细胞生物学实验三 小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数(山东大学)
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数
细胞生物学实验报告题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数姓名：余振洋学号：200900140156 系年级：09级生科三班时间：2011/5/26一、【实验目的】1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。
2、学习细胞计数的方法。
3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。
二、【实验材料】1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记笔、超净工作台、CO2培养箱等2．实验试剂：PBS液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水3．材料：小白鼠三、【实验原理】1．细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长和繁殖。
细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。
2．细胞死活鉴定。
常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。
而活细胞能阻止染料进入细胞内，呈无色。
故可以鉴别死细胞与活细胞。
本次实验即采用此方法。
伊红Y 法：细胞悬液与3倍量的0.15%伊红染液混合，2min后制片镜检，死细胞被染成红色而活细胞呈无色。
3．细胞计数：血球计数板（如图1所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网，每个方格网共分9大格，其中的一大格即为计数室。
小鼠脾细胞培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数崔文强201300140012 2015.4.7 【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。
定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。
用滤器过滤除菌。
④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
观察小鼠脾脏实验报告
观察小鼠脾脏实验报告观察小鼠脾脏的形态和组织结构，了解其基本组织构成和功能。
实验步骤：1. 实验前准备：a. 所需实验器材：手套、手术刀、显微镜片等。
b. 所需实验物品：小鼠尸体、解剖盘、理化盐水等。
2. 实验过程：a. 将小鼠尸体放在解剖盘上，进行外部解剖。
观察小鼠的腹部，用手术刀轻轻切开腹部皮肤。
b. 将小鼠的内脏器官暴露出来，找到脾脏。
c. 将脾脏取出，放在显微镜片上，用理化盐水清洗，以去除血液和杂质。
d. 用显微镜观察脾脏的形态和组织结构，并进行描述。
实验结果：小鼠脾脏是一个椭圆形的器官，位于腹腔的左上前部，与胃相邻。
观察到脾脏表面光滑，颜色暗红，呈现出类似叶片的形态。
通过显微镜观察，可以看到脾脏由纤维结缔组织包膜包裹，包膜内有纵横交织的网状纤维和平滑肌纤维。
进一步观察脾脏切片，可以发现脾脏内部由红髓和白浆组成。
红髓部分是由红色血球聚集而成，呈现出深红色，主要负责产生和贮存红血球。
白浆部分呈现出浅红色，主要负责产生、贮存和分化白血球。
除了红髓和白浆，还可以观察到脾小体。
脾小体是脾脏的功能单位，由中央的细动脉和围绕其排列的淋巴组织组成。
细动脉在脾小体内分支，形成富集淋巴细胞的血窦，血窦内的小窦构成了纤维结缔组织和巨噬细胞，这些巨噬细胞负责清除衰老或异常的红血球和其他细胞碎片。
实验分析与结论：通过观察小鼠脾脏的形态和组织结构，可以得出以下结论：1. 小鼠脾脏是一个椭圆形的器官，位于腹腔的左上前部，与胃相邻。
2. 脾脏具有纤维结缔组织包膜，包膜内有纵横交织的网状纤维和平滑肌纤维。
3. 脾脏主要由红髓和白浆组成。
红髓部分负责产生和贮存红血球，白浆部分负责产生、贮存和分化白血球。
4. 脾小体是脾脏的功能单位，由细动脉和排列的淋巴组织构成。
血窦和小窦在脾小体中起到清除血液中异常细胞和细胞碎片的作用。
脾脏是小鼠免疫系统的重要组成部分，它在免疫应答中起到重要的作用，如清除病原体和损伤细胞，调节细胞免疫和体液免疫等。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验背景：一、细胞培养的基本条件：1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器4.细胞保存条件：液氮罐1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。
净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。
2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。
定期消毒（90 ℃，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
三、细胞培养用液的配制：1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液PBS：NaCl 8.0 gKCl 0.2 gNa2HPO4.H2O 1.56 gKH2PO4 0.20加水至1000 ml3.消化液：①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。
③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。
用滤器过滤除菌。
④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用4.培养基：培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。
①天然培养基：天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
小鼠脾细胞培养实验
小鼠脾细胞培养实验Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT山东大学实验报告2011年3月30日姓名张行润系年级 2009级生科4班学号同组者张少华科目细胞生物学实验题目小鼠脾细胞培养实验仪器编号 105一、实验目的了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
学习细胞计数、营养液的配制等，初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理(一)细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
(二)细胞死活鉴定死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。
染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。
染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。
死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。
常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。
台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。
所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。
甲基蓝有类似的染色机理。
植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数实验报告-山东大学
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数【实验目的】1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养；2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；【实验原理】1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域（如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等）已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
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实验三小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数13生物基地 201300140059 刘洋 2015-04-06同组者：吕赞洪俊蔡正琦一、实验目的1.学习掌握细胞培养的基本原理以及具体方法，并对小鼠脾细胞进行原代培养。
2.掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用。
3.学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法。
4.学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数。
