces aureofaciens。
菌株的筛选应考虑其产量、稳定性和抗性等特性。
2. 发酵条件的优化：发酵条件的优化对于提高链霉素产量至关重要。
包括温度、pH值、氧气供应、搅拌速度、发酵时间等因素的调控，都会对链霉素合成产量产生影响。
3. 预处理工艺：黄豆饼粉需要进行适当的预处理，以提高其可溶性和可利用性。
常见的预处理方法包括研磨、蒸煮、酶解等，以释放出黄豆饼粉中的有效成分。
4. 发酵培养基的配方：发酵培养基的配方应根据菌株的需求和黄豆饼粉的特性进行合理设计。
需要考虑碳源、氮源、微量元素和调节剂等成分的添加，以满足链霉素生产的需求。
5. 发酵过程的监控：发酵过程中需要对关键参数进行监测和控制，以确保菌体生长和链霉素合成的顺利进行。
常用的监测指标包括菌体干重、链霉素产量和消耗情况等。
6. 下游处理：链霉素的生产通常包括发酵、提取、纯化等步骤。
下游处理的优化可有效提高链霉素的纯度和产量。
第四部分：发酵工程的应用前景以黄豆饼粉为原料的链霉素工程发酵设计具有广阔的应用前景：1. 农业领域：链霉素作为一种广谱抗生素，可应用于畜禽养殖中，预防和治疗动物疾病，提高养殖效益。
年产吨硫酸链霉素工业盐发酵车间的工艺设计
年产吨硫酸链霉素工业盐发酵车间的工艺设计引言硫酸链霉素是一种广泛应用于生物医药领域的重要抗生素，工业盐发酵是其生产的关键步骤之一。
本文档将详细介绍年产吨硫酸链霉素工业盐发酵车间的工艺设计。
工艺流程年产吨硫酸链霉素工业盐的发酵车间的工艺流程如下：1.培养基的制备：首先制备硫酸链霉素发酵所需的培养基。
培养基的成分包括葡萄糖、酵母浸出物、硫酸链霉素种子等。
2.接种与发酵：将硫酸链霉素种子接种到预先准备的发酵罐中，以合适的温度和pH值下进行发酵。
过程中需要进行搅拌和通气。
3.发酵液的处理：发酵结束后，将发酵液进行离心分离，分离得到固体废料和发酵液。
发酵液中含有的硫酸链霉素应经过精制处理。
4.硫酸链霉素工业盐的提取和精制：对发酵液中的硫酸链霉素进行提取和精制，得到纯度较高的硫酸链霉素工业盐。
5.产品的包装和储存：将提取得到的硫酸链霉素工业盐进行包装，并进行质量检验。
合格的产品需要储存以待出售。
设备需求为了实现年产吨硫酸链霉素工业盐的生产目标，以下是车间所需的主要设备：1.发酵罐：用于接种和发酵硫酸链霉素种子的容器。
应具备合适的体积和搅拌装置，以确保发酵过程的充分混合和通气。
2.离心机：用于将发酵液中的固体废料和发酵液进行分离。
3.提取设备：用于对发酵液中的硫酸链霉素进行提取和精制。
可以采用逆流萃取或其他适用的提取方法。
4.包装机：用于对提取得到的硫酸链霉素工业盐进行包装，并提供符合产品质量要求的包装形式。
除了以上主要设备外，还需要考虑车间的通风设备、配电系统和工业管道等设施。
工艺条件为了确保该车间的工艺能够高效运行，需要满足以下工艺条件：1.温度控制：发酵过程中，温度是影响硫酸链霉素产量和质量的重要因素。
应根据具体的发酵条件，采取相应的温度控制措施。
2.pH控制：适宜的pH值也是影响硫酸链霉素发酵的重要因素。
车间应配置自动pH控制系统，确保发酵过程中pH值的准确维持。
3.通气控制：发酵过程需要充足的氧气供应和二氧化碳排放。
链霉素生产工艺设计
发酵工厂工艺课程设计题目：5000t链霉素生产工艺设计课程名称：发酵工厂工艺设计概论学院：药学与生物工程学院班级： 112100101学号： 20姓名：指导老师：二零一五年五月目录1前言 (4)2设计任务书 (5)2.1本课程设计的性质、目的 (5)2.2本课程任务： (5)2.3基本要求： (5)2.4 基础数据： (5)2.5设计内容： (6)2.6参考数据及公式 (6)3厂址选择 (7)3.1厂址选择主要考虑的几个因素 (7)3.2厂址的最终选择 (7)3.3厂址卫星图 (8)4工厂总平面设计 (8)4.1工厂的平面设计图见附表： (8)5工艺流程简图及说明论证 (8)5.1发酵工艺 (8)5.1.1斜面孢子培养 (8)5.1.2 摇瓶种子培养 (9)5.1.3 种子罐扩大培养 (9)5.2 链霉素发酵条件及中间控制 (9)5.2.1溶氧的影响及控制 (9)5.2.2 温度 (10)5.2.3 pH值 (11)5.3 提取工艺 (11)5.4工艺流程简图如下： (12)6工艺计算 (13)6.1物料衡算 (13)6.2热量衡算 (14)6.2．