DNA与蛋白质相互作用研究方法
ChIP实验和Co-IP实验
ChIP 实验具体操作流程
实验视频讲解
以Thermo Pierce 的Agarose ChIP Kit 为例
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Part 2: Co-IP
Co-IP的起源和追溯
蛋白质间的相互作用控制着大量的细胞活动事件，如细胞 的增殖、分化和死亡，通过蛋白质间的相互作用，可改变细胞 内蛋白质的动力学特征，如底物结合特异性、催化活性；也可 以产生新的结合位点，改变蛋白质对底物的特异性，还可失活 其它蛋白质，调控其它基因表达，所以研究蛋白质间相互作用 就具有重大意义，如蛋白质亲和分析、亲和印迹、免疫沉淀和 交联等。
Co-IP实验图例
研究乳腺癌MDAMB468细胞中 HIF-1α和c-Jun两个蛋白之间 是否相互作用 ？选用CO-IP和IF 两个实验共同验证。
Thank you
Part 1: ChIP
DNA 和蛋白质相互作用的方法的比较
凝胶电泳迁移率改变分析（EMSA） 体
DNaseⅠ足迹法（foot printing）
酵母单杂交系统 DNA 微阵列技术
外
不能真实的反映体 内的情况，不能确 定细胞内重要转录 因子的靶序列，不 能阐明生理条件下 蛋白质和DNA 的 相互作用；并且 EMSA 法需用放射 性标记材料，比较 费钱、耗时。
ChIP实验原理
在活细胞状态下固 定蛋白质－DNA复合 物，并将其随机切断 为一定长度范围内的 染色质小片段，然后 通过免疫学方法沉淀 此复合体，特异性地 富集目的蛋白结合的 DNA片段，通过对目 的片断的纯化与检测， 从而获得蛋白质与 DNA相互作用的信息。
甲醛,交联
微球菌核酸酶
检测方法一般是：定 量PCR，基因芯片， 测序等。
DNA与蛋白质的相互作用--试验方法
今天学习DNA与蛋白质的相互作用--试验方法1. DNaseI足迹试验（DNaseI Footprinting）：是一类用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的专门的实验技术。
试验过程：首先是将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限制酶去掉其中的一个末端，得到只一条链单末端标记的双链DNA分子，而后在体外同细胞蛋白质提取物混合。
待二者结合之后，再加入少量的DNaseI(它可沿着靶DNA作随机单链切割)消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA链只发生一次磷酸二酯键断裂。
如果蛋白质提取物中不存在与DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射性标记末端1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相差—个核苷酸的、不间断的、连续的DNA片段梯度群体。
从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNaseI切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。
但是，如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能产生出相应长度的切割条带。
足迹试验的一个明显的优点是，可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域。
如果使用较大的DNA片段，通过足迹试验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间的结合位点的分布状况。
如同凝胶阻滞试验一样，我们也可以加入非标记的竞争DNA序列，来消除特定的“足迹”，并据此测定其核苷酸序列的特异性。
所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射性标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”。
应用DNaseⅠ足迹试验确定转录因子Sp1在HBV表面抗原启动子的结合位点为-4 9～-29核苷酸序列之间。
2. 凝胶阻滞试验(gel retartion assay)：又叫做DNA迁移率变动试验(DNA mo bility shtft assay)，是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝放电泳技术。
分子生物学试题及答案2
分子生物学试卷（二）生分子生物学试卷（二）一、选择题，选择一个最佳答案（每小题1.5分，共30分）1.DNA双螺旋结构模型的描述中哪一条不正确：（）A.腺嘌呤的克分子数等于胸腺嘧啶的克分子数B.同种生物体不同组织中的DNA碱基组成极为相似C.DNA双螺旋中碱基对位于外侧D.二股多核苷酸链通过A-T,C-T之间的氢键连接E.维持双螺旋稳定的主要因素是氢键和碱基堆集力。
