人工辅助激活卵母细胞同周期对照研究要点
组２ＰＮ受精率７９．５９％（３９／４９）明显高于对照组５７．１４％（２８／４９），差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；符
合纳入标准３（圆头精子症）患者ＡＯＡ组２ＰＮ受精率７５％（６／８）明显高于对照组０（０／５），差异有统 计学意义（Ｐ＜０．０５）。结论使用钙离子载体Ａ２３１８７对卵母细胞进行人工辅助激活有助于提高 ＩＣＳＩ后正常受精率，但对于早期胚胎发育影响及子代安全性还有待于进一步研究。
ｐｅｒｉｏｄ ｉｎｔｏ
ｏｆ
ｔｗｏ
ｔｈｉｒｄ
ｄａｙｓ
ｉｎ
ＩＣＳＩ；（３）ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ
ｗｉｔｈ
ｏｏｅｙｔｅ
ｇｌｏｂｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ．Ｔｈｅ
ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ
ｇｒｏｕｐｓ，ｃｏｎｔｒｏｌ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ＡＯＡ）ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ
ｏｕｔｃｏｍｅ
胞完全按照常规ＩＣＳＩ操作进行处理，ＡＯＡ组卵母细胞在进行ＩＣＳＩ后使用钙离子载体Ａ２３ １８７进行激
活。对比两组正常受精率、卵裂率、妊娠及出生结局。结果ＡＯＡ组２ＰＮ受精率６５．９３％（６０／９１）明 显高于对照组４６．６７％（４１／８９），差异有统计学意义，Ｐ＜０．０５；符合纳入标准１（２ＰＮ≤３０％）患者ＡＯＡ
ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｅｇｇｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｏｕｔｉｎｅ ＩＣＳＩ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｔｈｅ
ＡＯＡ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ Ａ２３ １ ８７ ａｆｔｅｒ ＩＣＳＩ．Ｎｏｒｍａｌ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ，ｃｌｅａｖａｇｅ ｒａｔｅ，ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ａｎｄ ｂｉｒｔｈ ｏｆ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ２ＰＮ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｉｎ ｔｈｅ ＡＯＡ ｇｒｏｕｐ ６５．９３％（６０／
ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ １ ｂｅ ｈｅｌｐｆｕｌ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＩＣＳＩ．Ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｎｅｅｄ ｔｏ ｂｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｉｅｄ．
ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ；
Ａｓｓｉｓｔｅｄ ｏｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ；
ＩＣＳＩ；
Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｆａｉｌｕｒｅ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０３７６－２４９１．２０１６．４３．０１０
作者单位：４５００５２郑州大学第三附属医院生殖医学中心（郝大勇、张晓、申春燕、杨悦、武文斌、刘艳丽、刘景、张 建瑞、王兴玲）；郑州大学第五附属医院微生物室（张锐） 通信作者：王兴玲，Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｌ２０８＠１２６．ｃｏｍ
万方数据
