牛卵母细胞孤雌激活研究
２
１ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ 、０．０５％ＢＳＡ）中平衡 １－ ２
２ｍｉｎ 后转入充满融合液的极间距为 ０．１ｍｍ 的融合槽中，在解剖镜下用吸管调整各个卵 母细胞之间的距离进行激活，激活后的卵放 到 Ｆ Ｍ 液中，待全部激活后将卵移入 Ｈ － Ｍ１９９ 中洗涤，然后放入 ＩＶＭ 中，在培养箱 中培养 ３０ｍｉｎ。计算融合率。实验分 ６ 组，固 定脉冲时间为 ２０ μ ｓ，在 ３ 种电压（１．７ｋＶ／ ｃｍ，１．６ｋＶ／ｃｍ，１．５ｋＶ／ｃｍ）下分别对卵母 细胞通以一个直流脉冲和两个直流脉冲（２ 次激活间隔时间 ０．５ｓ）。评估不同的直流脉 冲对卵母细胞电融合率的影响。
参考文献 ［１］ 曾松亭．我国超级稻产业的科技发展与 展望．广东农业科学．２００６ 年第 ７ 期 ［２］ 李克勤．发展超级稻 提高水稻综合生 产能力 ［Ｊ］．中国稻米．２００５ 年 ０１ 期 ［３］ 陈友订．广东省超级稻育种研究进展与 展望 ［Ｊ］．广东农业科学．２００５ 年 ０１ 期 ［４］ 江奕君，林青山．华南双季超级稻育种 的实践与体会［Ｊ］．广东农业科学．２００５ 年 ０１ 期 ［５］ 林青山，江奕君．华南超级稻育种及示 范推广［Ｊ］．广东农业科学．２００５ 年 ０４期 ［６］ 谢华安．中国特别是福建的超级稻研究 进展 ［Ｊ］．中国稻米．２００４ 年 ０２ 期 ［７］ 雷秉乾．加强超级稻研究开发 促进水 稻生产再上台阶［Ｊ］．湖南农业．２００５ 年 ０６ 期 ［８］ 青先国，王学华．超级稻研究的背景与 进展［Ｊ］．农业现代化研究．２００１ 年 ０２期 ［９］ 林贤青．超级稻在不同水分管理条件下 的营养、生理和生态特性研究［Ｄ］．浙江大 学．２００５ 年 ［１０］ 程式华．粮食安全与超级稻育种．中国 稻米 ［１１］ 李克勤．发展超级稻提高水稻综合生 产能力．中国稻米 ［１２］ 徐庆国． 超级稻的研究现状与发展对 策探讨． 作物研究 ［１３］ 陈温福，徐正进，张龙步．水稻超高产育 种 －－ 从理论到实践．沈阳农业大学学报 Ｊ ［１４］ 陈友订．广东省超级稻育种研究进展 与展望．广东农业科学
摘 要 本文探讨了 Ｈ Ｙ Ａ （透明质酸酶）的浓度和作 用时间对牛体外成熟卵母细胞脱卵丘的影 响，不同强度电脉冲 ＋ 乙醇 ＋６－ＤＭＡＰ 对牛体 外成熟卵母细胞的孤雌激活作用以及和乙醇 ＋ ６ － Ｄ Ｍ Ａ Ｐ 激活的比较。对电融合脉冲强度， 脉冲次数进行了优化。结果表明：卵母细胞 成熟培养 ２２ｈ，用 ０．２０％ＨＹＡ 作用 １０ｍｉｎ 或 ０． ５０％ＨＹＡ 作用 ５ｍｉｎ 效果较好。在激活电压 １ ． ６ｋＶ／ｃｍ、２０ μ ｓ／ 次、间隔 １ｓ ，脉冲次数 为 １ 次的条件下的激活效果较好，在此条件 下与乙醇 ＋６－ＤＭＡＰ 激活相比较，孤雌激活胚 胎的囊胚率分别为 １９．６％ 和 ２６．９ ％，差异不 显著。 关键词 牛；卵母细胞；孤雌激活
１．２．４．２ 乙醇，６－ＤＭＡＰ 的激活和发育 培养
将电激活后的卵放入无水乙醇 ７ ％＋ ＩＶＣ 中静置激活 ７ｍｉｎ，再在含 ２ｍｍｏｌ／Ｌ ６－ Ｄ Ｍ Ａ Ｐ 的培养液中，于 ３ ８ ． ５ ℃、５ ％ Ｃ Ｏ ２ 和饱和湿度条件下活化 ４ｈ。待激活完毕，用 Ｉ Ｖ Ｃ 液洗涤 ３ 次，然后移入 Ｉ Ｖ Ｃ （Ｓ Ｏ Ｆ － ａａ＋３ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）培养，第 ２ 天起检查卵 裂率，培养 ７ｄ 后检查囊胚率。
农 业
中国科技信息 ２００８ 年第 ２０ 期 ＣＨＩＮＡ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ Ｏｃｔ．２００８
牛卵母细胞
孤雌激活研究