2.有关DNA的变性哪条正确：（）A.变性是分子中磷酸二酯键的断裂B.变性后紫外吸收增加C.变性后粘度增加D.热变性DNA速冷后可复性E.DNA分子开始变性的温度叫Tm3.DNA聚合酶III的描述中哪条不对：（）A.需要四种三磷酸脱氧核苷酸作底物B.具有5′→3′外切酶活性C.具有3′→5′外切酶活性D.具有5′→3′聚合活性E.聚合反应需要引物4.有关反转录的正确叙述：（）A.反转录反应不需要引物B.反转录后的产物是cDNAC.反转录的板可以是RNA,也可以是DNAD.合成链的方向是3′→5′E.反转录反应的底物是4种NTP。
5.有关蛋白质合成，下列哪条是错误的：（）A.基本原料是20种氨基酸B.直接模板是mRNAC.合成的方向是从羧基端到氨基础D.是一个多因子参加的耗能过程E.是多聚核蛋白体循环6.在乳糖操纵子中，阻遏蛋白结合的是：（）A.操纵基因B.调节基因C.启动基因D.结构基因E.终止基因7.氨基酸活化酶：（）A.能识别一组同功tRNAB.催化磷酸二酯键的形成C.催化氨基酸结合到tRNAD.催化氨基酸的氨基与tRNA结合E.催化氨基酸的羧基与GTP反应8.稀有核苷酸含量最高的核酸是：（）A.tRNAB.mRNAC.rRNAD.DNAE.hnRNA9.真核与原核细胞蛋白质合成的相同点是：（）第 1 页共5 页A.翻译与转录偶联进行B.模板都是多顺反子C.转录后的产物都需要进行加工修饰D.甲酰蛋氨酸是第一个氨基酸E.都需要GTP10.与pCAGCT互补的DNA序列是：（）A.pAGCTGB.pGTCGAC.pGUCGAD.pAGCUGE.pTCGAC11.色氨酸操纵子的调控需要：（）A.增强子B.转录子C.衰减子D.顺反子E.调节子12.下列哪种氨基酸的密码子可作为起始密码：（）A.甲硫氨酸B.S-腺苷蛋氨酸C.苯丙氨酸D.丙氨酸E.以上都不是，而是TAG13.真核细胞中mRNA的加工修饰不包括：（）A.在mRNA3′末端另polyA尾B.mRNA的前体是核内hnRNAC.在mRNA5′端形成7甲基尿苷酸帽子结构D.除去非结构信息部分E.不同RNA片断之间的拼接14.真核生物基因组中没有：（）A.内含子B.外显子C.转录因子D.插入序列E.高度重复序列15.DNA的半保留复制需要（）A.核心酶和单链DNA结合蛋白B.模板DNA和四种NTPC.引物和RNA聚合酶D.DNA引物和连接酶E.冈崎片段和终止因子16.PCR实验的特异性主要取决于（）A.DNA聚合酶的种类B.反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结构和长度D.四种dNTP的浓度E.循环周期的次数17.RNA电泳转移后与探针杂交叫作：（）A.SouthernblotB.NorthernblotC.WesternblotD.斑点杂交E.原位杂交18.对限制性核酸内切酶的作用，下列哪个不正确：（）A.识别序列长度一般为4-6bpB.识别序列具有回文结构C.切割原核生物D分子D.只能识别和切割双链DNA分子E.只能识别和切割原核生物DNA分子19.在基因工程实验中，DNA重组体是指：（）A.不同来源的的两段DNA单链的复性B.目的基因与载体的连接物C.不同来原的DNA分子的连接物D.原核DNA与真核DNA的连接物E.两个不同的结构基因形成的连接物20.对基因工程载体的描述，下列哪个不正确：（）A.都可以转入宿主细胞B.都有限制性核酸内切酶的识别位点C.都可以连接进目的基因D.都是环状双链DNA分子E.都有筛选标志二、简答题（每题5分，共40分）1.衰减子2.DNA拓扑异构酶3.基因表达4.前导肽5.启动子6. DNA分子克隆技术7.G蛋白8.受体型酪氨酸激酶三、论述题（每题10分，共30分）1.操纵子中的诱导剂和辅阻遏对基因表达的调控有何不同？2.细胞内第二信使包括哪些物质?它们是怎样产生的,有何作用?3.PCR和细胞内DNA复制两者有哪些主要的相同点和不同点?参考答案一、选择题，选择一个最佳答案（每小题1.5分，共30分）1.D；2.B；3.A；4.A；5.A；6.C；7.C ；8.C ；9.B；10.E二、填空题（每题1分）1．质粒DNA具有三种不同的构型分别是：（SC构型）、（oc构型）、（L构型）。
研究蛋白质与dna相互作用的方法
X射线晶体学
总结词
X射线晶体学是一种通过分析晶体结构来研究分子结构和相互作用的方法。
详细描述
X射线晶体学利用X射线照射蛋白质和DNA的晶体，通过散射现象分析出分子内 部的原子排列和空间结构，从而揭示蛋白质与DNA相互作用的细节。
核磁共振（NMR）
总结词
核磁共振是一种通过分析原子核的磁性和射频响应来研究分 子结构和动态的方法。
研究蛋白质与DNA相 互作用的方法
• 引言 • 研究蛋白质与DNA相互作用的方法 • 实验技术与数据分析 • 结果与讨论 • 结论与展望
目录
Part
01
引言
研究背景与意义
蛋白质与DNA相互作用在生物学中具有重要意义，是基因表达、复制和修复等过程的关 键环节。
了解蛋白质与DNA相互作用有助于揭示生命活动的本质，为疾病诊断和治疗提供新思路。
