胶内酶切及MALDI-TOF-TOF质谱鉴定操作步骤
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
Maldi-TOF-MS（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）是一种常用于鉴定微生物菌
株的快速、准确且高通量的技术。
以下是Maldi-TOF-M鉴定
菌株的一般流程：
1. 准备样本：从培养的纯菌培养物中取一小块细菌落或菌液，然后在银基质上涂抹样品。
2. 干燥：将样品凉干或使用空气吹干，以去除水分。
3. 氨基酸基质添加：使用辅助基质（常见的是α-氰基-4-羟基
肉豆蔻酸）涂抹在样品上，以促进离子化。
4. 晶片装载：将处理好的样品芯片放入MALDI-TOF质谱仪中。
5. 质谱测量：向样品表面照射激光，产生离子化的分析物质，并根据离子质量通过飞行时间测量分析物的质量-电荷比
（m/z）。
6. 数据分析：使用专门的软件将测得的质谱数据与数据库中的参考谱进行比较，以鉴定菌株。
根据样品的质谱图与数据库中的谱图进行匹配，软件会给出最符合的结果。
7. 结果解读：根据软件提供的匹配结果和相似度，判断菌株的种属和可能菌株。
总的来说，Maldi-TOF-M鉴定菌株的流程主要包括样品准备、质谱测量和数据分析等步骤，通过比较样品的质谱与数据库中的参考谱图，可以准确快速地鉴定菌株。
Maldi-tof技术与质谱仪的使用
MALDI常用点靶方法
• 干滴法（Dried Droplet）
– 样品和基质充分混合，点样样品靶上。 注意：以HCCA和DHB为基质的样品，一般用干 滴法点靶
• 薄层法 – 先将基质点于靶上，带基质结晶后，再把样品溶液点于基质的层上。 – 注意：以HPA为基质的样品，都要采用薄层法
注意事项
1. 点靶，枪头不得接触样品靶；点靶的样品 和基质混合物，不超过1μl。 2. 正离子一般均可出峰，如果正离子未出峰， 换负离子模式检测。 3. 点样样品不得含有DMSO和DMF等非挥发性 溶剂。
MALDI TOF MS的构成 的构成
variable attenuator laser
trigger diode
1.8 m linear
250 l/s turbo
250 l/s turbo
检测器1： 检测器 ：线性模式
检测器2： 检测器 ：反射模式
反射模式下TOF的分辨率高于线性模式
线性模式和反射模式
MALDI-TOF质谱仪的使用
1. 标准品点靶；样品点靶； 2. 进样品靶； 3. 质谱测试和图谱保存：flexcontrol软件； 4. 图谱读取和分析：flexanalysis软件
点靶注意事项
• 移液枪的使用
– 取不同试剂，需要更换一次性枪头。
• 点靶注意事项
– 防止基质污染，防止标准品污染，防止样品靶 污染，防止试剂污染 – 防止样品靶跌落 – 点靶MALDI-TOF技术与质谱仪的使用
南开大学元素所 张森
MALDI技术
• 离子化技术：MALDI 离子化技术：
– Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization
胶内酶解
1.2.2 蛋白质谱鉴定（1）胶内酶解斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。
操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。
脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。
加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。
酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。
加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。
加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。
将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。
用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。
保存？？？（2）质谱鉴定①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。
取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。
待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。
②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。
肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。
谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
MALDI-TOF-MS （Maldi-Time of Flight-Mass Spectrometry, 耐
抗谱分）
实验材料：
- MALDI-TOF-MS设备
- 培养菌株
- 甲醇
- 三氟乙酸
- 培养基
实验流程：
1. 培养菌株：将需要鉴定的菌株在适当的培养基上进行培养。
2. 菌株处理：从培养基上选择一个单纯的菌落，用无菌平片将其转移到一个干净的Eppendorf管中。
3. 菌株提取：在Eppendorf管中加入少量甲醇和三氟乙酸溶液，使用涡旋混匀片刻，使菌细胞充分裂解释放出内部物质。
4. 预处理：将混匀后的细胞提取液转移到MALDI-TOF-MS设
备的样品板上，并将其蒸发至干燥。
5. 涂覆基质：在样品板上加上MALDI基质（常用的基质有辛
基环磷酸、α-环磷酸、环蛋白等），使其充分覆盖菌株提取液。
6. 激光照射：将样品板放入MALDI-TOF-MS设备中，通过激
光照射基质，产生离子，使菌株提取物中的分子离子化。
7. 飞行时间质谱：离子化的分子通过飞行时间质谱仪进行分析，根据不同分子的质量与飞行时间的对应关系，得到质谱图。
8. 数据分析：将质谱图与已知数据库中的菌株质谱图进行比对，使用专门的软件进行数据分析，确定菌株的种属或进行进一步
分析。
注意事项：
- 携带手套和其他必要的个人防护装备，以避免可能的细菌感染。
- 确保所有使用的材料都是无菌的，防止污染和交叉感染。
- 在进行质谱分析之前，确保MALDI-TOF-MS设备的正常运行和校准。
详解蛋白质质谱鉴定技术原理和方法
详解蛋白质质谱鉴定技术原理和方法质谱分析技术有着高灵敏度，高精准度等特点，能够准确快速地鉴定蛋白质。