1.对于生产1000kg链霉素产品，利用直接蒸汽混合加热，蒸汽消耗量为： (14)6.2．2.发酵罐空罐灭菌时的蒸汽消耗量估算： (15)6.2．3.发酵罐实罐灭菌保温时的蒸汽消耗量估算： (15)6.3耗水量的计算 (16)7发酵车间设备的选型计算 (17)7.1发酵罐的设计 (17)7.1.1发酵罐的选型及尺寸 (17)7.2设备结构的工艺设计 (18)7.2.1 空气分布器 (18)7.2.2 挡板 (18)7.2.3搅拌器设计 (18)7.2.4电机设计及轴功率的计算 (19)7.2.5冷却面积的计算与冷却管的设计 (20)7.2.6 PH测定 (22)7.2.7消泡 (22)7.2.8观察窗口 (22)7.2.9液面高度显示管安装 (22)7.2.10封头连接方式 (23)7.2.11密封方式 (23)8对本设计的评述 (23)9个人心得 (24)10参考文献 (24)1前言链霉素（Streptomycin）是瓦克斯曼（Waksman S.A.)于 1944 年从灰色链霉菌（Streptomyces,griseus）培养液中分离出来的一种碱性抗生素。
链霉素的发酵工艺
链霉素的发酵工艺引言链霉素是一种广谱抗生素，对于多种细菌感染具有很高的疗效。
链霉素的制备主要通过发酵工艺进行，本文将介绍链霉素的发酵工艺流程及关键环节。
发酵工艺流程链霉素的发酵工艺通常包括以下几个步骤：1.培养基准备2.发酵罐的接种3.发酵过程控制4.分离与提取5.链霉素的纯化下面将详细介绍每个步骤。
1. 培养基准备培养基是链霉素发酵的基础，适当的培养基能够为菌株提供所需的营养物质。
常用的链霉素发酵培养基包括以下成分：•碳源：如葡萄糖、淀粉、玉米粉等。
•氮源：如酵母提取物、蛋白胨等。
•矿盐：如硫酸镁、磷酸二氢钾等。
•缓冲剂：如磷酸钠、氢氧化钠等。
•辅助物质：如抗泡剂、表面活性剂等。
将以上成分按比例配制成适当的液体或固体培养基。
2. 发酵罐的接种在发酵过程中，将培养基接种菌株，并将接种样品转移到发酵罐中。
接种时需注意保持接种器具的无菌，以避免杂菌污染。
将接种物均匀地加入发酵罐中，并控制接种量，一般为培养基总容积的2-5%。
3. 发酵过程控制发酵过程的控制是链霉素发酵的关键环节之一。
以下是常见的控制参数：•温度控制：链霉素的适宜生长温度为28-32摄氏度，需保持恒定的温度。
•pH值控制：链霉素的适宜pH范围为6.0-7.5，需通过添加酸碱来控制发酵液的pH值。
•溶氧量控制：链霉素发酵对氧气需求较高，需通过控制搅拌速度和通气量来维持适宜的溶氧量。
•发酵时间控制：链霉素的发酵时间通常为48-72小时，需控制好发酵时间，避免过度生长。
监测并控制这些参数，可以提高链霉素的产量和质量。
4. 分离与提取发酵结束后，需要将发酵液中的链霉素分离出来。
常用的分离方法包括离心、过滤、沉淀和蒸发等。
接下来，对得到的链霉素进行提取处理，一般采用溶剂提取、结晶或萃取等方法，以获得链霉素的纯度。
5. 链霉素的纯化为了提高链霉素的纯度，可以采用色谱技术进行纯化。
常见的纯化方法包括硅胶柱层析、高效液相色谱以及逆流色谱等。
纯化完成后，对得到的链霉素进行干燥，制成成品。
微生物学实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵
实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵（一）目的要求了解抗生素发酵的基本过程。
了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
