发酵液提取工艺的过程
微生物发酵产物的纯化与提取技术
微生物发酵产物的纯化与提取技术微生物发酵技术在生物医学和制药领域中具有重要地位，可以制备出多种生物活性产物，如抗生素、激素、酶、细胞因子和疫苗等。
这些产物广泛用于医疗、环保、农业和制造业等领域。
其中，微生物发酵产物的纯化和提取技术是制备过程中的重要环节，可以降低产品成本、提高产品质量和效益。
本文将介绍微生物发酵产物的纯化与提取技术及其应用。
一、微生物发酵产物的纯化技术1. 色谱法色谱法是一种基于样品分子在不同介质中的亲和性和相互作用力差异而分离纯化的方法。
包括大小分子筛法、离子交换法、亲和层析法、凝胶过滤法和气相色谱法等。
这些方法常用于制备高纯度、高效率的蛋白质、核酸、多糖和小分子化合物等。
2. 逆流式管柱法逆流式管柱法是一种通过透析膜和离子交换树脂对混合产物进行分离、纯化的方法。
该方法具有操作简单、高效率、高选择性和易于自动化的优点，适用于制备高纯度的生物活性物质。
3. 溶剂萃取法溶剂萃取法是一种基于样品分子在溶剂中的亲和性差异来分离产物的方法。
溶剂萃取法适用于对于可溶性较好、有机相和水相分配系数大的混合产物进行分离、纯化。
常用的溶剂有乙酸乙酯、苯、氯仿和正己醇等。
二、微生物发酵产物的提取技术1. 超声波提取法超声波提取法是一种通过超声波振荡原理来破坏细胞壁，并将目标产物提取至溶液中的方法。
该方法具有操作简单、高效率、无需使用有毒有害溶剂和耗时的传统提取方法的优点，适用于提取蛋白质、酶、多糖、黄酮类和生物碱等。
2. 溶菌酶提取法溶菌酶提取法是一种通过水解细菌细胞壁中的脂多糖骨架，将目标产物溶解出来的方法。
该方法具有选择性好、成本低、规模化生产能力强的优点，适用于提取抗生素、酶和蛋白质等。
3. 水萃取法水萃取法是一种基于植物纤维素和蛋白质等产物在水相中的亲和性和相互作用力差异而进行的提取方法。
水萃取法具有操作简单、效率高、物料成本低廉和对人体无毒无害的特点，适用于提取多糖、酶、黄酮类、生物碱和氨基酸等。
发酵液预处理与固液分离
发酵液的预处理和固液分离方法综述摘要：从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。
其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。
关键字：预处理固液分离正文：一、发酵液预处理微生物发酵和细胞培养的目标产物主要有菌体、胞内产物和胞外产物三类物质。
从发酵液和细胞培养液中提取所需的生化物质，第一步就需进行预处理，以便于固液分离，使代谢产物后续的分离纯化工序顺利进行。
其原因有三个方面：首先，发酵液多为悬浮液，粘度大，为非牛顿型流体，不易过滤，而所需的生化物质往往只有分布在液相，才能有效地提纯。
并且，在有些发酵液中，菌体自溶，核酸、蛋白质及其他有机粘性物质这三类物质会造成滤液混浊、滤速极慢，必须设法增大悬浮物的颗粒直径，提高沉降速度，以利于过滤；其次，目标产物在发酵液中的浓度通常较低；此外，发酵液的成分复杂，大量的菌丝体、菌种代谢物和剩余培养基会对提取造成很大的影响。
所以，对发酵液进行适当的预处理，从而分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒（如细胞碎片、核酸以及蛋白质的沉淀物），并除去部分可溶性杂质和改变发酵液的过滤性能，是生化物质分离纯化过程中必不可少的首要步骤。
预处理方法要根据发酵产品、所用菌种和发酵液特性来选择。
大多数发酵产品存于发酵液中，少数存于菌体中，而发酵液和菌体中都有产物存在的情形也比较常见。
如果目的产物是胞外产物，则通过离心或过滤实现固液分离，使其转入液相；而对于胞内产物而言，收集细胞是预处理的首要一步。
细胞经破碎或整体细胞萃取使目的产物释放，转入液相，再进行细胞碎片的分离。
如果所需的产物为细胞，离心或过滤所得固相经干燥等过程就可得到菌体。
图1－1为生化产品分离纯化的一般步骤，图中虚线以上为预处理过程示意图。
图1－1 生化产品分离纯化的一般步骤【1】1.1 预处理简述发酵液经过预处理，一些物理性质会改变，从悬浮液中分离固形物的速度随之提高，过滤操作更易进行；在预处理过程中，产物大多转移进入易于后处理的相中（一般为液相）。
发酵液预处理与浓缩
第四节 萃取分离
基本概念
萃取 extraction 是利用液体或超临界流体为 溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。
4.1 溶剂萃取