在较早期的研究中发现，卵胞质内单精子显微 注射（ＩＣＳＩ）受精失败与精子缺陷导致卵母细胞激活 失败有关，这些精子大多数被确诊为圆头精子¨引， 使用钙离子载体人工激活卵母细胞治疗人圆头精子 症获得成功口圳。即使注射正常形态的精子，ＩＣＳＩ 也不能保证成功受精，有研究表明钙离子载体的治 疗同样可以改善受精率∞引。一些前瞻性研究＂１表 明，ＩＣＳＩ受精率＜５０％，使用钙离子载体人工激活卵 母细胞可能会改善预后。Ｏｚｉｌ等哺圳发现并推测，一 些不育患者表现出胚胎发育停滞，胚胎质量低下，甚 至复发性着床失败也可能从某种形式的人工卵母细 胞激活中获益。一项最新关于对钙离子载体是否可
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｕｓｅ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ａｎｄ ｔｈｅ
ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓｉｓｔｅｄ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｆｒｏｍ
Ｊａｎｕａｒｙ ２０１５
ｔｏ
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ
ｉｎ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ
ｃｅｎｔｅｒ
ｏｆ ｔｈｅ
Ｔｈｉｒｄ
Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗｅｒｅ
ｅｎｒｏｌｌｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｅｔｈｉｃｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｔｈｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｓｕｂｊｅｃｔｓ
标准操作流程（ＳＯＰ）处理。ＡＯＡ组ＩＣＳＩ后卵母细
胞放置在含有１０ Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ的Ａ２３１８７（ＳＩＧＭＡ）的Ｇ－１
ｐｌｕｓ（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ）微滴中（３０¨１）１５ ｍｉｎ，然后转移至
３７
ｏＣ，６％ＣＯ：培养箱培养之前，至少要在Ｇ．１
ｐｌｕｓ
中洗涤３次。７ Ｊ。Ａ２３１８７使用液是用ＤＭＳＯ （ＳＩＧＭＡ）和Ａ２３１８７（Ｃ９２７５，ＳＩＧＭＡ）预先配比好 的。ＩＣＳＩ后胚胎培养按照中心的ＳＯＰ进行，根据每 例患者的情况及需求不同进行Ｄ３移植、冷冻或囊 胚期序贯培养。观察ＩＣＳＩ后正常受精、卵裂情况， 随访妊娠结局及出生结局。 ＭⅡ期为处在减数分裂Ⅱ期的卵母细胞。正常 受精率（２ＰＮ％）为正常受精卵数／ＩＣＳＩ卵数；Ｄ２ ４细胞卵裂率为第２天４细胞卵裂数／所有正常受 精卵数；Ｄ３ ８细胞卵裂率为第３天８细胞卵裂数／ 所有正常受精卵数；优质胚胎率为第３天优质胚胎 数／所有正常受精卵数。囊胚是２ＰＮ来源胚胎继续 发育至第５、６天，且具有囊胚腔，可利用囊胚标准参 考¨３｜。移植后６周Ｂ超下见孕囊为临床妊娠，移植 后８周Ｂ超下检查胎心搏动。 ３．统计学方法：采用ＳＰＳＳ １７．０软件处理数据。 正常受精率、卵裂率（Ｄ２ ４细胞和Ｄ３ ８细胞）和优 质胚胎率差异统计学意义采用ｘ２检验，检验水准
ｉｎ
９１）ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ
ｗｈｏ ｍｅｔ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
４６．６７％（４１／８９）（Ｐ＜０．０５）．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｉｎ ２ＰＮ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ（２ＰＮ≤３０％），ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｈｅ ＡＯＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｈｉｇｈｅｒ（Ｐ＜０．０５）ｉｎ ｇｒｏｕｐ［７９．５９％（３９／４９）］ｃｏｍｐａｒｅｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ［５７．１４％（２８／４９）］．Ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｍｅｔ ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ ３ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ（ｇｌｏｂｏｚｏｏｓｐｅｒｍｉａ），ｔｈｅ ２ＰＮ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ（Ｐ＜０．０５）ｉｎ ｔｈｅ ＡＯＡ ｇｒｏｕｐ［７５％（６／８）］ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ Ａ２３ １ ８７ ａｓｓｉｓｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ［０％（０／５）］．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
２ＰＮ≤３０％
ＡＯＡ组与对照组ＩＣＳＩ后受精、胚胎形态学评分 及妊娠情况对比见表２。８例患者进行了Ｄ３新鲜 胚胎移植，临床妊娠比例为４／８，其中全部移植ＡＯＡ 组胚胎３例，１例为每组各移植一枚胚胎。４例患者 已经成功分娩７名健康子代，子代出生情况见表３。
Ｃｈｕｎｙａｎ，ｙ０昭Ｙｕｅ，Ｗｕ Ｗｅｎｂｉｎ，Ｌｉｕ Ｙａｎｌｉ，Ｌｉｕ五昭，Ｚｈａｎｇ Ｊｉａｎｒｕｉ，Ｗａｎｇ Ｘｉｎｇｌｉｎｇ．‘Ｃｅｎｔｅｒ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ，Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｙ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａｕｔｈｏｒ：Ｗａｎｇ
生堡医堂苤查！Ｑ！！生！！旦丝旦箜堑鲞筮塑塑盟！！！丛型』ｇ！ｉ塑：堕！！！坐！！！丝：垫！！：ｙ！！：堑：盟！：箜
・３４８９・
．临床研究
人工辅助激活卵母细胞同周期对照研究
郝大勇 张锐张晓
申春燕杨悦武文斌刘艳丽
刘景
张建瑞
王兴玲
【摘要】
目的观察使用钙离子载体Ａ２３１８７对同周期同胞卵子进行人工辅助激活，对比正常
Ｏｔ＝０．０５。
以改善胚胎发育的前瞻陛研究中显示一Ｊ，使用钙离
子载体激活的胚胎种植率明显高于对照组。既往所 有的研究中对照组并不是基于同周期卵母细胞，这 也恰恰给了我们一个启示，进行同周期卵母细胞对 照研究，观察钙离子载体辅助激活的效果。同周期 优势在于可以避免由于个体差异及不同周期女性内 分泌等因素对受精及胚胎结局的影响。
对象与方法
１．对象：２０１５年１至１２月在郑州大学第三附 属医院生殖医学中心行ＩＣＳＩ助孕周期，经过郑州大 学第三医院伦理委员会批准纳入研究的病例标准如 下：距离前次ＩＣＳＩ周期间隔时间不超过１年，且本 周期获得成熟卵数≥８枚，并符合以下至少１项标 准：前次ＩＣＳＩ周期正常受精率≤３０％；前次ＩＣＳＩ周 期第３天无优质胚胎；诊断为圆头精子症患者。被 纳入的病例要求患者知情，并完全同意。以上纳入 研究标准参考：严重男性因素（圆头精子症）患者和 ＩＣＳＩ正常受精率＜３０％，都是常规使用钙离子载体 的指征Ｍ，１０１；在ＩＣＳＩ周期中使用人工卵母细胞激活 对前次周期受精率０或１％一２９％患者可能在治疗 周期中产生有利的影响Ｍ１；前一周期没有可利用胚 胎移植或Ｄ５囊胚出现率低（≤１５％）＂Ｊ，但是必须 要考虑到中国患者的需求，所以多数还是以Ｄ３胚 胎为主要时间节点，优质胚胎定义为：８—１０细胞， 均一度一致，并且碎片不超过２０％；在既往的研究 中显示，钙离子载体已经成功地应用在圆头精子症 病例［３圳，或者是一些其他类型的严重精子畸形
ｍｕｓｔ ｍｅｔ ａｔ
ｌｅａｓｔ
ｏｎｅ
ｃｒｉｔｅｒｉａ：（１）ｔｈｅ
卵母细胞激活
卵母细胞激活
征月良
【期刊名称】《生命的化学》
【年(卷),期】2008(28)4
【摘要】卵母细胞可被精子、化学物质和电脉冲等激活,激活后,胞质内发生Ca2+振荡、皮质颗粒释放、pH值增长以及成熟促进因子和有丝分裂原活化蛋白激酶失活等一系列重要事件。
卵母细胞激活是人工构建孤雌胚胎和克隆胚胎的必需步骤。
【总页数】3页(P220-222)
【关键词】卵母细胞激活;孤雌胚胎;克隆胚胎
【作者】征月良
【作者单位】临沂师范学院生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q954.43
【相关文献】
1.不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究 [J], 王鸽;张君涛;张胜军;魏莉莉;曹书郡;徐秋勤;柳文龙;刘童;张志平