（二）基本原理链霉素是由灰色链霉菌(放线菌的一种)产生的一种氨基糖苷类抗生素，它既含有氨基糖苷，也含有氨基环醇的结构，属抗革兰氏阴性菌的抗生素。
抗生素液体发酵共分三大工序：菌种、发酵、提炼。
配合三个工序还有分析化验和有关产物测定。
菌种种子质量指标：无杂菌，全部形成孢子，摇瓶发酵效价达35000U/ml 以上(30℃，48 h 培养)，方可用于生产。
发酵抗生素发酵过程除需经常镜检排除杂菌污染外，接种12h 后，每2h 进行一次pH 、生物量、总糖、还原糖、氨基氮及抗生素效价测定。
一级种子质量指标：无杂菌，全部放线菌，菌丝粗壮整齐，无断裂；pH7.0~7.2。
二级发酵质量指标：菌丝粗壮整齐，无断裂，菌丝成网状；pH7.2；链霉素效价10000～35000U/ml 。
提炼砂子孢子 (4℃±1℃冰箱保存) 第一代孢子(28℃高氏1号培养基，培养5d) 第二代孢子 (28℃高氏1号培养基，培养5d) 种子罐发酵(一级，种子培养基) 30℃±2℃培养12~16h 发酵罐发酵(二级，发酵培养基) 28~30℃，培养48h 放罐 中和、氧化、过滤 发酵液 草酸酸化 板框压滤 滤液 加NaOH 中和 板框压滤 中和滤液 上离子交换柱 板框压滤 饱和树脂 1 mol/L H 2SO 4 解 吸 解吸液 中和氧化滤液 加氨水沉淀 离心甩干，洗去氨 链霉素游离碱 (白色沉淀) 加6 mol/L H 2SO 4调pH 6.0~6.5，溶解 加NaOH 及KMnO 4 链霉素硫酸盐喷雾干燥 白色粉末(成品)衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
链霉素发酵工艺技术
生物制药工程系毕业实习调研报告姓名：专业：班级：学号:指导老师：完成时间：目录链霉素的发酵工艺过程1、制备流程图 (1)2、链霉素详细过程 (2)3、链霉素制备注意事项 (8)4、参考文献 (8)链霉素的发酵工艺过程发酵工艺流程图：摘要：链霉菌在生产抗生素方面的特殊作用使它成为放线菌中遗传育种的核心，近年来的进展主要在于原生质体融合、脂质体的使用、质粒及其它载体的发现和克隆技术工业应用。
本文综述了链霉素生物合成途径、代谢调节机制、链霉素发酵的代谢调控育种及其进展。
关键词：链霉素；发酵；代谢调控链霉素是1944年从灰色链霉菌培养液中分离出来的一种碱性抗生素，我国于1958年以来大量生产，目前已形成了相当大的生产规模与能力。
传统工艺:链霉素早期的提取方法采用活性炭吸附法、带溶法、沉淀法、离子交换法。
目前国内外多采用离子交换法提取链霉素，其工艺流程如图:链霉素是由链霉胍、链霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺组成的三糖苷，属于氨基糖苷类抗生素。
链霉胍是在l，3-位置上带有2个孤基的l，3-去氧青蟹肌醇，去掉2个脒基后称为链霉胺。
链霉糖是带有支链的5’-脱氧五碳糖，在第3碳上有一个醛基。
N-甲基-L-葡萄糖胺是在第2碳上的-NH2被甲基化(-CH3NH)的L-葡萄糖胺。
这三糖连接的糖苷键都是α型的糖苷键。
链霉素发酵工业延续至今已有相当长的历史，和其它抗生素生产过程一样，它的菌体生长，产物形成等所涉及的一系列时刻变化着的生物化学和质量、能量传递过[1]使链霉素发酵表现出相当程度的不确定性。
同时又由于反应机理复杂，无合适的模型用以描述过程，使人们在其发酵操作上依赖经验甚于理论。
这给链霉素生产水平的提高带来了一定的困难，但同时又给基于理论分析提高生产提供了可能。
1 链霉素生物合成的途径及代谢调节机制1.1 链霉素的生物合成途径由D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如图1所示[2]从图l可看出，每生成1个链霉素分子都需消耗3个葡萄糖分子、7个HN3分子、2个CO2分子和l个甲硫氨酸分子。
