018第十八章-1

表 19-1 按照分离过程原理分的色谱分类法
顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰 性流动相中加入对固定相的吸附或溶解等能 力比所有试样组份都强的物质为顶替剂（或 直接用顶替和流动相），通过色谱柱，将各 组份按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶 替出固定相 ，如图18—增-1（b） 所示。 迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱， 吸附或溶解能力最弱的第一组份首先以纯物 质的状态流出，其次则是第一组份和吸附或 溶解能力较弱的第二组份的混合物，以此类 推，流出曲线如图18—增-1（c）所示 。
从色谱流出曲线上，可以得到许多重要信息： (1)根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组 份最少个数； (2)根据色谱峰的保留值（或位臵），可以进行 定性分析； (3)根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量 分析； (4)色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱 柱分离效能的依据； (5)色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（和流 动相）选择是否合适的依据。
§18-1 概
述
色谱法(Chromatography)同蒸馏、 重结晶等一样，也是一种分离技术，但 其是一种效率最高、使用最广泛的分离 技术。 最早创立色谱法的是俄国植物学家 Tsweett 。 色谱法中，静止不动的一相称为固 定相，流动的一相称为流动相，装有固 定相的管子称为色谱柱。
玻璃管内装 有碳酸钙，将植 物叶子萃取液从 玻璃管上端倒入， 然后再倒入石油 醚，结果植物色 素互相分离形成 各种不同颜色的 谱带。色谱法的 名称即由此而来 并一直沿用至今。
4、死体积VM指色谱柱在填充后，柱管内固定 相颗粒间所剩留的空间，色谱仪中管路和连 接头间的空间以及检测器的空间的总和，当 后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死 时间与流动相体积流速F0(ml/min)计算： VM = tM F0 5、保留体积VR指从进样开始到被测组份在柱 后出现浓度极大点时所通过的流动相体积， 保留体积与保留时间tR的关系如下 : VR = tR F0
四、按照展开程序分类 按照展开程序的不同，可将色谱法分为 洗脱法，顶替法和迎头法。 用吸附或溶解能力比试样弱得多的气体 或液体作冲洗剂，由于各组份在固定相的吸 附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次 序也就不同，从而使组份彼此分离，这种方 法能使样品各组份获得良好的分离，色谱峰 清晰，此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较 高的物质，目前，这种方法是色谱法中最常 用的一种方法。
1.标准偏差σ即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半， 如图19—2中EF距离的一半。 2.半峰宽W1/2即峰高一半处对应的峰宽，如图 19—2中GH间的距离，它与标准偏差的关系 为： W1/2 = 2.354 σ 3.基线宽度W：即色谱峰两侧拐点上的切线在 基线上的截距，如图19—2中IJ的距离，它 与标准偏差σ的关系是: W = 4σ
浓度
A
KA>KB
B
A B 沿柱移动的距离L
图19-3溶质A和溶质B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓
第三，在保证快速分离的前提下，提供足 够长的色谱柱。
第一，二点是完成分离的必要条件，作 为一个色谱理论，它不仅应说明组份在色谱 柱中移动的速率，而且应说明组份在移动过 程中引起区域扩宽的各种因素，塔板理论和 速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前 提，故称为线性色谱理论。 一、塔板理论 塔板模型将一根色谱柱视为一个精馏塔， 即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔 板组成，每一块塔板的高度为H表示，称为 塔板高度、简称板高。
W
W
图18-4 色谱流出曲线
二、峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以h表示。 三、保留值 1、死时间tM,不被固定相吸附或溶解的物质入 色谱柱时，从进样到出现峰极大的值所需的 时间称为死时间，如图19—2中O′A,因为这 种物质不被固定相吸附或溶解，故其流动速 度将与流动相的流动速度相近，测定流动相 平均线速ū时，可用柱长L与tM的比值计算。 U = L/tM
塔板理论是一种半经验性的理论，它用 热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移 动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出 计算和评价柱效高低的参数，但是，色谱过 程不仅受热力学的因素影响，而且还与分子 的扩散，传质等动力学因素有关，因此塔板 理论只能定性地测得不同的理论塔板数，因 而限制了它的应用。
二、速率理论 1956 年 ， 荷 兰 者 范 第 姆 特 （ van Deemter）等人的研究气液色谱时，提出色 谱过程的动力学理论——速率理论，他们吸 收了塔板理论中板高的概念，并同时考虑影 响板高的动力学因素，指出：填充柱的效受 分子扩散，传质阻力，载气流等因素的控制， 从而较好地解释了影响板高的各种因素 速度理论指出，谱峰扩宽受三个动力学 因素控制，即涡流扩散项，分子扩散项，传 质阻力顶，用板高方程表示为： H =A + (B/ U) + C U