2.用乙醇激活与电激活研究猪卵母细胞孤雌激活 [J], 肖红卫;郑新民;刘西梅;乔宪凤;李莉;张立苹;华文君;毕延震;华再东
3.Sr2+辅助卵母细胞激活技术改善卵母细胞胞质内单精子注射受精失败患者的妊娠结局 [J], 钱云;陈娟;聂晓伟;谈勇;美马博史
4.兔卵母细胞胞质内单精子注射后二次辅助激活对兔卵母细胞发育能力的影响 [J],
王晶;丛林;章志国;曹云霞;魏兆莲;周平;赵济华;贺小进
5.钙离子载体A23187联合嘌呤霉素激活行卵母细胞质内单精子注射后未受精卵母细胞的研究 [J], 鹿群;陈子江;高选;马水英;李梅;胡京美;李媛
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【荷斯坦◆技术】张廷青：应用牛活体采卵技术需要注意哪些细节？（1）
【荷斯坦◆技术】张廷青：应用牛活体采卵技术需要注意哪些细节？（1）牛活体采卵技术属第三代牛辅助繁殖技术（Assisted Reproductive Technologies）流程重要组成环节之一，本文及后续文章就相关细节简洁介绍国外同道的点滴经验体会。
一、牛辅助繁殖技术取得哪些进展？顾名思义，牛辅助繁殖技术系指人为干预牛自然生殖过程，从而达到提高牛群繁殖效率和加速遗传育种进展的目的。
自1938年将人工授精这项辅助繁殖技术首次引入奶牛/肉牛生产体系以来，短短83年期间牛辅助繁殖技术取得了令人难以置信、翻天覆地般的创新进展！目前，国际动物繁殖学界一般将牛辅助繁殖技术进展划分为如下四代：1.第一代牛辅助繁殖技术包括哪些？“人工授精、精液冷冻、性控冻精和发情调控”均属第一代牛辅助繁殖技术；这些实用先进技术在我国养牛界获得广泛认可和普遍应用，并产生巨大经济效益。
2.第二代牛辅助繁殖技术是什么？“超数排卵人工授精（使用常规冻精或性控冻精）冲胚回收”所获胚胎技术流程属第二代牛辅助繁殖技术，俗称传统胚胎移植技术或体内胚胎移植技术；这项实用先进技术在我国虽经逾40年引进、消化、吸收、应用和推广，政府也曾投入大量研发资金支持，但除少数种公牛站外，始终没有形成规模可观生产力，在全球处于落后状态。
3.第三代牛辅助繁殖技术是什么？“活体采集卵母细胞体外培养成熟体外受精（使用常规冻精或性控冻精）发育生长为囊胚或扩张囊胚”所获胚胎技术流程属第三代牛辅助繁殖技术，也称体外胚胎移植技术；这项实用先进技术我国才刚刚起步引进、消化和吸收，并期望五年内能形成规模可观生产力。
我们目前对第三代牛辅助繁殖技术的理解、掌握、应用和推广，远远落后于全球其它国家和地区、甚至还不如非洲某些国家。
4.第四代牛辅助繁殖技术是什么？牛克隆胚胎移植属第四代牛辅助繁殖技术，仅在少数发达国家尝试商业化生产；短期内尚无可能大规模应用推广。
二、什么是牛活体采卵技术？1988年西方奶牛临床兽医首先开发出了可反复应用且损伤程度较轻的供体母牛活体卵子（卵母细胞）采集术，英文名称：Ovum Pick-Up，简称OPU（中文俗称牛活体采卵技术），从而有力推动了牛体外受精胚胎（In Vitro Fertilization; IVF）广泛商业化运作。
关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述
关于猪卵母细胞孤雌激活技术概述摘要：孤雌激活随着近年来体细胞克隆技术的兴起而成为了又一研究热点，而猪由于其生理结构与人的相似性，所以其卵母细胞的孤雌激活更具有特别的研究价值，文章就孤雌激活的概念、机理、方法、影响因素等方面全面论述了猪卵母细胞孤雌激活的研究概况。
关键词：猪；卵母细胞；孤雌激活孤雌生殖(parthenogenesis)作为一种生殖方式在无脊椎动物和低等脊椎动物中较为常见，在鱼类、两栖类、爬行类和鸟类等脊椎动物中也存在孤雌生殖的现象，但哺乳动物在自然状态下则未见有孤雌生殖现象。
孤雌生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，通过人工模拟自然条件下卵母细胞的自然激活机理(卵母细胞的自发激活和精子穿入引起卵母细的激活)创造更多更好的激活方法，从而进一步提高卵母细胞的孤雌激活率，一直是孤雌生殖研究的重点内容，具有重要的研究价值。
一方面可把卵子活化的各个过程(如皮质反应、减数分裂的恢复和发育到第l次卵裂过程)分开来研究，对于阐明哺乳动物卵激活过程的信号偶联过程、细胞周期阻滞的恢复、受精机制和发育机理具有重要意义。
另一方面，卵母细胞激活是细胞核移植和胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)的关键环节，卵母细胞的激活率的高低直接关系到ICSl技术的效率，目前，卵母细胞激活率很低是核移植和胞质内单精子注射成功率低的重要原因之一。
