基因工程实验报告的实验步骤
基因工程 实验报告
基因工程实验报告学号姓名1实验目的（1）学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，检测质粒DNA的浓度与分子量。
（3）了解PCR的基本原理，掌握PCR的基本操作技术。
（4）学习利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果。
（5）学习DNA重组技术中的核心步骤，DNA片段之间的体外连接方法。
（6）学习制备感受态细胞并将体外重组DNA引入受体细胞的技术。
（7）掌握利用蓝白斑筛选出转化子的方法。
2 实验原理2.1质粒DNA提取的原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，变性质粒DNA又恢复到原来的构型；而线性的大分子量的细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶性复合物。
当加入中和溶液后，质粒DNA能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；变形的蛋白质和DNA呈絮状，离心时可以沉淀下来。
碱裂法获得的质粒DNA 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀除去残余的蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA可满足实验要求。
2.2 PCR扩增功能基因的原理将反应体系(模板DNA、引物1、引物2、Mg2+、4种dNTP和Taq DNA聚合酶)置于高温(94℃)下变性，使模板双链DNA解链为两条单链。
在低温(37~65℃)下退火，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA。
在中温(~72℃)下，通过Taq DNA聚合酶使引物从5’端向3’端延伸，随着4种dNTP的掺入合成新的DNA互补链，完成第一轮变性、退火和聚合反应循环。
反复进行这种变性、退火和聚合反应循环，可使两端引物限定范围内的DNA 序列以指数形式扩增。
循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上将一个目的DNA分子经20轮扩增后，可达106。
基因工程实验流程
基因工程实验流程1.选择目标基因：首先，确定要研究或改造的目标基因。
这个基因可以是来自任何生物的DNA序列，包括原核生物和真核生物，甚至可以是合成的DNA片段。
2.基因分离：将包含目标基因的DNA从生物体中分离出来。
这可以通过提取目标生物体的基因组DNA，然后使用特定的酶切酶将目标基因从DNA中剪切出来。
3.DNA克隆：将目标基因插入到合适的载体中，形成重组DNA分子。
常用的载体包括质粒、病毒或人工染色体。
重组DNA分子可以通过转化、感染或转染等方法导入到宿主细胞中。
4.转化宿主细胞：将重组的DNA分子导入到适当的宿主细胞中。
这可以通过热冲击、电穿孔、化学方法或用载体病毒感染的方式实现。
在这一步中，多个宿主细胞可能被转化，以增加目标基因的表达量。
5.分子鉴定：通过PCR反应、限制性酶切、DNA测序等方法，对导入宿主细胞的重组DNA分子进行鉴定和验证。
这可以确认目标基因是否被正确克隆和定位在宿主细胞的基因组中。
6.蛋白质表达：通过转录和翻译，使目标基因在宿主细胞中转录成mRNA，然后翻译成蛋白质。
这个过程可以通过合适的启动子和转录因子来调控。
7.蛋白质纯化：通过细胞裂解和各种分离技术，获得纯度较高的目标蛋白质。
这包括离心、超滤、电泳等技术，可以去除其他细胞组分和杂质。
8.蛋白质功能研究：对纯化的目标蛋白质进行功能研究，了解其生物学功能和相互作用。
这可以通过基因敲除、突变、结构分析、生物活性检测等方法进行。
9.结果分析和确认：对实验结果进行数据分析和统计，确保实验结果的可靠性和重复性。
这包括基因表达水平、蛋白质功能、相互作用准确性和可靠性的验证。
10.应用和进一步研究：根据实验结果，根据需要对目标基因进行进一步改造或利用。
这可能涉及到设计新的实验和技术，以满足具体的应用需求。
总结：基因工程实验流程是一个复杂的过程，需要多个步骤和技术的相互协作。
这个过程涉及到基因选择、分离、克隆、转化、鉴定、蛋白质表达和纯化等多个关键步骤。
基因工程实验报告的实验步骤
实验一：大肠杆菌5 a和21感受态细胞的制备【实验步骤】1从平板上挑取新活化的大肠杆菌 5 a单菌落，接种到5培养基中，37C振荡培养过夜。
2取1培养物接种到100培，养基（250三角瓶）中，37C振荡培养2~3h。
3将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4C 4000离心5,弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5用20冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4C 4000离心5,弃去上清液。
6用10冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4 C 4000 离心5，弃去上清液，用2的冷2溶液悬浮。
8分装到数个管中，每管200，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取【实验步骤】一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）1、取200新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a, 18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42C保温90s,冰浴2。