在色谱柱中，n值一般是很大的，如气相色谱 柱的n约为103~106，因而这时的流出曲线可 趋近于正态分布曲线。 第二，当样品进入色谱柱后，只要各组份在两 相同的分配系数有微小差异，经过反复多次 的分配平衡后，仍可获得良好的分离。 第三，n与半峰宽及峰底宽的关系式为： n = 5.54(tR/W 1/2)2 = 16 (tR/W )2 式中tR或Y 1/2应采取同一时间单位。从上式可 以看出，在 tR 一定时，如果色谱峰越窄，说 明n越大，柱效越高。
在定性分析中，通常固定一个色谱峰作 为标准（S），然后再求其它峰（i）对这个 峰的相对保留值，此时，ri/s可能大于1，也可 能小于1，在多元混合物分析中，通常选择一 对最难分离的物质对，将它们的相对保留值 作为重要参数，在这种特殊情况下，可用符 号α表示： α= tR2 `/ tR1` 式中为出峰后的调整保留时间，所以这时α总 是大于1的。
6、调整保留体积VR′某组份的保留体积扣除死 体积后，称该组份的调整保留体积，即 VR′= VR - VM 7、相对保留值α2.1某组份2的调整保留值与组 份1调整保留值之比，称为相对保留值： α 2.1 = tR2 `/ tR1` 由于相对保留值只与柱温及固定相的性 质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动 相流速无关，因此，它是色谱法中，特别是 气相色谱法中，广泛使用的定性数据。 必须注意，相对保留值绝对不是两个组 份保留时间或保留体积之比。
A
B
B
A (a) (d)
A
A+B (c)
图18-增- 1 各种展开方法的流出曲线
序号
方法名称
主要分离过程的性 测量被分离物对两相 质 亲和力大小的单位
1 2 3
吸附色谱法 吸附 分配色谱法 萃取 离子交换色 静电作用和扩散 谱法
吸附系数 分配常数 电荷电离常数和有 效的离子直径
4 5
凝胶色谱法 扩散 有效分子尺寸 生物亲和色 与亲和剂的生物 无通用单位 谱法 特征的相互作用
2、保留时间tR试样从进样开始到柱后出现峰 极大点所经历的时间，称为保留时间，如图 19—2 O′B，它相应于样品到达柱末端的检 测器所需的时间。 3、调整保留时间tR’某组份的保留时间扣除死 时间后称为该组份的调整保留时间，即 tR’ = tR - tM 由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了 组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在 固定相中滞留所需的时间，所以tR′实际上是 组份在固定相中停留的总时间，保留时间可 用时间单位（如 s）或距离单位（如cm）表 示。
同理，液相色谱按照固定相的物态不同， 又可分为液固色谱和液液色谱法，前者的固 定相为固体，后者是将固定液固定在适当的 固相载体上作为固定相。 二、按照产生分离过程的相系统的模式分类 按照产生分离过程的相系统的形式和特 征，可以把色谱法分为柱色谱法、毛细管色 谱法、平板色谱法。柱色谱法是将很细的固 定相装入玻璃管或金属管内，流动相依靠自 身的重力或外加压力通过固定相，随其固定 相装填方法不同，又将柱色谱法分为填充柱 色谱法和毛细管色谱法，前者是是将固定相 填充于一根下班或金属管内，后者是将固定 色谱法中，固定相可以是多孔的 滤纸；也可将吸附剂或载体均匀地铺在一块 玻璃板或塑料板上，让流动相通过毛细现象 或重力作用携带样品通过固定相，前者称为 纸色谱法，后者称为薄层色谱法。 三、按照分离过程原理分类 在色谱法中，通常根据物质的吸附性能、 溶解度差异等物理化学原理进行分离，因而 得到所谓吸附色谱法，分配色谱法等。表191列出了按照分离过程原理分类的各种色谱 方法。
§18-2色谱法基础知识、概念及名词术语
什么是线性色谱？ B 样品在固定相 CD 和流动相之间的平 衡可以用分配系数 来进行定量讨论。 K = cs/cm 若分配系数K与 cM 浓度无关，则分配 等温线是线性的， 图18-3 典型分配等温线 如图18—3的C cs A
吸附线一般是A或B型的，但当溶质浓度 低时， cs基本上正比于cm ，曲线近似于直线， 在一般情况下，由于色谱柱中溶质的浓度较低， 因此可以认为K为常数，K为常数时所进行的 色谱过程称为线性色谱。 容易理解，溶质流过色谱柱时，分配系数 大的组份通过色谱柱所需要的时间长，分配系 数小的组份需要的时间短。 一、基线 柱中仅有流动相通过时，检测器响应讯的 记录值，即图19—2中O—t线，稳定的基线应 该是一条水平直线。
在实际工作中，按前面式计算出来的n 和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离 效能，因为采用tR计算时，没有扣除死时间 tM,所以常用有效塔板数n有效表示柱效： Neff= 5.54(tR’/2Δt 1/2)2 = 16 (tR’/W)2 (18-49) 有效板高为： Heff = L / Neff (18-50) 因为在相同的色谱条件下，对不同物质 计算所得的塔板数不一样，因此，在说明柱 效时，除注明色谱条件外，还应指出用什么 物质来进行测量的。
§18-3 色谱动力学基本理论
图19—3是A、B两组份沿色谱柱移动时， 不同位臵处的浓度轮廓，图中KA>KB因此A组 份在移动过程中滞后，随着两组份在色谱柱 中移动距离的增中，两峰间的距离逐渐变大， 同时每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也 慢慢变宽，显然，区域扩宽对分离是不利的， 但又不是不可避免的，若要使A、B两组份完 全分离，必须满足以下三点： 第一，两组份的分配系数必须有差异； 第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；