二、实验原理1.细胞培养细胞培养指的是在无菌条件下，把动植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。
当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。
传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。
但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。
因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点；培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察；在生物学的各个领域(如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等)已被广泛应用。
细胞培养的局限性：在脱离机体复杂环境下，细胞培养条件与躯体环境有一定距离；观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况；细胞培养得到的产物少。
培养细胞的条件有水的质量、无菌环境，最适温度、渗透压、气体条件、最适PH、营养条件和培养基质等。
2.细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。
活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存以下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。
基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。
此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。
活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。
②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。
基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯(FDA)、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。
另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。
亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。
活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。
3.血球计数板的使用血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。
中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网(如图3)。
每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。
计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。
但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成(图4)。
每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。
使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。
图1 血球计数板的构造(a、平面图；b、侧面图)图2血球计数板网格的分区和分格三、实验材料和用品1.材料小鼠脾脏；2.试剂PBS缓冲溶液、1640培养液、台盼蓝；3.器材解剖剪、解剖镊、培养皿、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、EP管(上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好)、倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板等。
四、实验步骤1.原代脾细胞培养1) 取材：取小白鼠一只，采用断头法处死，清水洗净小白鼠并浸于75%酒精中灭菌3min，取出转入超净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1-2次，转入无菌玻璃培养皿中，待用。
2) 分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用L形针头注射器在皿内吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾脏长轴方向注射入脾内，用针尖在脾脏上扎眼，并用L形针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲洗脾脏并吹散挂出的脾细胞，稍微倾斜并静置1-2min，吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入EP 管，以3000转/分离心1-2min。
3) 培养脾细胞：从超净工作台中区塑料培养皿一个，用移液器加入细胞培养液2ml，并在皿上做记号，待用。
取上述离心后的EP管，在超净工作台内打开弃去上清液，用“移液器吸取塑料皿中的培养液400ul，加入弃去上清液的EP管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ul脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃二氧化碳培养箱中培养。
2.细胞死活鉴定(台盼蓝法)1) 试剂配制：用生理盐水配置0.4%台盼蓝染液，备用。
2) 染色制片：取0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴(约0.1ml)染液，混合，2min 后制成临时装片，镜检。
3) 染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
3.用血球计数板进行细胞计数1) 染色计数：取上述步骤二所制备0.5ml 细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴(约0.1ml)染液，混合2-5min ，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室(注意：不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加；在普通光镜物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右)。
2) 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：%100-%⨯=细胞总数死细胞数细胞总数）活细胞率（五、 实验结果用血球计数板计数，分别计算了角上的四个大方格，计数结果如下：稀释程度：5倍×100%=44.6%六、 注意事项1.小鼠一定要将血放干净并且在酒精中充分浸泡3min ，防止杂菌污染无菌操作台；2.为近一步保证无菌操作台的无菌环境，可在玻璃挡板口点一酒精灯，一般操作都在酒精灯火焰旁操作；3.取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准且适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散游离出来，也不能使游离的细胞中含有块儿状物质；4.培养液PH 为7.0～7.4，其中加有酚酞，正常状况细胞生长过程代谢物使PH 下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况；5.生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。
除游离期和衰退期外细胞一般贴壁生长。
游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分；6.倒置显微镜将物镜与载物台间的空间解放，可以允许连同培养皿一同观察。
七、附录1.抑制肿瘤细胞增殖药物的筛选方法1) MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
步骤：a) 接种细胞用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。
b) 培养细胞同一般培养条件，培养3－5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。
c) 呈色培养3－5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
d) 比色选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
2)NCI所用的体外化疗药物筛选法简单地说，NCI的体外化疗药物筛选系统由60种不同的人体肿瘤细胞株组成，测定每个受试化合物在一定浓度范围抑止各肿瘤细胞的生长的能力或细胞毒性程度。
以常规采用的筛选试验为例，在实验开始前一天，所有60种肿瘤细胞株细胞先接种在96孔细胞培养板上，然后将受试化合物10倍梯度稀释，一般最高浓度采用10－4mol。
每种化合物试验5种不同浓度。
样品加入细胞悬液后培育48小时。
此后用细胞染色法测定细胞的生长曲线，用sulforhodamine染色，再测定吸光度用以估计细胞数目。