3、加入800液体培养基，37 C慢摇复苏1 h。
4、将100的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30 （使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37C培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取1挑取单菌落接种于100加入50的液体培养基中，振荡培养过夜。
2过夜培养的菌液加入1.5的小指管（20个每组）中，每次1 , 4 C, 12000，离心1 ,4次，弃上清。
3加入150溶液I悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4加入350溶液H （新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）5加入300溶液川（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4 C, 12000，离心10，取上清转移至另一离心管中。
7向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20。
8 4 C, 12000，离心10，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4 C, 12000，离心3，吸去上清。
基因工程实验的详细步骤
基因工程实验实验一、质粒DNA的提取、分离和纯化试剂A.LB液体培养基（L）: 1000ml蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeast extract）5g,NaCl 10g,加去离子水至1000ml用5MNaOH调至pH7.2-7.5。
121o C高压下蒸汽灭菌20分钟。
B.LB固体培养基（L）：每升液体培养基加15g 琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。
C.氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20 o C下保存备用。
Amp使用时配成100mg/ul,按千分之一加入培养基中。
D.溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L TrisCl (pH8.0), 10mmol/LEDTA(pH8.0). 高压蒸汽灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
E.溶液II：0.2mol/L NaOH (临用前用10 mol/L NaOH母液稀释)， 1%SDS.F.溶液III: 5mol/L KAC 60ml, 冰醋酸 11.5ml, 水28.5ml.G.RNase A母液：将RNase A酶粉溶于10mmol/L TrisCl (pH7.5)、15mmol/LNaCl, 终浓度为10mg/ml。
100 o C加热15分钟，冷却后分装。
H.饱和酚：市售酚需重蒸。
重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/L TrisCl (pH8.0)和0.1mol/L TrisCl (pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。
I.氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。
J.酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。
K.TE缓冲液：10mol/L TrisCl (pH8.0)， 1mmol/L EDTA(pH8.0). 高压蒸气灭菌15分钟, 储存于4 o C冰箱。
三、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5α菌株接种在LB固体培养基（含50μg/ml Amp）中，37o C培养12-24小时。
基因工程基本操作步骤
基因工程基本操作步骤
1、目标基因的选择。
这是进行基因工程的第一步，目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象，在选择时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2、克隆目标基因。
这一步骤包括提取DNA、使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度、连接载体（如质粒、病毒等）以及转化宿主细胞（如大肠杆菌、哺乳动物细胞等）。
3、构建重组表达载体。
这一步骤包括选择合适的载体、插入目标基因、调节表达（如调节启动子和终止子）等，重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
4、转染宿主细胞。
这一步骤包括选择合适的宿主细胞、转染重组表达载体、筛选阳性克隆等，转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
5、目的基因的检测与鉴定。
这一步骤包括分子水平上的检测（如DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原-抗体杂交技术）和个体水平上的鉴定（如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等）。