邓守龙 １．２ 王安江 ２ 曹文广 １ １．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 １００１９３ ２．新疆农业大学动物科学学院 ８３００５２
ＦＳＨ，２０ μ ｇ／ｍＬ ＬＨ，１ μ ｇ／ｍＬ １７－Ｅ ， ２
１００ＩＵ／ｍｌＰ／Ｓ 的 ＴＣＭ－ １９９）中洗涤。然后， 将 ＣＯＣｓ 移入成熟培养液中，在培养箱中成 熟培养 ２２ｈ。
１．２．３ 体外成熟卵的检查 观察第一极体排出情况：将充分扩展 的 ＣＯＣｓ 置于含 ０．２％ 或 ０．５％ 透明质酸酶的 Ｈ－Ｍ１９９ 中，培养箱中消化颗粒细胞 １０ｍｉｎ 或 ５ｍｉｎ 后，将带有少量致密卵丘的卵母细 胞移入新鲜的 Ｈ－Ｍ１９９ 中，用 １００ μ Ｌ 的移 液枪反复吹打去掉成熟卵母细胞表面的卵丘 细胞，使卵母细胞成为裸卵。在体视显微镜 下，选择排出第一极体进入 Ｍ Ⅱ期的卵母 细胞进行孤雌激活。 １．２．４ 牛卵母细胞的孤雌激活及发育培 养 １．２．４．１ 电激活 选择明显具有第一极体的成熟卵母细 胞，在激活液 ＦＭ（０．３ｍｏｌ／Ｌ 甘露醇、０． ５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｈｅｐｅｓ、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ 、０．
２
收集的 Ｃ Ｏ Ｃ ｓ 先用 Ｈ － Ｍ １ ９ ９（Ｔ Ｃ Ｍ １ ９ ９ ＋ １ ０ μ ｇ／ｍｌＨｅｐｅｓ ＋０．０５％ＦＢＳ＋１００ＩＵ／ｍｌＰ／Ｓ） 洗涤，再用成熟培养液（含 ２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，０． ５５ｍｇ／ｍｌ 丙酮酸钠，１０％ＦＣＳ，１０ μ ｇ／ｍＬ
表 １ 不同电场强度对牛体外成熟卵母细胞激活的影响
有必要对融合条件进行探索。孤雌激活是很 好的技术工具，本文研究了牛卵母细胞孤雌 激活方法的优化。
１ 材料与方法
１．１ 材料 本研究用于卵母细胞成熟、激活以及 孤雌胚发育的生化试剂：ＴＣＭ１９９（ＧＩＢＣＯ）、 胎牛血清 Ｆ Ｃ Ｓ （ Ｇ Ｉ Ｂ Ｃ Ｏ ） 、双抗（ Ｐ ／ Ｓ ， ＧＩＢＣＯ），其它均购自 Ｓｉｇｍａ 公司。电融合 仪（澳大利亚 ＣｒｙｏＬｏｇｉｃ，ＶＯＬ ＴＡＩＮＥＰ－１）。 配制各种液体所用的水均为ＭｉｌｌｉＱ过滤的超 纯水。 １． ２ 方法 １．２．１ 卵巢卵母细胞的采集 屠宰场采集牛卵巢，为本地黄牛和奶 牛卵巢。将采集的卵巢置于３８．５℃含青霉素 １００ＩＵ／ｍｌ，链霉素 １００ μ ｇ／ｍｌ 的灭菌生理 盐水的保温瓶中，２ｈ 内运回实验室。用预温 的生理盐水清洗卵巢。用带 １２＃ 针头的 １０ｍＬ 注射器吸取卵巢表面 ２ － ８ｍ ｍ 大小的卵泡， 卵泡液收集于 ６ｃｍ 灭菌培养皿中。然后在体 视显微镜下挑选含有完整卵丘细胞层且胞质 均匀的卵丘 － 卵母细胞复合体（ＣＯＣｓ），并 用 ＤＰＢＳ（１３６．８７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ＋２．６８ｍｍｏｌ／ Ｌ ＫＣｌ＋１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ ＰＯ ＋８．０９ ｍｍｏｌ／
为了克服胚胎体外激活、融合中存在 的缺陷，近年来人们对牛卵母细胞的激活体 系和方法进行了系统研究。牛卵母细胞的人 工激活方式很多，目前常用的激活方法是物 化联合激活法，电激活与乙醇、６ － Ｄ Ｍ Ａ Ｐ 联合使用可取得较佳的激活效果，但最佳的 激活方法目前还不一致。电激活可使一部分 重构胚发生碎片化和死亡，相当一部分重构 卵在电激活后死掉或者发生形态异常，所以