供提取的溶液称为料液；从料液中待提取的 物质称为溶质；用来萃取目的产物的溶剂称 为萃取剂；溶质转移到萃取剂中与萃取剂形 成的溶液称为萃取液；被萃取出溶质后的料 液称萃余液。
操作方式：间歇式、连续式 型式：管式、套筒
高 速 冷 冻 离 心 机
旋转过滤机
滚 筒 式 离 心 机
4000
三、细胞破碎
细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力 破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内含物包括目的 产物成分释放出来的技术。
细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌 型药物成分的基础。
水层
浓缩，过滤
结晶 (苷C)
溶于乙醇，加Ca(OH)2 减压浓缩，结晶
结晶 (苷C)
甲醇重结晶
西地兰纯品
第三节 膜分离
Membrane separation是利用特殊制造的、具有 选择透过性能的膜，在外力推动下对混合物 进行分离、提纯、浓缩的一种分离方法。
3.1 膜分离概述
膜的定义：
在一种流体相间有一薄层凝聚相物质，把流体相分 隔开来成为两部分，这一薄层物质称为膜 膜还必须具有高度的渗透选择性
1. 酶消化法
细胞悬浮液中加入酶能迅速和细胞 壁反应并破坏它们。酶选择性的与细胞 壁反应，不破坏细胞内的其它物质。反 应条件温和。
此法的缺点在于酶的消耗限制了在 大规模生产中的使用。
2. 机 械 法
• 匀浆法 • 研磨法 • 超声波法：利用频率高、波长短的超 声波进行细胞破碎，效率更高 • 高压均质法
第9章_发酵液预处理和固液分离
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板框过滤机动画
3）真空转鼓过滤机
主体是一个由筛板组成能转动的水平圆筒， 表面有一层金属丝网，网上覆盖滤布,圆筒内沿 径向被筋板分隔成若干个空间。
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转筒真空过滤机动画
转筒真空过滤机
主要适用霉菌发酵液，对菌体 细小、黏度大铺助滤剂。
对于滤饼阻力较大的物料适应 能力较差。
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带式真空过滤机
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2）平抛式离心机
平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低 中速离心机，转速一般在 3000-6000rpm。
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３）管式离心机
• 管式离心机具有一 个细长而高速旋转 的转鼓，转鼓内装 有纵向平板，
• 其下部有进料口。 上部两侧有重液相 和轻液相出口。
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用于分离各种浮浊 液，进行液-液分离， 如油脂；
Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+
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常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
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絮凝
flocculation
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2.杂蛋白去除-变性
加热
大幅度调节pH值 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
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3.杂蛋白去除- 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。