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链霉素发酵工艺验证方案1.目的：确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备的发酵液能否达到中间体规格要求。
2.范围：此方案包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。
2.1验证地点：403车间发酵工段：2.2验证对象：2.2.1原斜面2.2.2代1、代2斜面2.2.3母瓶2.2.4子瓶2.2.5小小罐2.2.6小罐2.2.7中罐2.2.8大罐2.3验证步骤：确定验证方案，确定验证计划，内容、步骤，以便准确验证链霉素发酵系统。
3.验证措施概要：3.1生产记录：原斜面：冷藏期≤10天外观无菌外观集落:白色丰满、正常代1或代2斜面：冷藏期≤14天外观无菌外观集落：白色丰满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价68小时≥1700u/ml效价96小时≥3500u/ml效价120小时≥6700u/ml冷藏期≤5天菌龄50~64小时菌丝II—III子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价120小时≥7000u/ml效价144小时≥7500u/ml冷藏期≤7天菌龄30~44小时菌丝II—III小小罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5小罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥1200u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5中罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥1800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5大罐：放罐残糖≤2.0克/100毫升放罐残氮≤120毫克/100毫升放罐透光度≥40%放罐效价≥14000u/ml3.2原材料：生产过程中所用的各种原材料及其规格（见原材料一览表）3.3设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。
3.4以上所及设备的每一部分，必须在本次验证前确保经过适当鉴定（IQ/OQ），并且任何相关的测试装置经过校正。
3.5人员培训，作为验证研究的一部分，涉及生产链霉素发酵的每位职工均经GMP及有关岗位SOP培训。
4.生产程序和流程表：4.1生产过程的描述：4.1.1我厂用于生物合成链霉素的生产菌种为灰色链霉菌，为了保持菌种的生命活力和稳定性，将孢子保存于干燥的沙土内冷藏在2~4℃冰库内，或者将孢子制成牛奶悬浊液，密闭冷藏于～196℃液氮中。
每年对生产菌株进行两次自然分离，控制菌落变异率≤5%，并进行菌丝八代遗传稳定性考查，考查其母、子代谢及效价单位的稳定性。
挖取清洁海滩细沙（不能污染各种有机物），用自来水漂洗清洁，洗至漂出来的水澄清不浑浊为止，烘干、100目筛子过筛，用磁铁充分吸尽砂内铁屑备用，挖取郊区地面二尺深处的黄土（不能污染各种有机物），用自来水充分漂洗消毒，洗至漂出来的水澄清为止，烘干，120目筛子过筛,用磁铁充分吸尽土内铁屑备用。
以上处理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分装于玻璃试管（12×100mm），每支装1g，用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中，放消毒锅消毒，间歇灭菌三次，每次压力0.12MPa，温度122℃，时间1小时，消毒后置电烘箱烘干，110～120℃、4－5小时，外表明批号、日期备用，使用前为确保无菌起见，应按以上要求再消毒烘干一次。