传统的质谱技术仅限于小分析物质的分析，随着新的离子化技术的出现和发展，如基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾电离质谱（ESI-MS）等，为准确快速鉴定蛋白质等大分子提供了便捷的条件。
目前，酶切蛋白质，液相色谱分离肽段，串联质谱分析多肽氨基酸序列，联合质谱数据分析已成为了鉴定蛋白质的首选方案。
本文主要讲下蛋白质谱鉴定的原理和应用。
一、MALDI-TOF基质辅助激光解吸附质谱技术（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight, MALDI-TOF）的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。
MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的质量有一一对应关系。
MALDI产生的离子常用飞行时间（TOF）检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足够，TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此MALDI-TOF 质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。
MALDI-TOF-MS分析。
技术特点。
• MALDI-TOF 鉴定方便、快速，可以同时做上百个斑点。
• 主要用于纯蛋白或简单样本的鉴定，如2DE斑点。
• 成本较低。
样品要求。
• 蛋白质溶液：纯度> 90%；蛋白质总量> 5 ug，浓度> 0.1 ug/ul。
• 双向凝胶电泳点：考染、银染点清晰可见。
• SDS-PAGE胶条：单一蛋白质，考染、银染条带清晰可见。
二、ESI-MS电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。
蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程
蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程仪器：ABI 4800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪(ABI)、真空冷冻干燥机、水浴锅、Mascot分析软件、移液器、离心管主要溶液配置：考染脱色液：25mmol/L NH4HCO3、50%乙腈的水溶液银染脱色液：15mM K3Fe(CN)6、50mM NaS2O3的水溶液脱水液1：50%的乙腈溶液脱水液2：100%的乙腈吸胀液：25mmol/L NH4HCO3的水溶液酶解覆盖液：25mM的NH4HCO3、10%乙腈的水溶液酶解工作液：含0.02ug/ul胰蛋白酶的酶解覆盖液蛋白萃取液：含5% TFA、67%乙腈的水溶液一、实验操作：1、将0.2ml的枪头前端剪去0.5cm，以增大孔径，2、将枪头垂直戳向凝胶上的蛋白点，旋转枪头直至将胶点取下，3、将取好的胶粒转入装有去离子水的0.5ml离心管里，用枪头反复吸打溶液至枪头内胶粒进入离心管，4、吸干去离子水后封盖保存并做好标记。
二、注意事项：1、离心管最好用进口离心管，以免塑料污染；水最好用去离子水，2、取点时带好口罩与手套以及头套，以免皮屑等角蛋白的污染，3、蛋白鉴定需要的蛋白量越多越好，所以尽可能把某一个点里所有的蛋白全部取到，不过某些比较大的点就只要取一部分就可以了，4、针对特别小的蛋白点，枪头孔径可能会比蛋白点面积大，取点时把该蛋白点的边上空白部分也一起取一些下来也不要紧，5、蛋白点的纯度越高越容易鉴定，一般双向电泳的点都是独立的蛋白，纯度完全满足鉴定的要求，针对有部分交叉的蛋白点，取点时注意不要取混，混合的蛋白点增加质谱鉴定的难度，降低鉴定成功率，6、取完的蛋白点可以放在室温下保存1周左右，可以放在-20度或者-80度保存半年以上，7、只有胶图上清晰可见的蛋白点，其含量就足够用于质谱鉴定，所以只要取一次蛋白点就可以了，不需要把几张胶上的蛋白点取了放在一起进行鉴定，同时注意不要把胶点弄得太碎8、条件允许的话可以多取一次胶点的重复以做好备份。
质谱分析级胰岛素 质谱分析 级赖氨酸肽链内切酶
【特点】
●赖氨酸肽链内切酶可以特异性地分解蛋白质的切断部位,因此便于根据肽的质 谱在数据库中进行检索。
●通过同时使用赖氨酸肽链内切酶及胰岛素,可以更确实地切断赖氨酸残基,从 而可以得到更多的肽。
●自我消化极少。 ●根据相应使用量,分成微量小包装。
【胰岛素(Tp)、赖氨酸肽链内切酶(Lep)及两者同时使用的效果比较】
Lep
赖氨酸的Lep 切断部
精氨酸、赖氨酸的C末端 Missed 少(3 %)
22
※根据Missed Cleavage 1进行数据库检索时所得到的回收率(得到的肽链占序列整 体 的比例)与根据Missed Cleavage 0进行数据库检索时所得到的回收率的差值。
单独使用胰岛素
同时使用胰岛素及赖氨酸肽链内切酶
回收率提高
图:单独使用Tp及同时使用Tp与Lep时的质谱
同时使用Tp与Lep时,可以在m/z 20 00附近得到一个峰值,而这个 峰值在单独使用Tp时则得不到。该峰值表明肽的回收率得到增加。 (数据提供:大阪府立母子医疗中心和田芳直先生)
编号
293-57701
品名
银染质谱分析试剂盒
规格
电泳用
容量
20次
编号
299 -58901
品名
阴性凝胶染色剂质谱分析试剂盒
规格
电泳用
容量
20次 K.T. A
Negative Gel Stain MS Kit(阴性凝胶染色剂质谱分析试剂盒) 本品 可以在相对较短的时间里检出SDS-PAGE后的蛋白质条,其灵 敏度与 银染试剂基本相同。与现有的蛋白质条的染色方法不同,实施 阴性染色 可使蛋白质以外的部分白浊化,因此可得到更清晰的蛋白质 条或蛋白 质染点。由于蛋白质不会被色素所修饰,因此非常适于进行 Western blot、氨基酸序列分析及质谱分析。
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
maldi-tof-m 鉴定菌株的流程
MALDI-TOF-MS（Matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass spectrometry）是一种常用的菌株鉴定技术，其流程通常包括以下步骤：
1. 菌落的制备：从纯培养菌株中挑取单个菌落，并在培养基上培养。
2. 提取蛋白质：利用酸性有机溶剂或氯仿/甲醇溶剂将菌落中
的蛋白质提取出来。
3. 涂片制备：将提取得到的蛋白质溶液加载到MALDI-TOF靶板上的目标位置，加上适量的基质（通常为辅助吸附样品分析的物质，如小麦胰蛋白酶），使其干燥。
4. 质谱仪测定：将靶板放入MALDI-TOF-MS仪器中，通过激