卵母细胞的充分激活是提高核移植效 率的关键因素之一，目前核移植效率很低。 早期胚胎的质量与体内胚胎相比仍有很大差 距，在早期胚胎体外培养时，如果胚胎所处 的条件不当，就会出现“发育阻断”现象，导 致这些发育异常的因素是克隆动物体内的某 些基因不正常表达和细胞核的甲基化异常造 成的。因此，重构胚的激活方法和激活是否 完全对克隆胚胎的发育有十分重要的影响。
３ 、提高超级稻生产机械化水平 水稻生产的全程机械化是提高我国稻 农收入的一个重要手段。经过近几年的发 展，我国水稻机械化水平在一定程度上得 到了较大的提高。过去，我国的水稻生产 机械主要用于北方稻区，且多为中大型机 械，这在广阔平整的北方稻田有一定的用武 之地。根据统计资料，北方稻区水稻播种面 积和产量虽只有全国的 １０％，但机插面积占 全国的 ９２％，其中东北占近 ８０％，机械直播 面积占全国的 ６５％，机械收获面积占全国的 ２５％。而在我国水稻主产区的南方地区，超 级稻生产的机械化程度较低，除了在水稻种 植的前期和水稻生长过程中的管理阶段初步 实行了机械化外，超级稻生产的两个重要阶 段——移栽和收获，机械化程度很低，特别 是移栽机械化目前仍处于攻坚阶段。移栽与 收获这两个阶段是我国水稻生产较为费工费 劳时期，人工费用的 ５０％ 以上集中在这两个 阶段，目前收割机械化水平有了较大提高， 而提高我国南方稻产区超级稻生产移栽机械 化将是我国水稻机械今后研究的重点和难 点。若要提高稻农的种稻收益，超级稻生产 的机械化是一项必备要件。根据研究和分析 的结果，实行机械化生产的稻产区，水稻产 后损失少，亩产量较高，与手工劳动和半机 械化生产相比，亩成本利润率高出 １０－１５ 个 百分点，每亩的纯收入高出５０．６－６０．３元，超 级稻由于其产量高，影响大，机械化生产尤 其是小型水稻生产机械显得尤为重要。
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作用 ５ｍｉｎ 两种方法都有较高的卵裂率，０． ２ ０ ％ Ｈ Ｙ Ａ 作用 ５ ｍ ｉ ｎ 或 ０ ． ５ ０ ％ Ｈ Ｙ Ａ 作用 １０ｍｉｎ 处理卵母细胞，其卵裂率仅为 ５０％ 和 ２１．４％，与前两者相比差异显著。
２．２ 不同电激活方法对牛卵母细胞激活 的影响
卵母细胞经脱卵丘后，各组的激活率， 卵裂率，囊胚率见表 １。１．６ｋＶ／ｃｍ，直流脉 冲重复次数为 １ 次的效果最好，但与 １．６ｋＶ／ ｃｍ，直流脉冲重复次数为 ２ 次的差异不显 著，说明在 １．６ｋＶ／ｃｍ 的直流电压下可以很 好的激活牛的卵母细胞。
２４
Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４＋０．３３ｍｍｏｌ／Ｌ 丙酮酸钠，用时加 入 １０％ 的 ＦＣＳ）清洗后备用。
１．２．２ ＣＯＣｓ 筛选与体外成熟培养 培养前，将洗卵液 Ｈ－Ｍ１９９ 和成熟培养 液分别置于 ３５ｍｍ 玻璃皿中和四孔板中加入 ５００ｕｌ 成熟液并覆盖３００ｕｌ的石蜡油，在３８． ５℃、５％ＣＯ 、饱和湿度下培养箱中平衡 ２ｈ。
核移植中卵母细胞激活方法的研究进展
核移植中卵母细胞激活方法的研究进展作者：王爱萍来源：《湖北畜牧兽医》2013年第04期摘要：核移植后的重构胚，只有卵母细胞质被激活后才能启动发育，低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。
对核移植中卵母细胞激活方法进行了综述。
对常用的几种激活方法及其激活原理进行了介绍。
关键词：核移植；卵母细胞；激活方法中图分类号：S813.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）04-0074-04核移植后的重构胚，只有卵母细胞质被激活后才能启动发育，低的核移植胚发育率可能与卵母细胞质未充分激活有关。
目前，用于卵母细胞激活的方法主要分为单一激活和联合激活。