统计分析
01
统计分析方法选择
根据研究目的和数据特点，选择 合适的统计分析方法，如回归分 析、方差分析、聚类分析等。
02
统计分析过程
对处理后的数据进行统计分析， 探索蛋白质与DNA相互作用的特 点和规律。
03
结果解释与报告撰 写
根据统计分析结果，给出合理的 解释和结论，并撰写研究报告或 论文。
Part
同时，我们也需要加强与其他学科的 交叉合作，如物理学、化学和计算机 科学等，以推动蛋白质与DNA相互作 用研究的深入发展。
THANKS
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蛋白质与DNA相互作用概述
蛋白质与DNA相互作用 是指蛋白质通过与DNA 结合，调控基因的表达、 复制和修复等过程。
蛋白质与DNA相互作用 的主要方式包括DNA结 合蛋白、转录因子和 DNA酶等。
DNA-蛋白质交联的研究进展
DNA-蛋白质交联的研究进展DNA-蛋白质交联是一种重要的生物化学过程，它在细胞内发挥着关键的作用。
DNA-蛋白质交联是指DNA分子和蛋白质之间的相互作用，它能够调控基因的表达、维持染色体结构、参与DNA修复和复制等多种生物学过程。
近年来，科学家们对DNA-蛋白质交联的研究取得了令人瞩目的进展，不仅揭示了其在细胞生物学中的重要作用，还为人类疾病的治疗和诊断提供了新的思路。
本文将从DNA-蛋白质交联的定义、机制、生物学功能和研究进展等方面进行介绍和探讨。
一、DNA-蛋白质交联的定义和机制DNA-蛋白质交联是指DNA分子与蛋白质之间通过共价或非共价键结合的现象。
在细胞内，DNA-蛋白质交联是通过蛋白质与DNA双螺旋结构上的特定序列、特定结构区域相互结合而形成的。
蛋白质在不同的生物学过程中与DNA结合的方式有所不同，主要包括非特异性结合和特异性结合两种机制。
非特异性结合是指蛋白质与DNA上的任何位点都可以相互结合，通常是通过电荷间相互作用、疏水作用等方式实现的。
这种结合方式在染色体的包装中起到了重要的作用，如组蛋白与DNA的结合就是通过非特异性结合实现的。
DNA-蛋白质交联的形成是通过蛋白质的结构域（如DNA结合结构域、螺旋转录因子结构域、锌指结构域等）与DNA上的特定序列或特定结构区域之间的相互作用实现的，这种相互作用对于调控基因的表达、维持染色体的结构和稳定性、参与DNA修复和复制等生物学过程具有重要的意义。
对于DNA-蛋白质交联的研究不仅有助于深入理解细胞生物学过程，还对人类疾病的治疗和诊断具有潜在的应用价值。
DNA-蛋白质交联在细胞生物学过程中发挥着多种重要的生物学功能，主要包括以下几个方面：1. 调控基因的表达DNA-蛋白质交联通过调控基因的转录、剪接和翻译等环节，参与调控基因的表达。
许多转录因子与DNA结合后能够激活或抑制某些基因的转录，从而对基因的表达进行调控。
2. 维持染色体的结构和稳定性DNA-蛋白质交联通过调控染色体的组装和结构，维持染色体的稳定性和整体结构。
DNA蛋白质的相互作用
6.染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA 上结合位点的鉴定 染色质免疫沉淀的DNA的分析方法有许多种。 如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列 是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和PCR分析; 如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋 白在基因组上的分布情况,找出反式作用因子的结合位 点,可以采用Southern杂交、ChIP克隆和DNA芯片方法。
酵母中的转基因相互作用 同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶启动下游报告 基因的转录 。
13
设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告 合表达的cDNA质粒转化入同一酵母中;11
检测靶DNA中特异G残基的优先甲基化对而 后的蛋白质结合作用会有什么效应，从而更 加详细地揭示DNA与蛋白质之间的相互作用 模式。 DMS化学干扰只能在G和A残基甲基化，不能 使T和C甲基化。 故本实验为足迹实验的补充手段。
12
四、酵母单杂交技术
真核生物中 ，转录因子中DNA 结合结构域(DNAbinding domain BD)与转录激活结构域( activationdomain AD) 能够相互独立发生作用。
2
凝胶阻滞试验 DNaseI足迹试验 甲基化干扰试验 体内足迹试验 酵母单杂交技术 染色质免疫沉淀技术 噬菌体展示技术 核酸适体技术 生物信息学方法 蛋白质芯片技术及纳米技术
3
一、凝胶阻滞试验 （DNA迁移率变动试验 DNA mobility shift assay）