四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的 协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的 胶状沉淀来吸附蛋白质; 在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢 二钠形成沉淀物，该沉淀物不仅能吸附杂蛋白 和菌体等胶状悬浮物，加快了过滤速度。
酵母工艺流程
酵母工艺流程
《酵母工艺流程》
酵母工艺流程是指利用酵母菌进行发酵生产的一系列工艺步骤。
酵母菌是一种微生物，具有发酵能力，可以将碳源转化为酒精和二氧化碳。
酵母工艺广泛应用于食品工业和酿酒业，包括面包、啤酒、酵母蛋白和其他发酵食品的生产。
酵母工艺流程通常包括以下几个步骤：
1. 选材和培养：首先需要选择适合的酵母菌品种和培养基，通过培养酵母菌的方式来增殖和壮大酵母菌。
2. 发酵生产：在适宜的温度、PH和氧气条件下，将培养好的
酵母菌加入原料中，触发发酵过程，产生目标产品。
3. 分离和提取：将发酵后的混合物进行分离，提取出目标产品，如啤酒中的酒精或面包中的酵母发酵液等。
4. 后处理和净化：对提取的产品进行后续处理，包括过滤、脱色、精馏等工艺，以得到纯净的产品。
酵母工艺流程的成功与否，关键取决于选材、培养条件、发酵条件和后处理工艺的控制。
同时，酵母工艺流程也需要考虑产品的质量和安全问题，确保生产的产品符合卫生标准和食品安全标准。
随着食品工业和酿酒业的发展，酵母工艺流程也在不断创新和改进。
新的发酵技术、新的发酵菌株以及智能化、自动化的生产设备，都在为酵母工艺流程的提升和发展提供支持。
相信未来，酵母工艺流程将在食品和酒类生产中发挥越来越重要的作用。
酶制剂生产工艺
酶制剂生产工艺
酶制剂生产工艺是指将酶通过一系列的工艺步骤进行提取、纯化、稳定化等处理，最终获得符合质量标准的酶制剂产品的过程。
酶制剂生产工艺的主要步骤如下：
1. 酶源筛选与培养：选择适合的菌株或真菌菌种作为酶源，通过培养与繁殖，获得大量的酶产生菌株。
2. 发酵过程：将酶源加入培养基中，进行发酵过程。
通过调节发酵条件，如温度、pH值、氧气供应等，使酶产量达到最大化。
3. 酶提取：将发酵液进行分离，分离出含有酶的液体部分。
常用的方法有离心、过滤、沉淀等。
通过这些方法可以去除酶产生菌株和不溶性杂质。
4. 酶溶解：将分离得到的含有酶的液体溶解在适当的溶液中，使酶能够更好地活性。
5. 酶纯化：通过一系列的纯化工艺步骤，如沉淀、离子交换、凝胶过滤、超滤等，去除酶中的杂质，使酶获得更高的纯度。
6. 酶稳定化：对于易受到温度、pH值、湿度等环境条件影响的酶来说，需要进行稳定化处理。
常用的稳定化方法包括冷冻干燥、喷雾干燥、添加保护剂等。
7. 储存与包装：将纯化稳定化后的酶制剂进行储存和包装。
通常要求酶制剂能够在常温下长期保存，并保持较好的活性。
8. 质量控制：对酶制剂进行质量控制，包括活性测定、含水量测定、纯度测定等，确保酶制剂符合相关质量标准。
以上就是酶制剂生产工艺的主要步骤。
不同的酶制剂可能会有一些微小的差别，但总体而言，工艺流程是相似的。
通过这些工艺步骤，可以有效地提高酶制剂的产量、纯度和稳定性，为酶制剂的应用提供有力的支撑。
微生物工程工艺原理_发酵产物的提取与精制方法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂 接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核。此极性核具有溶解极 性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池” 。
2、 影响反胶团萃取的因素 （1）溶液的pH
pH影响蛋白质的电荷数量和电荷性质
（2）溶液的离子强度
影响微胶团的静电状态
常见的超临界流体 CO2、氨、乙烯、乙烷、丙烷、丙烯、乙醇、丁醇、 水等 由于CO2的临界温度、临界压力较易达到，而且
化学性质稳定，无毒、无臭、无色、无腐蚀性，容易
得到较纯产品，因此是最常用的超临界流体。
3、某些常用流体的物理特征
4、超临界流体萃取设备
SFE的基本流程是： 由钢瓶提供高纯液体 （CO2）经高压泵系统， 流入保持在一定温度 （高于Tc）下的萃取池。 在萃取池中可溶于SCF 的溶质扩散分配溶解在 SCF中，并随SCF一起 流出萃取池，经阻尼器 减压获升温后进入收集 器，多余的SCF排空或 循环使用。
二烷基磷酸盐/ 异辛烷反胶束溶液萃取,并用缓冲液将混合液的
pH 值调至9. 0 ,则溶菌酶完全进入有机相中,而肌红蛋白则留 在水相.