取符合质量要求的孢子斜面一支，在无菌操作下,加入0.85%氯化钠无菌生理盐水1ml左右，用1#棒将表面孢子轻轻刮下（防止用力过重划破琼脂）摇匀，用1ml割头无菌吸管吸出，准确仔细地在每支无菌空白砂土管内加0.1ml孢子液（加入时应注意将吸管伸至接近沙土处，但又不能接触沙土，也不能使吸管口接触沙土管口及内壁）。
塞紧棉塞，将沙土敲松摊开，放在真空干燥器内（干燥器内放置氯化钙干燥剂）保持真空度0.10MPa，抽4支时维持抽干4小时，抽5支或以上时，抽干时间酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有无水氯化钙的广口瓶中盖紧密封，放2～4℃冰库中保存备用。
使用时采用干接法接种。
孢子沙土管有效使用期为2年。
市售新鲜牛奶离心三次，3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛奶置试管内115℃～117℃，0.07MPa，15－20分钟消毒。
将空白安培管洗净烘干，塞好棉花，置于消毒锅内121℃，60分钟，间隙灭菌三次，待用。
取符合质量要求的孢子斜面一支，加入无菌脱脂牛奶5～10ml，用2#棒轻轻将孢子刮下，用无菌吸管吸孢子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶，振摇10分钟,然后用1ml无菌吸管将珠子瓶内的孢子牛奶悬浊液加入无菌安培管中，0.3ml/支，做好标记存置于液氮中保存，存放有效期5年。
4.1.2种子组洁净工作台洁净等级100级，每三个月对尘埃粒子（≥0.5u的尘埃≤3.5粒/1L空气）、风速（≥0.35m/s）、无菌（定点开启双碟30分钟≤1个/碟）进行测定。
平时每次操作定点放置定点开启双碟30分钟，控制杂菌菌落≤1个/碟。
每天用前紫外光消毒一小时，每三个月调换消毒剂（1/600洁尔灭、75%酒精）。
4.1.3孢子斜面：取生产用之孢子沙土管或孢子冷冻管在无菌室内，用操作棒勺取适量孢子接种于斜面培养基上，尽量将孢子涂开使长单个集落，然后于27±1℃恒温室内培养6—7天，该生长成之孢子斜面称为原斜面，仅作孢子传代使用，不能制备母瓶，液氮冷冻孢子接出原斜面。
根据质量情况可酌量考虑制作母瓶，有效使用期在2—4℃冷藏中不超过10天。
斜面外观除了个别不正常集落以外，应大部份为白色，丰满梅花型，馒头型、圆型之集落，将原斜面孢子，挑选2—3只正常集落点种第一代，用第一代传代斜面同样点种第二代传代斜面，第一第二代孢子斜面，培养条件均为27±l℃恒温室内培养6～7天，第一、第二代斜面有效使用期为14天，均可制作母瓶，孢子斜面传到第二代为止，不再传第三代，挖块制作过母瓶之剩余孢子斜面，应保留在冷藏库中一个月，以备检用。
斜面培养基配制法：消后规格:豌豆浸出液制备：豌豆：30克氯仿：0.5%（二次）自来水：加至1000ml1M H2SO4：调pH用将30克豌豆洗净沥干，加入1000ml自来水，用1M H2SO4，调pH 至4.2～4.5，加0.5％氯仿、盖上磨砂瓶塞，振荡摇匀后，放出气体，再盖紧放置于37℃恒温室一昼夜取出，再用1MH2SO4调节PH值维持在 4.2～4.5，加0.5%氯仿摇匀、盖紧放37±1℃恒温室6天，粗滤除去豌豆，滤液分盛于开口的搪瓷杯中，置沸水浴中，煮沸20分钟（去除氯仿）冷却，用滤纸过滤，去除沉淀的蛋白质、分装于750ml摇瓶中，每瓶装量约200ml左右，以0.09Mpa、118～120℃的条件消毒20分钟，冷却后放入冰箱中备用。
同时抽样送化验，检验质量，在使用该批豌豆浸出液时，必须再送一次样品，测定氨氮含量与第一次相接近时可按后一次样含量计算使用，如第二次含量与第一次不符，须再抽样复试，以最后一次化验数据为准进行计算使用。