常用的单一激活主要有电激活、钙离子载体A23187、离子霉素（Ionomycin）及乙醇等；联合激活主要是单纯的物理刺激或化学刺激以后再用蛋白质合成抑制剂或蛋白质磷酸化抑制剂或细胞松弛素B联合处理的一种激活方式。
现在越来越多的研究证明联合激活比单一的电激活或化学激活效果好，下面简要介绍几种常用的激活方法及其激活原理。
1 激活方法1.1 电激活电刺激是在核移植中常用的激活方法。
因该方法具有操作方便、激活率高和无化学毒副作用等特点而被广大研究者所青睐。
早在1989年，Onodera和Tsunoda的研究表明小鼠和兔卵母细胞在施以直流电脉冲后可发育到囊胚期。
在小鼠、兔、牛、猪的研究中都发现一次直流电脉冲只诱发一个钙离子瞬间波峰，而不是象受精一样引起的是钙离子波动。
尽管如此，一次或两次电脉冲就可以激活大部分卵母细胞。
电激活的原理是卵母细胞在短暂高压直流电脉冲的作用下，膜的磷酸二酯双分子结构的稳定性发生改变，细胞膜上形成很多可恢复的微小孔洞，使细胞外的Ca2+进入细胞，并使胞质内Ca2+浓度升高，细胞内Ca2+浓度的增加导致CSF活性消失，cyclinB被迅速降解，MPF活性消失，细胞被激活完成第二次减数分裂并进入下一细胞周期。
早期的研究表明核移植胚胎进行简单的电激活就如同卵母细胞孤雌激活一样，虽然可以得到进一步的发育，但激活效率较低而且电激活常常依赖于卵母细胞成熟时间[1]，卵龄越高CSF对Ca2+就越敏感，进而卵母细胞就越容易激活。
牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究
是 离子 霉 素 激 活 胚 胎 的 囊胚 发 育 率 显 著 高 于 电激 活 方 法 （ ． ７ ｖ ０ ４ ， ０ ０ ） 本 试 验 还 采 用 两种 方 法 来培 养 牛 ３ ６ ｓ ． Ｐ（ ． ５ 。 １ 化 学 激 活孤 雌 胚 。方 法一 是 把 化 学 激 活 牛 体 外成 熟 卵 母 细 胞 放 于 ｓ ａ Ｓ ｎｈ ｔ ｉｕ ｔ ｌｉ ａ ） 养 基 中连 续 培 养 ７ ＯＦ ａ（ ｙ ｔｅｉ Ｏｖ ｃ Ｆｕｄ ａ 培 ｃ ｄ ｄ ； 法二 是 把 化 学 激 活 牛 体 外成 熟 卵 母 细 胞 放 于 ｓ Ｆ ａ 养基 中 ４ｄ后 ， 转 移 进 入 含 有 ｌ Ｆ Ｓ Ｆ ｔｌ ｏ ｉｅ ｅｕ 方 ０ ａ培 再 Ｏ Ｂ （ ｅ ｖｎ ｒｍ） ａＢ Ｓ 的 Ｓ ａ 培 养基 中 继 续 培 养 ３ｄ。试 验 结 果 表 明 ： 法 一 中的 囊胚 发 育 率 显 著 高 于方 法 二 （ １６ ｖ ． ９ ， ０ ０ ） ＯＦ ａ 方 １． ４ ｓ ４ Ｐ（ ． １ 。 ３
ｖｓ７７ ， ．４ Ｐ＞ ０． ０５），ｂｕｔｔ ｌ ｓ ｏ ｙｓ ａ ｅ ｉ ｏｎ ｈｅ ｂ ａ ｔ ｃ ｔｒ ｔ ｎ ｉ ｏｍ ｙ ｉ ｃ ｉａ ｉｎ ｇｒ ｕｐ ｃｎ ａ ｔｖ ｔｏ ｏ ｖ ０． ， （ ０． ５） Ｔ ｗｏ ｍ ｅ ｈｏ ｒ ｅ ｏ ｏ— ｓ１ ４ Ｐ ０ ． ｔ ｄｓ ｗｅ ｅ ｕｓ ｄ ｆ ｒ ｂ
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第２ ８卷 第 牛 、 卵母 细 胞 孤雌 激 活 的 研 究 羊
彭礼 繁 ， 光 彬 罗
（ 阳农业 大 学动 物胚 胎 工程 实验 室 ， 宁 沈 辽 １０ ６ ） １ １ １
摘要 ： 主要比较了离子霉素、 电脉冲及培养基更换对牛羊体外成熟卵母细胞孤雌激活的影响。两种方法对牛胚胎的研究
水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较
可 以指导移人 的核发生 发育 程序 重编 。人工 激活方 式很 多 ， 除
传 统 的 电刺 激 （ ｏ ａ ｉ ｌ ｌ １ ９ ） 乙 醇 （ ｇｉ １８ ） Ａ ｙｇ Ｙ ｅａ ，９ ２ 和 Ｎａａ Ｔ，９ ７ 之 外 ， 子 霉 素 ＿ 、 离 子 载 体 Ａ ３ ８ 等 都 被 证 明 可 以 激 活 卵 离 】钙 ］ ２ １７ 母 细 胞 ，但 是 激 活 效 率 因激 活 方 法 以及 卵龄 ［’ 多种 因 素 影 响 。等