同时，由于猪的生理结构与人的诸多相似，被医学界认为是人类器官移植的最佳提供者，且猪的数量充足，妊娠周期短，产仔多，容易饲养，取材容易，充分满足临床需要，未来在生物医学方面有潜在的重要应用前景，这使猪的孤雌激活技术成为近年来的研究热点，这对于畜牧业和生物医学具有重大理论和实践意义。
1. 卵母细胞孤雌激活的概念孤雌生殖是指无雄性配子的任何作用，由雌性配子产生个体的繁殖[1]。
孤雌生殖的关键是提高卵母细胞的激活率，而卵子在自然条件下的激活是由精子穿入刺激引起的，即由于精子的进入启动M Ⅱ期卵母细胞继续发育，这一过程称为卵母细胞的激活。
辅助生殖技术的研究进展
辅助生殖技术的研究进展第一篇：辅助生殖技术的研究进展辅助生殖技术的研究进展摘要：辅助生殖技术(assisted reproductive technologies，ART)是为生殖功能障碍的夫妇提供的各种非自然辅助他们生殖的技术。
试管婴儿就是使用该技术的体外受精———胚胎移植方法生育的婴儿。
本文就对目前常用的辅助生殖技术人工授精、体外受精与胚胎移植(IVF．ET)、卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）、植入前遗传学诊断(PGD)、赠卵IVF-ET和精子的保存等方法的发展来综述辅助生殖技术的研究进展。
据世界卫生组织（WHO）评估，每7对夫妇中约有1对夫妇存在生殖障碍。
我国近期调查，国内不孕症者占已婚夫妇人数的10%，比1984年调查的4.8%增加一倍多，发病率呈上升趋势。
我国更受传宗接代观念影响，多数家庭盼子心切，使不育夫妇承受着极大的心理压力，甚至引发离异、婚外恋之类家庭乃至社会的问题。
ART的直接效应是使不育夫妇实现妊娠生子的愿望，由不育引发的相关问题自然会随之得到解决。
临床统计，不育患者中约20%的夫妇，不借助ART就根本无法生儿育女。
生殖的中心环节是受精，因此受精方法的研究和进步是辅助生殖技术发展的一条主线。
人工授精是用非性交方法，将精子置入女性生殖道内，使精子和卵子在体内结合、受精、妊娠的方法。
人工授精具有悠久的历史，是最早应用的助孕技术。
公元二世纪Talmud已提出人工授精的可能性，1761年，Spallanzi成功地为母马人工授精，1790年．John Hunter为严重尿道下裂患者的妻子行配偶间人工授精(artificial inseminati on withhusband’s sperm，AIH)获得成功，1844年William Pancoast首次施行非配偶间人工授精(arti．ficial insemination bv donor，AID)获得成功，1954．年Bunge首次成功地用冷冻精子作AID获得成功，1986年Forrler报告腹腔人工授精(direct in．traperitoneal insemination，DIPI)获得成功。
辅助生殖技术研讨
辅助生殖技术研讨E2.2. 阻碍男性不育的因素在这部分我们要紧讨论阻碍男性不育的要紧因素。
.(i) 合格精子的几个参数：有专门多参数能够估测男性不育的可能性。
精子的数目，精子的运动能力, 精子的形状和精子的可受精性。
精子的数目是比较容易得到的, 因此常被用来估量精子的育性。
精子的形状学特点是估量育性的最正确指标之一；然而，使用光学显微镜对精子内部的研究是十分有限的。
造成男性不育的要紧缘故是男性精液中精子的数目太少。
假如每毫升精液中精子的数目少于2000万个或者有正常运动能力的精子少于总数的50%都将导致男性不育。
问题2：你明白在你所居住的都市里建有冷冻精子库吗？(ii) 人工受精：假如精子的数目太少，就能够先将一部分收集起来并进行冷冻处理，当收集到足够数量的精液时就能够在妇女排卵时将它置入阴道或直截了当置入子宫中。
在进行人工受精时，凡是精液来自夫君的，称之为同源人工受精。
这适用于夫君性生活不能射精和精子状况不良症，以及妻子输卵管专门或子宫位置专门等。
过去常被用于在夫妻双方长期分开的情形下使妇女怀孕〔比如，夫君在监狱中长期服刑〕。
凡是精液来自供体〔或第三者〕的，称之为异源人工受精。
异源人工受精适用于夫君无生殖能力〔无精子、精子死灭症〕、有严峻的遗传病，以及因血型不合而显现的适应性流产或不育症。
在国际上对捐精人是有所限定的，他们必须健康、没有伴性遗传病同时精子有较高的育性。
90%以上同意受精手术的人都期望捐献精子的人在种族、眼睛颜色、容貌和身高方面和自己相象。
甚至有的人还考虑捐精人的学历、爱好、智商以及宗教背景。
目前还没有证据说明人工受精所生的子女的死亡率和专门化率比自然生育的后代要高，因此这种方式被男性不育的家庭广泛同意。
问题3：你认为对使用人工受精的人是否有所限制？都有哪些限制？(iii) 单精子卵胞浆内显微注射(ICSI)这项技术是治疗男性不孕的重大突破。
ICSI技术是选择单个精子将其直截了当注入卵母细胞内，使其受精。