6、分离和纯化目标蛋白。
这一步骤包括破碎宿主细胞、
使用不同的技术对混合物进行分离（如层析、电泳等）。
基因工程实验
基因工程实验详细步骤一、目的基因LK的扩增——PCR（含电泳）（一）目的基因LK的扩增——NE201（1）实验准备材料：rLK重组质粒（模板）试剂：PCR试剂盒用具：移液枪（2.5μl、10μl、50μl）以及相应枪头（盒）、EP管（100μl）、EP板（大、小）；冰袋两只、手套、废液桶仪器：离心机（14000rpm）、PCR扩增仪（2）反应体系（50μl）试剂（按照加样顺序）用量dH2O23μL重组质粒1μL上游引物F 0.5μL下游引物R 0.5μLTaq酶25μL（3）反应条件预变性95℃，10min变性95℃，30s退火56.6℃，35s延伸72℃，40s最终延伸72℃，10minTIP：*吸取或加入液体时，枪头尽量少伸入，可避免气泡产生；若有气泡，需10000rcf离心1min 再进行下一步实验*勤换枪头，避免污染试剂或产物*任何移液枪用完后及时调回最大量程*仪器用完后及时关闭（二）LK PCR产物的电泳——NE217（1）实验准备材料：LK PCR产物试剂：去离子水、50×TAE缓冲液、电泳用琼脂糖、6×Loading Buffer、DL1000marker（D526A）、Ultrapower DNA Stain染液用具：钥匙、称量纸、橡皮筋、100ml锥形瓶、50ml量筒；制胶槽、制胶卡、制胶梳（18teeth）；移液枪（10μl、1000μl）及相应枪头（盒），100μl EP管，EP板（大、小）；冰袋两只、手套（包括塑料和麻布）、废液桶仪器：电子天平、微波炉、电泳仪（含电泳槽）（2）制胶（3%）1. 称取电泳用琼脂糖0.6g（即总体积20ml 的3%），小心倒入100ml锥形瓶中2. 取TAE缓冲液400μl于50ml量筒中，去离子水定容至20ml（实为电泳缓冲液）3. 将量筒中液体转入锥形瓶中，盖上吸量纸，用橡皮筋封好，再用步骤2中用剩的枪头扎一个小孔4. 将制胶梳（18 teeth）、制胶卡、制胶槽洗净并用吸水纸擦干，组装好5. 至于微波炉中，注意观察，煮沸后立即拿出（戴上麻布手套），轻轻晃匀，重复2-4次，至胶完全澄清均一为止6. 及时将胶转入准备好的制胶槽，凝固30min后，连着横条纹塑料板一起放入电泳槽中（胶孔靠近负极）（3）加样和电泳1. 在EP管内分别加入A. DL1000marker 5μl，染液1μl；B. PCR产物5μl，6×loading buffer1.2μl，染液1μl2. 将样品全部转入胶孔中。
基因工程实验报告的实验步骤
基因工程实验报告的实验步骤引言基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的工艺来改变其性状的技术。
基因工程在医药、农业和环境保护等领域有广泛的应用。
本实验旨在通过简单的基因工程实验，介绍基因工程的基本原理和实验步骤。
材料与方法1.实验材料：-选择性培养基：含有特定抗生素、激素或其它附加物质的培养基，以选择或鉴别特定的细胞。
-质粒：小的DNA分子，通常用来将外源基因导入宿主细胞。
-酶：用于限制性内切酶切割DNA。
-细胞培养物：用于细胞培养和基因转染。
-DNA提取试剂盒：用于提取DNA。
-PCR试剂盒：用于DNA扩增。
-DNA凝胶电泳仪：用于分离DNA。
2.实验步骤：（1）提取DNAa.收集样本，如细菌培养物或植物叶片。
将样本细胞裂解并使用DNA提取试剂盒提取DNA。
b.检测DNA浓度和质量，并分装为合适的体积备用。
（2）DNA限制性酶切割a.根据研究目的选择正确的限制性酶。
将DNA与限制性酶一同加入反应管中，按照供应商说明的条件进行酶切反应。
b.将反应产物进行电泳分离，观察并记录DNA切割情况。
（3）DNA连接a.选择合适的酶切产物进行连接实验。
将DNA和相应酶与连接试剂进行反应，在恰当的温度下进行连接反应。
b.将反应产物进行电泳分离，观察并记录连接后的DNA条带。
（4）DNA扩增a.根据连接后的DNA序列设计引物，在PCR试剂盒中将DNA进行扩增反应。
b.将PCR反应产物进行电泳分离，观察并记录扩增结果。
（5）基因转染a.准备转染细胞，并将质粒导入细胞。
按照转染试剂盒说明进行操作。
b.观察转染细胞的表型变化，并进行相关分析。
结果与讨论在本实验中，我们成功完成了DNA提取、限制性酶切割、DNA连接、DNA扩增和基因转染的操作。
通过电泳分离，我们观察到了DNA切割、连接和扩增的结果。
此外，转染细胞的表型变化也支持基因导入的成功。
实验结论本实验展示了基因工程的基本步骤，并介绍了DNA提取、限制性酶切割、DNA连接、DNA扩增和基因转染等关键技术。
基因工程实验操作
实验一质粒DNA的提取试验方法与步骤（1）、菌种的培养：将含质粒的菌液接种在含100ug/ml Amp的LB固体培养基中，37℃培养12-24小时。
用无菌牙签或接种针挑取单菌落接种到5ml含100ug/ml Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（约18小时）备用。
（2）用微量取液枪取1.5ml菌液于离心管中，将装有剩余菌液的锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上灭菌后封口备用。
（3）、将离心管置于离心机中，12000rpm离心1min。
（4）、弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上数秒使液体尽可能流尽。
（5）、加入250ul溶液I，用枪吹打悬浮后置于旋涡混合仪上振荡，使菌体充分悬浮，室温静置5min。
（6）、加入250ul新配制的溶液II，温和颠倒混匀，冰浴中静置5min。
（7）、加入350ul溶液III，轻轻颠倒混匀，冰浴中静置10min。