四、超临界流体萃取
超临界流体是处于临界 温度和临界压力以上，介于 气体和液体之间的高密度流 体。在临界温度以上压力不 高时与气体性质相近，压力 较高时则与液体性质更接近， 由此形成的超临界流体的性 质介于汽液两相之间，并易 于随压力调节的特点。
pH 值的变化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也 会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。
（3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离 子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束, 存在一穿过相界面的电势差(Donnan 电势) ,它是影响荷电
谷氨酸生产工艺流程
谷氨酸生产工艺流程
《谷氨酸生产工艺流程》
谷氨酸是一种重要的氨基酸，在食品、医药和化工等领域都有着广泛应用。
谷氨酸的生产工艺流程通常包括发酵和提取两个主要步骤。
首先是发酵过程。
在这个步骤中，选择合适的微生物菌种，如谷氨酸杆菌、大肠埃希菌等，与适当的培养基进行培养。
这个培养基通常包括碳源、氮源、矿物质盐等。
在适当的温度、pH值和氧气条件下，微生物会利用培养基中的营养物质进行代谢，产生谷氨酸。
接下来是提取过程。
在发酵结束后，需要对发酵液进行提取分离，得到谷氨酸。
一般的提取方法包括离子交换色谱、凝胶过滤、溶剂萃取等。
通过这些提取方法，可以有效地分离出谷氨酸并将其纯化。
在整个生产工艺流程中，需要严格控制发酵条件、提取工艺以及生产设备的清洁卫生，以确保产品质量达到要求。
此外，还需要进行废水处理、废气处理等环保工作，以确保生产过程环保和可持续发展。
总的来说，谷氨酸生产工艺流程是一个复杂的过程，需要科学严谨的操作和严格的质量控制。
随着工艺技术的不断进步，谷氨酸的生产将会更加高效、环保，满足市场需求。
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发酵液提取工艺的过程
发酵结束后的发酵液组成情况非常复杂，处理措施与化学合成法明显不同。
通常情况下，发酵液中目标物浓度很低，而杂质含量却很高，成份远较化学反应母液情况复杂，大量菌体细胞、培养基、各种蛋白质胶状物、色素、金属离子和其它代谢物等混杂其中，使得发酵液的预处理对于目标物的最终获取非常必要。
1、发酵液预处理的目的是使发酵液中的蛋白质和某些杂质沉淀，以增加滤速，过滤的目的是使菌丝体与发酵液分离，以便从发酵液或菌丝体中提取目标物。
预处理阶段主要去除两大类杂质：可溶性黏胶状物质（核酸、杂蛋白、不溶性多糖等）和无机盐（不仅影响成品炽灼残渣，还会影响离子交换法提取目标物的收率）。
确定预处理方法前，首先要明确目标物存在于胞内（菌体）还是胞外（发酵液），以确定弃去和收集的对象；还要结合目标物的稳定性等特点，选择预处理的pH、温度和化学试剂等。
对于菌丝体及杂蛋白的处理一般可采用等电点沉淀、变性沉淀、沉淀剂沉淀、加入絮凝剂、加入凝聚剂、吸附以及酶解法去除不溶性多糖等措施，对提取效果和成品质量影响较大的无机杂质主要是Ca2+、Mg2+、Fe3＋等高价金属离子，可采用离子交换法、沉淀法等措施去除。
加入的预处理试剂除要考虑到处理效果外，还要考虑低毒性、利于环保以及易于从终产品中除去等因素，申报时应说明所采取的措施及加入的试剂，必要时在成品质量研究中检测其残留量。
液－固分离是发酵液预处理的重要步骤，通常采用板框压滤、真空过滤以及离心分离等措施，过滤是各种措施中普遍存在的一个环节，为提高过滤效果、提高滤液质量，通常加入助滤剂，选择助滤剂时除考虑其效果和成本外，无毒，惰性，不与滤液和目标物产生化学反应对于终产品的质量和安全性尤为重要。
预处理后的滤液是生产过程中重要的中间产物，类似于化学反应中的中间体，有必要制订其质量控制标准，比如，一般情况下要澄清、有一定浓度、pH适中，需要说明的是，后续的提取工艺不同，对滤液的质量要求不同，如离子交换法提取目标物时对无机离子、澄清度等方面要求较严格，溶媒法提取时要求滤液蛋白含量较低。
总之，经预处理后的滤液控制标准应根据其后的提取工艺综合确定。
2、目标物的提取是采用物理或化学手段从发酵液或菌丝体中得到目标物的浓缩液或粗制品。