实验八、卵母细胞的体外培养
实验八、卵母细胞的体外培养一、实验目的了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。
二、实验材料1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。
2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。
三、实验内容（一）卵母细胞的获得从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。
真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。
手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。
应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。
将母兔背朝下方固定于兔手术台上。
在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。
然后盖上创巾并固定。
用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。
打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。
与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。
仔细观察卵巢的变化。
记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。
先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。
从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。
人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。
卵母细胞受精过程卵母细胞(oocyte)：在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。
分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。
（二）卵母细胞的体外培养1、培养液的准备用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M199。
细胞周期同步化
人工选择同步化
有丝分裂选择法：对数期的单层培养细胞——细胞分裂活 跃，处于分裂期的细胞变圆，贴壁生长——振荡使细胞脱 落，悬浮到培养液中——收集培养液，离心——获得分裂 期细胞，从新培养，获得不同时相的细胞
优点是细胞未经过任何药物处理，能真实反映细胞周期状况， 细胞同步化效率高。缺点是分离的细胞数量少。
密度梯度离心法：根据不同时期的细胞在体积和重
01
量上存在差别进行分离。得到处于不同时期的细胞。 优点是方法简单省时，效率高，成本低。缺点是对
02
大多数种类的细胞并不适用。
药物诱导
DNA合成阻断法——G1/S-TdR双阻断法：1、将过量的TdR加入 细胞培养液，所有S期的细胞立刻被抑制，其他细胞运行到G1/S 交界处被抑制。2、将TdR洗脱，解除抑制，被抑制的细胞沿细胞 周期运行。3、在解除抑制的细胞到达G1期终点前，第二次加入 TdR并继续培养，所有的细胞被抑制在G1/S交界处。4、将TdR洗 脱，加入新鲜培养液培养一定时间，可获得S期和G2不同时间点 的同步化细胞。
D N
章 A
抑 制 剂
节 ：
T dห้องสมุดไป่ตู้
一 R
和 羟 基 脲
优点是同 步化效率 高，几乎 适合所有 的体外培 养的细胞 体系。缺 点是诱导 过程可造 成细胞非 均衡生长。
在实际工作中，常常几种方法并用，以获得数 量多、同步效率高的细胞。
分裂中期阻断法：通过抑制微管聚合来抑制细 胞分裂器的形成，将细胞阻断在细胞分裂中期。 优点是操作简便，效率高。缺点是这些药物的 毒性相对较大，若处理时间过长，所得到的细 胞常常不能恢复正常细胞周期运转。
扩展-细胞周期的测定及其同步化
扩展：细胞周期的测定及其同步化一、细胞周期同步化：在同种细胞组成的一个细胞群体中，不同的细胞可能处于细胞周期的不同时相，人们可以通过人工选择或药物诱导来使整个细胞群体处于细胞周期的同一时相。
DNA合成阻断法：选用DNA合成抑制剂可逆地抑制S期细胞DNA合成，而不影响其他时期的细胞周期运转，最终可将细胞群体阻断在G1/S期交界处。