１ 材料 与方 法
１ １ 试 剂 及 培 养 液 的 配 制 本 试 验 研 究 主 要 试 剂 均 为 Ｓｇ ． ｉｍａ 产 品 ；Ｂ Ｆ Ｓ购 自杭 州 四季 清 生 物 制 品 厂 ； Ｓ Ｉ 购 自宁 波 激 Ｆ Ｈ、 Ｈ
素 制 品 厂 。 洗 卵 液 ： ＣＭ１９ ＋ ５ Ｂ Ｓ ＋ １ Ｔ ９ Ｆ Ａ ０ ０ｍＭ ｐ ｓ ５ Ｈｅ ｅ ＋
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中 国草食 动 物
２Ｏ Ｏ ６焦
水 牛 卵母 细胞 孤 雌 激 活及 孤 雌 胚 与体 外 受精 胚 发 育 比较
郭海 英 ， 高峰 ， 建 中 ， 业 刚 ， 季 武 唐 李跃 民 （ 南 大学重 庆 市牧草 与 草食 家畜 重点 实验 室 ， 西 重庆 北 碚 ４０ １ ） ０ ７６
关 键词 ： 水牛卵母细胞 ； 孤雌激活 ； 体外受精
孤 雌 激 活 是 指 通 过 不 同 方 法 刺 激 ＭＩ期 卵 母 细 胞 。 其 完 Ｉ 使
而有所差异 。
成第二 次减数分裂 ， 并抑制第二极体排 出。 从而产生染色体 为正
常二 倍 体 的胚 胎 。卵 母 细胞 的充 分 激 活 是 提 高 核 移 植 效 率 的 关 键 因素 之 一 。 有 在 去 核 卵 母 细 胞 充 分 激 活 的情 况 下 ， 核 卵 才 只 去
试论牛卵母细胞体外受精技术
试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。
体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。
针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。
1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。
该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。
1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。
在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。
1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。
将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。
1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。
奶牛卵母细胞体外受精和胚胎培养研究
ｔａ ｈ ｔｒ ａｅｏ ｔｅｏ ｃｔ ａｔｒｒｎｐ ｒｉ ７—４ ｈ ｔ ｅｍａｕｅｒｔ ｆｈ ｏｙｅ ｆ ａ ｓｏｔｎ３ ｔ ｅｔ ２℃ （ １３ ） ｓｏ ｖｏｓ ｗ ｒ ｈｎｔｏｅｉ ０—３ １ ． ％ ｗａ ｂ ｉｕｌ ｌ ｅ ａ ｓ ｙｏ ｔ ｈ ｎ２ ０℃ ａｄ３ ｎ ０—３ ７℃ （ ９ ３ ， ７ ．％
安徽农业科学 。 ｕｎｌ ｆＡ ｈ ｉ ｇｉ ｃ．０ ９，７ ８）３４ ３ ４ Ｊ ｒａ ｏ ｎｕ ．Ｓｉ２０ ３ （ ：５６— ５ ７ ｏ ｎ
责任编辑
李 占东
责任校对
昊晓燕
奶 牛 卵母细 胞体 外 受精 和胚 胎培 养 研 究
马 红 黑 江 农 科 院黑 江 尔 ５８ （龙 省 业 学 ，龙 哈 滨１０ ） ０６