常用的提取方法有溶媒萃取法、离子交换法、吸附法以及沉淀法。
具体采用何种提取方法需结合目标物化学结构特征、产品组份情况、拟采用的终产品精制工艺、终产品质量要求
以及对终产品安全性的影响等因素综合考虑。
●溶媒萃取法在目前的微生物药物尤其抗生素生产中的应用较为普遍，特点是产品纯度、颜色等质量特征较好，尽管离子交换技术已比较发达，但还不能完全替代溶媒萃取法。
需要注意的是一定要关注溶剂的安全性，选用毒性低的溶剂如常用乙酸乙酯、乙酸丁酯和丁醇等，用到的溶剂要在质量标准中进行残留量的严格控制，一般不选用1类和2类溶剂；另外，所用溶剂对目标物应具有较好的溶解性和选择性，少量即可提取完全，并使目标物和杂质良好分离。
乳化现象是溶媒萃取法中需要克服障碍，如使用去乳化剂，应考虑其安全性以及从终产品中的残留情况，必要时检测其残留量。
●离子交换法因成本低、设备简单、不用或少用有机溶剂等优点，已成为提取抗生素的重要方法之一，如许多氨基糖苷类抗生素和多粘菌素等多用此法提取。
但有时产品质量特征稍不如意，另外，此种提取过程中pH变化较大，不适于稳定性较差目标物如青霉素等的提取。
解吸附时常用水、稀酸、盐或其他络合剂等，一般说来，酸性吸附碱性洗脱，碱性吸附酸性洗脱，为防止洗脱过程pH变化过大，避免影响目标物稳定性，可选用缓冲液洗脱剂，有时还会用到含有机溶剂的洗脱剂以提高洗脱效果，需要考虑的是洗脱剂对目标物的影响、洗脱剂的安全性及其在终产品中的残留情况，如NH4+和链霉素反应会生成毒性很大的二链霉胺，故吸附链霉素后的饱和树脂不可使用氨水洗脱。
●吸附法在早期的微生物药物如青霉素、林可霉素以及维生素B12等的提取中应用较多,吸附剂为活性炭、酸性白土以及弱酸性离子交换树脂等，按原理可分为物理吸附、化学吸附和交换吸附等类型。
因选择性差、收率不高等缺点，在后来的生产中渐被其它方法取代，但近期随着大孔网状聚合物吸附剂的合成和发展，重又得到重视和应用。
使用时需要关注溶液pH对目标物稳定性的影响以及解吸附剂的安全性及其在终产品中的残留情况。
●沉淀法提取目标物在国内应用较为广泛，尤其在四环类抗生素的生产中应用较多，一般可分为间接沉淀和直接沉淀两种类型。
如用到沉淀剂，需要考虑其安全性、对目标物稳定性的影响以及在终产品中的残留情况。
另外，沉淀法得到的产品一般颗粒粗大，必要时要经过粉碎、重新溶解结晶等措施，控制产品一定的粒度，保证临床有效性。
3、目标物的精制是指将提取得到的目标物浓缩液或粗制品进一步纯化为终产品，所采用的方法与化学合成产物的精制方法大体相同，如浓缩干燥法、结晶与重结晶法、盐析法和晶体洗涤法，鉴于微生物药物多具有化学结构不稳定以及粗品中含有残存蛋白、同系物、异构体、色素等杂质的特点，色谱纯化、分子筛纯化等方法对于保证终产品纯度等质量特征以及降低临床应用中的致敏性等具有重要意义，是比较理想的精制方法。
目标物的精制是制备
工艺的终端步骤，对精制效果、产品质量特征乃至临床安全性的关系更为直接，采取的措施以及使用的试剂需要引起密切关注。
由于制备工艺的特殊性，对于微生物药物来讲，脱色、去热原（它是指细菌内毒素的脂多糖）是精制其注射用原料药过程中不可或缺的一个单元操作，对终产品的质量特征及临床安全性至关重要。
色素是本身带有颜色并能使其它物质着色的高分子有机物质，一般来说，是发酵过程中产生的代谢产物，与菌种和发酵条件有关。
虽然在发酵液预处理和目标物提取时会除去大部分色素和杂质，但仍会有少量残存物随目标物一起转移到粗制品或浓缩液中，精制时尤需关注。
热原也是发酵过程中产生的代谢产物，多是多糖的磷类脂质和蛋白质等物质的结合体，是一种不挥发的大分子有机物，能够通过一般过滤器进入滤液，但可被活性炭等吸附，200℃加热2h或250℃加热30min方可彻底破坏，其它方法如强酸、强碱以及强氧化等也可破坏热原，但鉴于微生物药物的稳定性特点，多数采用活性炭或二乙胺基乙基葡聚糖凝胶吸附的方法去除热原，但活性炭应事先用酸及无盐水等适当处理，以除去炭表面的杂质，以防止新杂质的引入。
注射用无菌原料药的质量要求除应具备一般原料药的质量特征外，还要具备可靠的无菌保证水平、无热原（细菌内毒素）、可见异物和溶液颜色不能超过相关规定。
由于这类药物稳定性的限制，往往不能采用高温、高压的灭菌方式，在精制过程中通常采用过滤除菌、无菌操作等措施保证产品质量，需要根据目标物的具体特点，采用合适的精制工艺，进行灭菌工艺的研究和验证，并严格执行GMP要求和根据相应研究制订的SOP。