光照射样品，产生离子化的蛋白质分子。
离子化的蛋白质经由电场加速，射入一个含有相同电荷量的电场管道中，从而通过电场加速分子，使其以不同离子所受到的电荷量比例有所差别，进而测得离子质量比时间。
5. 数据分析：通过质谱仪测得的质谱图，利用质谱数据库进行匹配和比对，确定菌株的鉴定结果。
比对的过程通常通过计算相似性分数或利用专用软件进行评估。
6. 结果解读：根据数据库匹配的结果，确定菌株的鉴定结果，并进行相应的记录和报告。
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蛋白质肽谱制备1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。
★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。
★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。
★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤：①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机）3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min.4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。
★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。
补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。
（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。
）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。
6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。
7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。
（冻干的肽段放-20度冰箱保存）8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。
（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。
）9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。
待干，再点0.5ul基质，上质谱。
溶液配制1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:13. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug-20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。
)6．酶解工作液：Trypsin终浓度为0.01ug于25mMNH4HCO3溶液（2ul稀释50倍=100ul）7．肽提取液I:5%TFA(v/v)水溶液8．肽提取液II: 乙腈：5%TFA=1:1MALDI-TOF-TOF操作手册一：反射模式校正/测量样品的简单操作流程1.将靶的缺角放在左下角，准备进靶。
2.新建一个spot set，或者打开一个以前建好的spot set。
3.进靶，选定靶的spot set。
4.打开Acquisition Method一级方法,根据校正模式修改设置，保存。
5.打开Processing Method一级方法, 根据校正模式修改设置，保存。
6.选定CAL1-CAL13进行一级校正。
7.打开Acquisition Method二级方法,根据校正模式修改设置，保存。
8.打开Processing Method二级方法, 根据校正模式修改设置，保存。
9.选定CAL6-CAL8进行二级校正。
10. 将Acquisition Method一级方法、Processing Method一级方法、Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法，根据测量模式修改设置，保存。
11.打开一、二级联用的方法Interpretation Method,将改好的Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法填入，保存。
12.在job模式下，填好需要测量的点，填好测量方法，进行一、二级测量。
二：反射模式校正/测量样品的详细操作流程★打开软件的初始界面：进靶激光开关一、二级联用方法测量方法采集方法分子量★新建一个spot set★ 进靶，选定靶的spot set ★Name your spot set★Name your plate★select a spot set template选择384 Opti-TOF 然后选择select★spot set massager可以根据条件打开之前某一/几次job★Job窗口一级校正模式测量模式二级校正模式★打开Acquisition Method一级方法★打开Acquisition Method一级方法Acquisition Method二级方法Acquisition Method一级方法★Acquisition Method一级方法的修改界面待检测样品的分子量范围一般为700-4000Da关心的分子量焦点★Acquisition Method一级方法的修改界面激光在测量中移动的次数和时间★Acquisition Method一级方法的修改界面激光强度（用以下几条标准来调整）：①校正时，以使得信号强度达到e*104以上为准②测量时，以使得信号强度达到5000以上为准★打开Processing Method一级方法★打开Processing Method一级方法Processing Method二级方法Processing Method一级方法★Processing Method一级方法的修改界面一级测量模式★Processing Method一级方法的修改界面一级校正模式校正参数的设置：Min S/N : 20Mass Tolerance :+/-0.5Min Peaks to match：5 or 4Max Outlier Error：20——>10——>5 修改后保存，然后在job中选定待校正的CAL1-CAL13进行一级校正。
★打开Acquisition Method二级方法,根据校正模式修改设置进行二级校正的母离子分子量：1606.855（这是因为校正的标准品为马心肌红蛋白，1606.855是它最常见且信号比较强的一个肽段分子量值。