（２４ ％ ，８ １％ ） ８Ｃｌｒｅ（５２ ％ ， ７２ ％ ） ｂａ ｏｙ ｔ ２ ．Ｏ ， ８８％ ）ｗ ｓ ｏ ｂｉ ｓ ｉｅ ｎｅ Ｃ ｎｌｓ ｎ ｅ ７ ．１ ６．８ ， ｅ ｔ ４ ．４ ４ ．２ ， ｌｔ ｔｒ ｅ（５６ ％ １．９ ｌａ ｓｃ ｅ ａ ａ ｎ ｖ ｕ ｔ ｒ ｃ．［ ｏｃ ｉ ］ｈ ｏ ｏ ｄｉ ｅ ｕｏ ｒ
成熟率（ １３ ） １． ％ 明显低 于 ２ ０—３ Ｏ℃ 、Ｏ７ ．％ ８ ． ％ ，０～ Ｏ℃ 、Ｏ～３ ３ ７℃组 间差异 不显著 ； 运送 时间 ６ ｈ后 的卵 母 细胞成 熟率 （３ ２ 明显低 于４ｈ内、 — 的成 熟率（ ５６ ， ． ％ ）４ｈ内、 ６ ５ ． ％） ４ ６ｈ ８．％ ７ ８ ， ７ ４～ ｈ差异不 显著 ； 雌激活和 体外受精胚胎 在相 同 孤 条件下的 卵裂率（２４ ％ ， ．８ ）８细胞率 （５２％ ，７２％ ）囊胚率 （ ．０ ， ．９ ） ７．１ ６ １％ 、 ８ ４． ４ ４．２ 、 ２ ６％ ｌ ８％ 差异均 不显著 。［ ５ ８ 结论 ］ 卵巢在 ３ ０℃ 左右 ４ｈ内运回 实验 室最适 宜 ， 而孤雌激 活和体外 受精胚 胎在相 同条件下发 育率差异 不显 著。 关键词 奶 牛 ； 卵母细胞 ； 熟率 ； 雌激 活； 外受精 成 孤 体 中图分类 号 ｓ２ ． ’ 文献标识 码 Ａ ８３９ ｌ 文章编号 ０ １ — ６ ｌ ２ ０ ）８ ０ ５６— ２ ５ ７ ６ ｌ（ ０９ ０ — ３４ ０
水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较
１ ． 体 外 成 熟 时 间 对 水 牛 卵 母 细 胞 孤 雌 激 活 与 胚 胎 发 育 ．１ ３ 的 影 响 将 体 外 成 熟 ２ ｈ ２ ｈ ２ｈ、０ １ 、４ 、７ ３ ｈ的 卵母 细 胞 置 于 含 Ｏ１ ．％透 明质 酸 酶 的 Ｐ Ｓ 无 ｃ Ｍ ） 中反 复 Ｂ （ ａ 、 液 吹 打 。去 除 卵 丘 细 胞 。在 含 ５ ｍ ｌ １ ｏ／ 子 霉 紊 ￣ Ｌ离 （ ｎ ｍ ｃｎ Ｉｎ ｉ ｏ ｙｉ 。 ）的 胚胎 培 养 液 中 处 理 ５ ｎ 用 ｏ ｏ ｍｉ。
水牛卵母细胞孤雌激活及孤雌胚与体外受精胚发育比较
郭 海 英 ， 高 峰 ， 建 中 。 业 剐 ， 跃 民 季 武 唐 李 （ 南 大 学 重 庆 市 牧 草 与 草 食 家 畜 重 点 实 验 室 ， 庆 北碚 西 重 ４０ １） ０ ７６
摘 要 ： Ｍ Ⅱ期 水牛 卵 母 细 胞 进 行 人 工 诱 导 激 活 可 以帮 助 人 们 间 接 判 断 体 外 成 熟 卵 母 细 胞 质 量 的优 劣 。 且 ， 对 并 卵 母 细胞 的充 分 激 活 也 是提 高核 移植 效 率 的 关键 因 素之 一 。 验 比较 了 水 牛 卵母 细 胞 体 外成 熟 时 间对 孤 雌 激 活胚 发 育 试
鲜的 Ｃ Ｍ液 中培养 。４ ｈ后 统计卵裂 率 。～ １ ８ ６ １ｄ 统 计囊胚 率 。
１ ． 几 种 不 同化 学 激 活 方 法 对水 牛 卵母 细 胞 ．２ ３
孤雌激 活效果 的比较
将体外成 熟 ２ ～ ８ ７ ２ ｈ的卵母细胞 随机
１ 试 荆及 培 养 液 的 配 制 ． １
的 囊胚 发 育 率 显 著 高 于 体 外 受精 胚 （ ３ ％ ｖ．２ ．％） １． Ｏ ｓ １ ７ 。 关键词 ： 水牛 卵母 细 胞 ； 雌 激 活 ： 外 受 精 孤 体 中 图 分 类 号 ：８ ３８３ Ｓ １． ￥ ２ ． ：８ ４８ ＋ 文 献标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ７ ２ ３ ２ ｏ ）３ ０ Ｏ 一 ３ １０ — ７ Ｘ（０ ６ Ｏ — ｏ ６ Ｏ
牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究