豌豆浸出液质量：4.1.4母瓶：用符合质量标准的同支孢子斜面（冷藏期不超过14天）在无菌室内用挖块法分别将孢子接种到已准备好之二只摇瓶中，编号为母I母II，接种后送至温度27±l℃恒温摇瓶间内，在230±20r／mm摇瓶机上，培养50~64／小时，菌丝阶段II一III初之母I用牛皮纸包扎存放于2～4℃冷库中，母II继续培养作质量检查，做无菌试验二支，分别进行27℃及37℃培养。
68小时取样分别测定单位粘度，氨氮消耗、PH、u／ml，以后每24小时取一次样测定上述项目，共计三次（68小时，96小时，120小时三次）如母瓶质量符合要求，则母瓶可以进罐使用，母瓶有效冷藏期为5天。
制得的母瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒、米黄色、无异味不化稀无菌正常。
效价：120小时≥6700u／ml。
接子瓶的母瓶制备法，用无菌操作挖一块斜面，接入一只母瓶，在摇瓶机上培养50~64小时，取下，挑选外观正常菌丝粘稠，色泽米黄，无颗粒状菌丝的母瓶，作为接子瓶用，接种子瓶的母瓶不冷藏。
遇特殊情况，一般冷藏不超过5天。
母瓶原材料及配比如下：磷酸二氢钾0.04～0.07消后质量规格：4.1.4子瓶：取符合种子质量标准之母瓶，在无菌操作条件下，用吸管接入已准备好的子瓶培养基中，每瓶接种量约3ml，瓶数按需而定（母瓶接子瓶前做无菌试验斜面二支，分别培养于27℃，37℃恒温室，母瓶接子瓶后，吸管做无菌试验斜面一支，在37℃恒温室培养），接种后子瓶送27±l℃恒温室培养30—44小时，菌丝阶段在II～III初，长好后，留五瓶继续培养，作质量分析，其中三瓶在120及144小时分别取样测定效价，一瓶测粘度及氨氮，一瓶接无菌斜面二支作无菌试验（分别培养于27℃，37℃恒温室）及观察菌丝形态，（新菌株要加测C及PH）其他瓶冷藏于2～4℃冰库中备用有效冷藏期为7天，如在保存期间发现有化稀现象或有染菌嫌疑，即停止使用，改用其他批号种子，放摇瓶种子应同时准备有2～3批瓶存备用。
制得的子瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒，米黄色，无异味。
不化稀（比母瓶厚）。
效价：120小时≥7000u／ml，144小时≥7500u／ml。
子瓶原材料及配比如下：4.1.5小小罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进行罐内的冲洗及阀垫的更换检查严密度，检查部分包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如遇染菌罐则注明下次空消延长15分钟并检查过滤器有无培养基倒流。
培养基实行实消：空消时预热至压力达到0.16～0.19MPa。
排出罐内冷凝水后计空消时间为15～45分钟，温度为125～130℃，空消时间到后压力跌0MPa进行投料实消。
先加水至搅拌处，然后投入已配好的培养基，搅拌成匀浆状加热，打开各支路蒸汽，关闭罐盖待压力上升至0.07～0.12MPa时计时20分钟左右，消毒温度为115～124℃，结束后保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PH。
小小罐采用摇瓶2－8瓶火焰接种，加空气流量至0.1m3／分，5小时流量加至0.5m3／分，一只小小罐种子可移入2～3只小罐作种子用。
接后开始每4小时取无菌样，每8小时测PH和菌丝浓放罐测C和效价，25小时左右始每8小时测N，种子罐移种标准菌丝呈II一III初阶段，无菌，接种前2小时须将种液涂片镜检什菌状况，培养条件：27±1℃，350±30r／min，46～68h，0.5m3/分，若种子罐生长过程中遇代谢过快时可适时降温培养，遇代谢慢种子罐pH上升，可减少通气量，调节配方等工艺调节措施，以期使各级种子罐质量符合种子质量要求。
小小罐原材料及配比如下：消后规格如下小小罐控制规格：（1）消后C·N·P必须符合质量要求，若不符合则重新投料、消毒。