（8）、将管置于离心机中，12000rpm离心10min。
（9）、取上清液,置于套有离心管的吸附柱中,10000rpm离心1min,弃清液,留吸附柱。
（10）、取500ul的Buffer HB置于上述套有离心管的吸附柱中，10000rpm离心1min，弃清液，留吸附柱。
（11）、取500ul的Wash Buffe置于上述套有离心管的吸附柱中，10000rpm离心1min。
（12）、去清夜，离心空离心管，10000rpm离心1min。
（13）、去清夜，取500ul的EB于吸附柱，室温放置1~2min，13000rpm离心1min。
（14）、取200ul样品用水稀释50倍后，以水为对照测其OD260与OD280值。
（15）、另取5ul样品与2ul 6×上样缓冲液混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，检测其纯度和分子量。
（16）、其余样品作好标记后贮存于4℃冰箱中备用（用于构建重组子）。
实验二紫外分光光度法测定DNA纯度和浓度实验步骤（1）分光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
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实验一：大肠杆菌5α和21感受态细胞的制备
【实验步骤】
1 从平板上挑取新活化的大肠杆菌5α单菌落，接种到5 培养基中，37℃振荡培养过夜。
2 取1培养物接种到100 培养基（250三角瓶）中，37℃振荡培养2~3h。
3 将菌液转移到50离心管（2管）中，冰上放置15。
4 4℃4000 离心5，弃去上清液，倒置使培养液流尽。
5 用20 冷2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在4℃4000 离心5，弃去上清液。
6 用10 冷2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴30。
7 4℃4000 离心5，弃去上清液，用2 的冷2溶液悬浮。
8 分装到数个管中，每管200 ，冷冻保存备用。
实验二：目的基因质粒（或218）
和表达载体质粒（32或30）的转化及大量提取
【实验步骤】
一、载体的转化（无菌条件，冰上进行）
1、取200 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 2 （32a，18），混匀，冰上放置30。
2、将管放到42℃保温90s，冰浴 2。
3、加入800 液体培养基，37℃慢摇复苏1 h。
4、将100 的复苏细胞涂布在含有（100）的培养皿中，正置平皿30（使菌液被培养基吸收）。
5、倒置平皿37℃培养16 h，出现菌落。
二、质粒的提取
1 挑取单菌落接种于100 加入50 的液体培养基中，振荡培养过夜。
2 过夜培养的菌液加入1.5 的小指管（20个每组）中，每次1 ，4℃，12000 ，离心1，4次，弃上清。
3 加入150溶液Ⅰ悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置10。
4 加入350溶液Ⅱ（新鲜配制），轻微颠倒混匀20次，冰浴5。
（不能再剧烈震荡）
5 加入300溶液Ⅲ（冰上预冷），颠倒混匀20次，不能剧烈震荡，冰浴10。
6 4℃，12000 ，离心10 ，取上清转移至另一离心管中。
7 向上清中加入0.6倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置20 。
8 4℃，12000 ，离心10 ，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。
9 用1 70%乙醇洗涤质粒沉淀2次，每次4℃，12000 ，离心3，吸去上清。
10 55℃烘干至无酒精，加入20 ，所有集成一管后加入 1~2，37℃消化1~2h，-20℃保存。
11 电泳分析。
制胶：0.14g琼脂糖，20 1×缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳子，冷却凝固待用。
点样：6质粒+1上样缓冲液。
电压：180V，电泳至蓝色带距离点样孔3。
实验三目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化
【实验步骤】
1 酶切
酶切体系
试剂小量酶切大量酶切
灭菌水 5 —
质粒10 88
Ⅰ0.5 1
Ⅲ0.5 1
10× 4 10
终体积20 100
按以上酶切体系加入0.5 管中，37℃放置3h，电泳回收片段。
（点样：酶切体系100上样缓冲液20。
）
2 酶切产物的回收
1)将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管中，称取
重量。
2)向胶块中加入3倍体积溶胶液（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100，则加入300溶
胶液），50-55℃水浴放置10，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色），可向含有的胶溶液中加10-30 3N醋酸钠（5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响与吸附柱的结合，影响回收效果。
3)将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13，000 离心30-60s，
倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合的能力较弱。