）★打开Acquisition Method二级方法,根据校正模式修改设置激光在测量中移动的次数和时间★打开Acquisition Method二级方法,根据校正模式修改设置激光强度（用以下几条标准来调整）：①校正时，以使得信号强度达到e*104以上为准②测量时，以使得信号强度达到3000以上为准★.打开Processing Method 二级方法二级测量模式★打开Processing Method二级方法,根据校正模式修改设置二级校正模式校正参数的设置：Min S/N : 10Mass Tolerance :+/-0.5——>0.2——>0.1Min Peaks to match：5 or 4Max Outlier Error：50——>20——>10 修改后保存，然后在job中选定待校正的CAL6-CAL8进行二级校正。
★打开一、二级联用的方法Interpretation Method★打开一、二级联用的方法Interpretation Method,将改好的Acquisition Method二级方法、Processing Method二级方法填入，保存。
将改好的Acquisition Method二级方法填入将改好的Processing Method二级方法填入★在job 模式下，填好需要测量的点，填好测量方法，通过提交、运行、暂停和终止操作来进行一、二级测量。
选定需要进行一、二级测量的点Acquisition Method 一级方法Processing Method 一级方法一、二级联用的方法Interpretation Method运行、暂停、终止jobThe parameters were set as follows:MS (precursor-ion) peak filtering: 700–4000 Da interval, monoisotopic, minimum S/N= 20, mass tolerance =+/-0.5M/Z; MS/MS (fragment-ion) peak filtering: monoisotopic,M1H1, minimum S/N=10, MSMS fragment tolerance= 0.1 Da; database used:ncbi-green plants. During the initial MS scan, the data were analyzed as PMF and preliminary protein IDwas done by searching against the database using theMASCOT (Matrix Science, Boston, MA) algorithm.Only proteins with total Protein ScoreC.I.%.95% were considered as a positive ID.The samples were analyzed using an ABI 4700 ProteomicsAnalyzer MALDI-TOF/TOF mass spectrometer(Applied Biosystems, Foster City, CA), and protein identification(ID) was performed using the Result DependentAnalysis (RDA) of ABI GPS Explorer software, version 3.5(Applied Biosystems). The parameters were set as follows:MS (precursor-ion) peak filtering: 800–4000 m/z interval, monoisotopic, minimum S/N=10, mass tolerance =75 ppm; MS/MS (fragment-ion) peak filtering: monoisotopic,M1H1, minimum S/N=3, MSMS fragment tolerance= 0.2 Da; database used: Listeria taxonomic sub-databaseof “nr” (non redundant) database of National Centerfor Biotechnology Information. During the initial MS scan,the data were analyzed as PMF and preliminary protein IDwas done by searching against the database using theMASCOT (Matrix Science, Boston, MA) algorithm. Proteinswith high confidence ID (Cross Confidence Interval(C.I.%).95%) were automatically selected for “in silico”digestion, and their three most prevalent corresponding peptides-precursor ions present in the MS spectra were selected for MS/MS analysis–RDA_1 (top protein confirmation). The sample spots not yielding high confidence IDafter preliminary PMF ID and/or after RDA_1 ID weresubjected to RDA_2 by selecting the first 20 most intensive precursor ions in the MS spectra for MS/MS analysis. The spectral data from the PMF (initial MS scan), RDA_1 andRDA_2 MS/MS were together subjected to a combinedMASCOT search. Only proteins with total Protein ScoreC.I.%.95% were considered as a positive ID. The functional categories of the identified proteins were determined according to the ListiList Listeria genome database (http:// genolist.pasteur.fr/ListiList/).。