1 原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电 极移动的距离与其分子量的对数成反比。 如果此时DNA分子与某种蛋白质结合， 由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞 在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。
蛋白质与蛋白质、DNA相互作用研究方法加实例
蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法
一.酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 二.免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) 三.GST pull-down 技术 四.荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET）
两种应用： 1）确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用 2）证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
3.2 方法： 1） GST融合蛋白先与下列蛋白溶液之一孵育（a, 单一明确 的重组蛋白；b，细胞裂解蛋白混合液；c, 体外翻译cDNA 表达得到的未知蛋白）
2）混合液与谷胱甘肽琼脂糖球珠反应 4º C 2h
1.5 酵母双杂交技术的弱点：
1. 假阳性：自激活、多因子参与…… 2. 3. 假阴性：毒性蛋白、膜蛋白、难表达的蛋白…… 低等真核细胞不能完全等同于高等真核生物的情况
酵母双杂交实验的结果必须经过多方面的验证，包括： 1. 体外相互作用验证 体外亲和纯化（GST pull-down）、体外免疫共沉淀…… 2. 哺乳动物细胞内验证 亚细胞共定位、体内免疫共沉淀……
1.3 应用
酵母双杂交系统是一种在酵母细胞内分析蛋
白质相互作用的技术。主要有二类载体: a 含 DNA -binding domain的载体; b 含Transcription-
activating domain的载体。另外还需要特殊的酵
母菌株如GAL4缺陷型。
•
它可用于：
– – – 检验蛋白质间的相互作用； 分析蛋白质相互作用的结构域； 发现新的作用蛋白质。
分子生物学的研究方法-DNA-蛋白质相互作用
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
西北师范大学 ---生命科学院<分子生物学>
第五章 分子生物学研究的主要方法
足迹试验的优点
可以形象地展示出一种特殊的蛋白质因子同特定DNA片段 之间的结合区域。如果使用较大的DNA片段，通过足迹试 验便可确定其中不同的核苷酸序列与不同蛋白质因子之间 的结合位点的分布状况。如同凝胶阻滞试验一样，也可以 加入非标记竞争DNA，来消除特定的足迹，据此确定其核 酸序列的特异性。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
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第六节
原理
研究DNA与蛋白质相互作用的方法
2.6.1 凝胶阻滞试验
又叫做DNA迁移率变动试验，是80年代初出现的用于在体外研究 DNA与 蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。简单、快捷，是当前被选 作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA朝正电极移动的距离是同 其分子量的对数成反比，如果DNA分子结合上一种蛋白质，那么由于分 子量加大，在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，朝正电极移动的距离也 就相在缩短了。所以当特定的 DNA片段同细胞提取物混合之后，若其在 凝胶电泳中的移动距离变小了，这就说明它已同提取物中的某种特殊蛋 白质分子发生了结合作用。
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第五章 分子生物学研究的主要方法
从此混合物中除去蛋白质之后，将DNA片段群体加样在变性的DNA
测序凝胶中进行电泳分离，经放射自显影，便可显现出相应于DNasel
切割产生的不同长度DNA片段组成的序列梯度条带。但是，如果有一 种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那么它就将保护这 一区段的DNA免受DNasel的消化作用，因而也就不可能产生出相应长 度的切割条带。所以在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质 结合的部位是没有放射标记条带的，出现了一个空白的区域，人们形 象地称之为“足迹” 。