Western blot protocol
Western Blotting Protocol-中山大学(参考)
Western Bloting (张雪雁)操作步骤：1.做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。
待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。
2.蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加β—巯基乙醇，然后以PCR仪95℃变性10分钟。
3.上样、电泳：1）上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。
以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。
2）将SDS—PAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。
1х电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。
3）先以少量加有溴酚蓝1х上样缓冲液标记各泳道。
4）变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1х上样缓冲液补齐至50ul。
蛋白Marker也补齐至50ul。
5）以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。
上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。
剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。
6）加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。
一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清楚。
溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。
4.电转：1）准备PVDF膜及滤纸。
PVDF大小8.2х5～5.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。
2）将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡1～3分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。
3）小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。
在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。
电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。
4）接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。
Western Blot Protocol
Western Blot Protocol1.SDS-PAGE试剂的配制1)40%丙烯酰胺溶液(Acrylamide)2)10%过硫酸铵溶液(APS)3)TEMED4)分离胶缓冲液4X Buffer (pH 8.8)5)浓缩胶缓冲液4X Buffer (pH 6.8)6)10X电泳缓冲液(Running buffer)2.制胶1)10%分离胶的制备ddH2O 4.92ml 9.98mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l） 2.5ml 5ml40%丙烯酰胺 2.48ml 4.96ml10% APS 100μl 200μlTEMED 4μl 8μl10%分离胶10ml 20ml2)灌注分离胶在加完TEMED后，速在两玻璃板间灌注丙烯酰胺溶液，预留1.5cm灌注浓缩胶（约在夹子高度稍低），应排除凝胶底部玻璃与板间的气泡。
用移液枪在丙烯酰胺溶液上层覆盖无水乙醇约4ml（至溢出），凝胶静置室温30min。
30min后，分离胶聚合凝固，倾倒出上层覆盖的无水乙醇，并用滤纸吸尽残留的液体。
3)5%浓缩胶的制备ddH2O 2.5ml 5mlTris-HCl缓冲液（pH 8.8，1.5mol/l）1ml 2ml40%丙烯酰胺0.46ml 0.92ml10% APS 40μl 80μlTEMED 2μl 4μl浓缩胶4ml 8ml4)灌注浓缩胶在加完TEMED后，迅速在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶至溢出，并立即插入梳子，避免产生气泡。
凝胶静置30min。
浓缩胶聚合凝固，小心拔出梳子，立即用ddH2O洗涤加样槽，以去除未聚合的丙烯酰胺。
3.加样1)蛋白样品变性在浓缩胶聚合的同时，将蛋白抽提液和加样缓冲液在沸水中加热5分钟，使蛋白变性。
2)灌注电泳缓冲液电泳槽中加满电泳缓冲液（ph8.3的Tris-Gly）。
3)蛋白加样用移液枪加样槽中加入样品和分子量蛋白标准品（Markers）。
所有加样槽均加样，空白孔用加样缓冲液代替，第一个孔加Markers5μl，其余孔加样品30μl。
Western blot protocol
Western blot 步骤(1)蛋白样品制备离心收集菌体。
加入200μl SDS-PAGE loding buffer重悬菌液，100°C煮6min，然后上样。
(2) SDS-PAGE电泳上样蛋白量为15μl。