Ｐ ００ ） ｈｒ ａ ｏ ｓ ｎｆ ａ ｔｄｆｒｎｅ ｉ ｈ ｌ ｖｇ ａ ＜ ，１ ，Ｔ ｅｅ Ｗ ｎ ｉ ｉｃ ｉｅｅｃ ｔ ｃ ａａｅ ｒｔ ｓ ｇ ｉｎ ｎ ｅ ｅ ｅ
收稿 日期 ２ ０ － ９ ２ 作者简介 ：０ ７ ０ － ０
程研究。
： 礼 繁 。 ９ ２ ）男 ， 士 研 究 生 ， 事 动 物胚 胎 工程 研 究 。 彭 （ ８－， 硕 １ 从 通 讯 作 者 ： 光 彬 ，１ ５ － ， ， 授 ， 士 ． 事 动 物 配 子 与胚 胎 生 物 工 罗 （９ ９ ）男 教 博 从
Ｓｎｈ ｔ ｖ ｕ ｔ ｌｉ （ｏ３ｃｌ ｒ ｙｔｍ． ｈ ｒ ｗ ｓ ｏｓ ｎｆ ａｔ ｉｅｅｃ ｅｃ ａａｅｒｔ ９ ．１ Ｖ ４４ ％， ＞ ． ） ｅ ｅｎ ｙ ｔｅ ｃＯ ｉ ｃ Ｆｕｄ ｓ ￣ ｕ ｕｅｓｓ ｉ ｄ ｔ ｅ Ｔ ｅｅ ａ ｉ ｉｃｎ ｄｆｒｎ ｅｉ ｔ ｌ ｖｇ ｅ（０６ ％ Ｓ９ ．０ Ｐ ０ ５ ｂ ｔ ｅ ｎ ｇｉ ｎｈ ｅ ａ ０ ｗ
激 活牛体 外成 熟 卵母细 胞后 ， Ｓ Ｆ ａ体 系培 养 ， 液 与不 换液 对孤 雌激 活胚 胎 体 外发 育 的影 响 。结果 表 明 ： 第 用 Ｏａ 换 在
４天不换 液 的胚胎 卵裂 率和 囊胚 率极 显 著 高于换 液 的胚 胎 ｆ１ ４ １． ％对 ３４ ％。＜ ．１。 ６ ． ９ Ｐ ００ ） 关键词 ： ： ： 牛 羊 卵母 细胞 ； 孤雌 激 活
牛卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育的影响
繁 疆 生 理 ・ ｅ ｒｄ ｃｉｎａ ｄＰ ｙ ｉｌ ｙ Ｒ ｐｏ ｕｔ ｎ ｈｓｏｏ ｏ ｇ
２０ 年 第 ４ 卷 第 ７ ０８ ４ 期
牛 卵丘细 胞对 卵母 细胞体 外成熟 与孤雌发 育 的影 响
张 锐， 章孝 荣 ， 陶 勇 ， 张运 海 ， 美玲 章
对 机械裸 卵 和 Ｃ Ｃ 进行体 外成熟 和孤 雌激 活 ， Ｏｓ 经体 外 培养 而探 讨卵 丘 细胞存 在 和不 同形 态卵 丘细 胞对 卵母 细胞体外成 熟与孤雌发 育能力 的影 响 。
１ 材料 与方 法
胎 干细胞 等技 术 的研 究 和应用 都需要 大量 的成 熟 卵
母 细胞作 为试 验材料 ，因此 卵母 细胞 的质 量直 接影
层 （Ｓ ） ＣＯＧ 为 ｃ 组 ， 究 卵丘 细 胞 层 包 裹程 度 对 卵 母 细胞 的 体 外 核 成 熟 和 孤 雌 激 活 后 胚 胎 发 育 能 力 的 影 ＦＰ 的 ｓ 研
响 。结果表 明 ： 卵丘细胞 的存在 更有利 于卵母 细胞体 外成熟和孤 雌胚胎发 育 ； ＣＯＧ ｓ中卵丘 细胞 包裹层数 对 卵母
细胞体 外核 成熟率没有显 著影响 ， 包裹卵丘细胞层数 多且 附带 Ｆ Ｐ的卵母细胞 ， Ｐ Ｅ 的囊胚 率显著 高于包 但 Ｓ 其 Ａｓ
裹 卵丘 细 胞 少 的 卵母 细 胞 Ｐ Ｅ 。 Ａ ｓ
关键 词 ： 卵丘细胞 ； 卵丘 一卵母 细胞 复合体 ； 体外成 熟 ； 孤雌发 育 ； 牛 中图分 类号 ：Ｓ ２ ． ８３３ 文献 标识 码 ：Ａ 文章 编号 ： ２ ８ ７ ３ （ ０ ８）７ ０ １ — ４ ０ ５ — ０ ３ ２０ ０ — ０ ２ ０
２组 ， Ａ组 Ｃ Ｃ 经 机械 吹 打脱 除卵 丘 细胞 成为 机 械 Ｏｓ 裸 卵 （ Ｏ ） （ １Ａ） Ｂ组 为 包 裹 卵 丘 细胞 ５层 以 Ｄ ｓ组 图 ； 上 的且包 裹 紧密 的 Ｃ Ｃ 组 （ １ 。 Ｏｓ 图 Ｂ） 试验 ２ ，根据 包 裹 卵母 细胞 的卵 丘 细胞 层 数 和
体外培养时间和表皮生长因子对牦牛卵母细胞成熟及孤雌胚胎体外发育的影响
民 族 大 学 学报
自然
学版
Ｎ。 ２ ｏｌ ３
ｄ ｏ ｉ ： Ｉ Ｏ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ３ － ４ ２ ７ １ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ６ ． ０ ４