TdR双阻断法：第一次阻断时间应大于G2+M+G1期时间的总和，释放时间大于S期时间，而小于G2+M+G1期时间，这样才能使所有位于G1/S期的细胞通过S期，而又不使沿周期前进最快的细胞进入下一个S期。
例题：（2017年·全国卷Ⅲ）利用一定方法使细胞群体处于细胞周期的同一阶段，称为细胞周期同步化。
以下是能够实现动物细胞周期同步化的三种方法。
回答下列问题：（1）DNA合成阻断法：在细胞处于对数生长期的培养液中添加适量的DNA合成可逆抑制剂，处于________期的细胞不受影响而继续细胞周期的运转，最终细胞会停滞在细胞周期的________期，以达到细胞周期同步化的目的。
（2）秋水仙素阻断法：在细胞处于对数生长期的培养液中添加适量的秋水仙素，秋水仙素能够抑制____________，使细胞周期被阻断，即可实现细胞周期同步化。
经秋水仙素处理的细胞________（填“会”或“不会”）被阻断在间期。
（3）血清饥饿法：培养液中缺少血清可以使细胞周期停滞在间期，以实现细胞周期同步化。
分裂间期的特点是____________________________________________（答出1点即可）。
1.（2016年·全国卷Ⅱ）某种物质可插入DNA分子两条链的碱基对之间，使DNA双链不能解开。
若在细胞正常生长的培养液中加入适量的该物质，下列相关叙述，错误的是（）A．随后细胞中的DNA复制发生障碍B．随后细胞中的RNA转录发生障碍C．该物质可将细胞周期阻断在分裂中期D．可推测该物质对癌细胞的增殖有抑制作用2.（2018年4月·浙江卷）下表所示为实验测得离体培养的胡萝卜根尖细胞的细胞周期各阶段时间。
牛卵母细胞孤雌激活研究
收集的 Ｃ Ｏ Ｃ ｓ 先用 Ｈ － Ｍ １ ９ ９（Ｔ Ｃ Ｍ １ ９ ９ ＋ １ ０ μ ｇ／ｍｌＨｅｐｅｓ ＋０．０５％ＦＢＳ＋１００ＩＵ／ｍｌＰ／Ｓ） 洗涤，再用成熟培养液（含 ２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，０． ５５ｍｇ／ｍｌ 丙酮酸钠，１０％ＦＣＳ，１０ μ ｇ／ｍＬ
表 １ 不同电场强度对牛体外成熟卵母细胞激活的影响
农 业
中国科技信息 ２００８ 年第 ２０ 期 ＣＨＩＮＡ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ Ｏｃｔ．２００８
牛卵母细胞
孤雌激活研究
邓守龙 １．２ 王安江 ２ 曹文广 １ １．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 １００１９３ ２．新疆农业大学动物科学学院 ８３００５２
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作用 ５ｍｉｎ 两种方法都有较高的卵裂率，０． ２ ０ ％ Ｈ Ｙ Ａ 作用 ５ ｍ ｉ ｎ 或 ０ ． ５ ０ ％ Ｈ Ｙ Ａ 作用 １０ｍｉｎ 处理卵母细胞，其卵裂率仅为 ５０％ 和 ２１．４％，与前两者相比差异显著。
２．２ 不同电激活方法对牛卵母细胞激活 的影响
卵母细胞经脱卵丘后，各组的激活率， 卵裂率，囊胚率见表 １。１．６ｋＶ／ｃｍ，直流脉 冲重复次数为 １ 次的效果最好，但与 １．６ｋＶ／ ｃｍ，直流脉冲重复次数为 ２ 次的差异不显 著，说明在 １．６ｋＶ／ｃｍ 的直流电压下可以很 好的激活牛的卵母细胞。
卵母细胞的充分激活是提高核移植效 率的关键因素之一，目前核移植效率很低。 早期胚胎的质量与体内胚胎相比仍有很大差 距，在早期胚胎体外培养时，如果胚胎所处 的条件不当，就会出现“发育阻断”现象，导 致这些发育异常的因素是克隆动物体内的某 些基因不正常表达和细胞核的甲基化异常造 成的。因此，重构胚的激活方法和激活是否 完全对克隆胚胎的发育有十分重要的影响。
核移植中卵母细胞激活方法
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1986年
科学家成功实现人类胚胎干细胞的核移植，为治疗遗传性疾病和组织损伤提供了新的途径。
2002年
Hale Waihona Puke 动物克隆通过核移植技术，可以复制出与供体基因完全相同的动物个体，用于科学研究、濒危物种保护和动物模型建立等。
转基因动物
利用核移植技术将外源基因导入动物细胞，培育出转基因动物，用于药物筛选、疾病模型建立和生物反应器等方面。
核移植中卵母细胞激活方法
汇报人：
2024-01-07
核移植技术概述卵母细胞获取与准备卵母细胞的激活方法激活效果评估与优化核移植中卵母细胞激活的伦理与法规问题
目录
核移植技术概述
01
科学家首次提出核移植概念，通过将细胞核植入去核的卵母细胞中，成功获得克隆羊。
1952年
第一只克隆羊多莉诞生，标志着核移植技术进入实用阶段。