(3) 转膜1、制备足够转移缓冲液以用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。
2、从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。
3、将凝胶浸入转移缓冲液中10~15 分钟。
4、滤纸在转移缓冲液中至少浸泡10分钟。
5、准备PVDF膜：剪取一张PVDF膜以及4张转膜滤纸(膜与滤纸的面积应等于或略大于凝胶)。
PVDF膜在甲醇中润湿膜10 秒；接着小心将膜放入双蒸水水中浸泡2 分钟；然后小心地把膜放入转移缓冲液中平衡至少10 分钟。
6、转膜（并标记MARKER）打开转膜装置依次铺上第一层滤纸，第二层滤纸，胶，PVDF膜，第三层滤纸，第四层滤纸，每次都用15ml离心管擀出气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
接线，盖上盖子，开电源跑00:30~2:00h。
如果要看转移后的效果，可转膜完成后用丽春红染液对膜进行染色，具体的操作步骤如下：1、将膜置于培养盒中。
2、加适当体积的丽春红S，在脱色摇床中染色５分钟，观察转印效果。
3、去除染液（可重复使用），双蒸水洗膜两次，每次5 分钟，这时如果膜上有转印的蛋白时，可以看见数条蛋白条带及泳道痕迹。
(4) 封闭：将膜(如膜干应先用甲醇湿润)用PBST稍漂洗2次，每次5min。
浸泡于封闭液(BLOTTO+T)中于37℃2小时(三维摇床50/分)。
(5) 洗膜：在培养皿中用PBST洗两遍，每遍约5min。
稀释一抗：用预先配制的BLOTTO+T来6倍稀释一抗。
配制一抗（稀释6倍）：0.33ml血浆+0.67ml BLOTTO+T。
(6) 膜与一抗孵育：把膜转至另一干净培养皿，加进一抗，于室温用三维摇床摇4℃过夜。
(7) 稀释二抗：取出培养皿，把膜移至另一培养皿，加进预制的PBST约15ml，洗4次，每次5min。
Western blot protocol
一．绘制BSA标准曲线(目的：测蛋白浓度)1.方法：BCA法(生工)2.需要配的试剂：1× PBS溶液10× PBS溶液：Na2HPO48 mMNaCl 136mMKH2PO4 2mMKCl 2.6mM3.注意：① 用分光光度计测定A562吸光值时，所需样品最小体积为1ml，即，加样体积为：1× PBS—0.5ml，BCA工作液—0.5ml；① 由于缓冲液1× PBS与BCA工作液是1:1等体积加的，所以，BSA被稀释为初次用1× PBS配制的梯度浓度的1/ 2，即，在绘制标准曲线时，BSA的终浓度需要÷ 2，切记！二．提取总蛋白1.试剂：配制时佩戴手套、口罩。
(1)单一母液：① 1M Tris (pH=8.0)：4℃保存称取12.114g Tris-base，加少于100ml蒸馏水溶解，调pH后，定容至100ml。
① 0.5M EDTA (pH=8.0)：4℃保存称取14.61g EDTA，加少于100ml蒸馏水，加固体NaOH至pH约为8.0时，EDTA方开始溶解，溶液状态变化过程：白色乳浊液——白色胶状物——白色乳浊液——无色透明液。
① 20% SDS：常温保存称取20g SDS，加蒸馏水定容至100ml.④100× PMSF (100 mM): 4℃保存称取261.3 mg PMSF，加15 ml 异丙醇溶解。
(2)复合母液：2× extraction buffer : 40ml1M Tris (pH=8.0) 2 ml0.5 M EDTA (pH=8.0) 160 μl20% SDS 4 mlWater 33.84 ml2.取样：取细胞浓度为2×107的藻液1ml于1.5ml EP管中，厌氧箱中离心1-2min，将沉淀物于液氮中速冻后置于-80①保存；3.提取总蛋白：3.1 根据样品数量计算所需的提取试剂体积：1个样品——1ml 1× extraction buffer3.2 配制1× extraction buffer:试剂：① 2× extraction buffer① 100× PMSF3.3 提取：将-80①保存的样品取出，置于冰上，加入步骤2.2配制的1× extraction buffer 1ml, 涡旋至EP管底部无沉淀黏着后，4①，12,000 rpm离心10 min，用1ml移液枪小心吸取上清于另一干净的1.5 ml EP管中，置于冰上。
Western Blot protocol
Western Blot protocol一、试剂准备1.蛋白裂解液配方：2. 1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)O 800 mlTris base (MW 121.1) 181.7g dd H2溶解之后用浓盐酸调PH至8.8（一般加几滴即可，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量），然后定容至1L。
高压灭菌后保存。
3. 1 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)Tris base (MW 121.1) 30.9 g dd HO 200 ml2溶解之后用浓盐酸调PH至6.8（，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量。
一般）然后定容至250 ml，经高压灭菌后使用。
4.10% AP （过硫酸铵）:O 溶解后分装，-20℃保存。
0.1 g过硫酸铵 + 1.0 ml Dd H2O加100 g SDS加热至68℃助溶，然后用浓盐酸调节PH 5.10% SDS：用900 ml的H2至7.2，最后定容至1L。
6.分离胶( 12% )[常用]：7.浓缩胶( 5% )：8. 5 × Running Buffer（储存液）:9. 1 × Running Buffer （工作液）：200 ml的5 × Running Buffer + 800 ml的ddO。