体 外培养 时 间和 表皮生长 因子对牦牛 卵母细 胞成熟
及孤雌胚胎 体外发 育 的影响
牦牛主要生活在青藏高原 ３ ０ ０ ０ ￣５ ０ ０ ０米海拔 的高寒地带， 是青藏高原及周边地区牧民的主要经济来源， 其 对低温、低氧、低压等的恶劣高原环境有较强的适应能力， 能充分利用其他家畜难以利用的高山草原¨ ． 此外， 牦牛是我国珍贵的畜种资源和宝贵的基 因库．因此， 利用现代 的胚胎工程和细胞生物学技术保护牦牛遗传资源、 提 高牦 牛 生产性 能 、 加速 牦牛 的 繁育 体系 、研 究 牦牛 生长 发育 及其 调 控模 式等 对充 分 发挥 牦牛 资源 特性 、促 进 牧 区发展 具 有 重要意 义 ． 卵母细胞的体外培养技术是开展牦牛胚胎工程工作 的主要屏障之一． 卵母细胞的体外成熟可以为体外生产 胚胎提供大量 的ＭⅡ期 卵母细胞． 如何优化牦牛卵母细胞 的的体外 成熟体系， 使得细胞核与细胞质 同步成熟， 以便获得较 强的发育能力，已成为当下急需解决的问题【 ｊ 珥 Ｊ ． 迄今为止， 牦牛的卵母细胞体外成熟培养 尚未建立 个比较完善 的体系．虽然其他 哺乳动物 的体外生产胚胎 已基本建立， 但不同物种之 间的卵母细胞培养体系存
ｐ ｇ ／ ｍ Ｌ Ｃ ａ Ｃ １ ２ ． ２ Ｈ ２ ０＋０ ． １ ｇ ｇ ／ ｍ Ｌ Ｍｇ Ｃ １ ２ ． ６ Ｈ ２ ０＋０ ． １ ５ ｇ ｇ ／ ｍ Ｌ谷氨酰胺 ＋２ ％ 必需氨基酸 ＋ｌ ％ 非必需氨基
在成都青 自江屠宰场， 牦牛被屠宰 后， 采集牦牛的卵巢， 立即放入含青霉素８ ０ ｍｇ ／ Ｌ 和链霉素 １ ０ ０ ｍ ｇ ｍ的
孤雌激活
5.卵母细胞的孤雌激活孤雌激活(parthenogenetic activation)是指处于第二次减数分裂中期的成熟卵母细胞不经过精子受精作用，而在某些理化因素的刺激下继续生长发育的过程，包括恢复并完成第二次减数分裂，发生卵裂形成早期胚胎。
由雌性配子经孤雌激活产生后代的生殖过程称为孤雌生殖形成的胚胎称为孤雌胚胎。
5.1.卵母细胞激活机制在受精时，一系列的细胞内Ca2+ 多次持续波动引起MPF的失活和卵母细胞的激活(Cuthbertson and Cobbold 1995; Collas et al. 1993; Swann and Ozil 1994)。
在小鼠(Miyazaki et al. 1986, 1993; Whitaker and Swann 1993; Kline 1994; Igarashi er al. 1997) 、仓鼠(Igusa and Miyazaki 1983; Miyazaki et al. 1986, 1991)和兔(Collas et al. 1995)上都证实了卵母细胞在受精时伴随有Ca2+的波动，说明Ca2+波动是启动卵母细胞周期和继续发育的前提。
卵母细胞激活是以Ca2＋为第二信使，成熟促进因子(MPF)、细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)、细胞静止因子(CSF)等细胞因子综合作用的结果。
进行孤雌激活的卵母细胞是处于MII期的卵母细胞，其含有高活性的CSF，能维持MPF处于高活性状态，使卵母细胞处于减数分裂的中期(Rall J M 1992)。
孤雌激活是通过各种物理、化学方法刺激MII期卵母细胞完成第二次减数分裂，阻止第二极体排出，形成常染色体二倍体胚胎(李裕强2001)。
卵母细胞内Ca2+节律性脉冲的升高是卵母细胞完成孤雌发育不可缺少的过程(Hochi S 2000)。
MII期的卵母细胞受精或人工激活后卵母细胞胞质Ca2+升高可使MPF和CSF失活或消失，从而启动成熟分裂器，促使M期卵母细胞继续第二次成熟分裂(Kline D 1988)，并形成孤雌胚胎(Swann M 1999)。