4)向吸附柱中加入700漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13，000 离心
30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。
5)向吸附柱中加入500漂洗液，13，000 离心30-60s，倒掉废液。
6)将离心吸附柱放回收集管中，13，000 离心2，尽量出去漂洗液，将吸附柱开盖于室温
1-2，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65-70℃预热的洗
脱液，室温放置2。
13，000 离心2收集溶液。
8)产物-20℃保存。
完毕后电泳检测回收与纯化效果：回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法进行回收与纯化。
实验四目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定
【实验步骤】
1载体与目的基因的连接
1)在一1.5 管中加入2酶切后的载体与6目的片段。
2)添加1的10×以及1的T4连接酶，总体积10。
3)16℃水浴条件下保温过夜连接。
2感受态细胞与连接产物的转化
1)取感受态细胞21（实验一制备）200，加入6连接产物，轻轻用枪吹打混匀（不可震
荡）。
2)冰浴30。
3)热激：42℃保温90S，冰浴2。
4)加入800 培养基，37℃慢慢复苏30。
5)将复苏菌液4000离心1，先吸去800μL上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取50μL细
胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素（）100、和的选择平板上。
6)将平板正向放置30左右至液体被吸收，倒置平板37℃培养16—20h出现菌落，其中白
色为重组质粒。
3 重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析）
1）将白色单菌落接入3 含抗生素（）的液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2）按实验二的方法提取质粒，20 溶解沉淀。
3）双酶切质粒20 体系，方法同上。
4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。
（酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的32a质粒条带，一为目的基因条带。
）
实验五目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的分析
实验I 、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
【实验步骤】
1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株）、蓝斑菌落（非重组菌株）于5 含的液体培养基中，37℃，190振荡培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌)。
2.分别取过夜培养菌1接种到5含的液体培养基中（蓝，白斑各3管，作好标记），于37℃摇床培养4h左右，达到1个值。
3.因为诱导剂的量,诱导条件,诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如下6组设计培养
摇瓶时间（）温度℃样液
5 7 32 白
5 7 37 白
5 7 42 白
5 7 32 蓝
5 7 37 蓝
5 7 42 蓝
4.分别取 6支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养5h。
5. 取1摇瓶后菌液于离心管，共6支，4℃低温离心，12000 ，5 ，收获菌体，弃上清，取沉淀（菌体可放-20℃存放备用）。
6.向每支试管沉淀均加入200μL 液，将细胞悬浮。
7. 每管加入200μL 2 X 。
开水煮沸5，再冰浴2，4℃,12000 ，5 ，取上清液做凝胶电泳。
8.观测结果及分析（实验Ⅱ）。
实验Ⅱ检测表达蛋白
【实验步骤】
1．配制分离胶
分离胶配方
双蒸水分离胶缓冲
液
30%胶贮液10 10
6.7 5 8 200μL 15μL 150μL
①按要求装好胶板
②按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2处，并小心在胶面上加入 1 蒸馏水，约 40 ，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插入 1.5 的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶)。
2.按配方配制好浓缩胶
浓缩胶配方双蒸水浓缩胶缓冲
液
胶贮液10 10
6.1 2.5 1.3 100μL 15μL 75μL
混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。
3．样品制备
菌体样品与 2×上样缓冲液 l:1 混匀，并在 100 C 沸水浴中保温 3-5 ，取出待用。
4.点样，电泳：开始电泳后，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，至电泳带跑到前沿后停止电泳。
5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液中染色30左右，最后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。