H210.转膜缓冲液：3.03 g Tris base + 14.4g甘氨酸溶解在少量的蒸馏水中，完全溶解后加100ml的甲醇，再用蒸馏水定容至1L。
11.10 × TBS ( 储存液) ：24.2 g Tris base + 80 g NaCl 溶解，用Hcl调PH至7.6，最后定容至1L。
O。
12.1 × TBS （工作液）：100 ml的10 × TBS + 900 ml的dd H213.TBST：含0.1% 吐温—20的1 × TBS。
Western Blot protocol实验步骤
Western Blot protocol主要试剂及缓冲液的配制1). 30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。
搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。
2). 10% SDS：称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。
3).10x蛋白电泳缓冲液：30.2gTris、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml4).20×转膜缓冲液：Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加水定容至1000ml配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml)5).1.5M Tris 8.8：（注意温度对tris PH值的影响）18.15 g Tris 溶于80ml超纯水中，加浓盐酸调PH值8.8，定容至100ml。
高温灭菌后室温保存。
6).1M Tris 6.8：12.11g Tris 溶于80ml 超纯水，加浓盐酸调PH值6.8，定容至100ml。
高温灭菌后室温保存。
7). 10×PBS：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H2O 35.85g，KH2PO4 2.4g，用盐酸调PH至7.4，加水定容至1000ml8). 1xPBST(0.05% Tween 20)：10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul9).10%（W/V）过硫酸铵：临时配，0.1g过硫酸铵溶于1ml 超纯水，4度冰箱保存3天10). 丽春红染液储存液(0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸)：，丽春红0.04g，冰醋酸2ml，超纯水 38ml11). 封闭液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使用时现配。
12) Stripping buffer (BME 800ul，SDS 2g，TRIS 0.756g，HCl调pH 至6.7，加水定容至100ml)操作步骤1.蛋白制备：10CM细胞平板，90%满度。
western blot protocol
Western Blot protocolSDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis【原理】Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。
是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。
Western Blot间接法基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。
印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA 或脱脂奶粉溶液）处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
目前有结合各种标记物的抗特定IgG 的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。
与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。
所以一般情况下都釆用间接法进行检测。
【实验耗材】•PVDF膜[MILLIPORE (IPVH00010)]•NC膜•滤纸[BIO-RAD (1703967)]【实验仪器】•PowerPac Basic电泳仪[BIO-RAD (041BR89156)]•Trans-Blot Turbo System 半干转转膜仪[BIO-RAD (690BR006827)]自制胶通常使用Bio-rad半干转转膜仪•iBlot Dry Blotting System 干转转膜仪[Invitrogen (25-0912)]需用Invitrogen 预制转印包•Chemi Doc XRS+显影仪[BIO-RAD (721BR04128)]【试剂】••5×量取100mL of 5×电泳液至500mL量筒中，加超纯水至500mL刻度线，配好后的电泳液在1个月内使用。
protocol-Western blot
Western bloting 技术（一）原理Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。
杂交技术主要有膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。
（二）操作步骤1.SDS-PAGE2.电转A 剪NC膜（或PVDF膜）大小、滤纸与凝胶板一致，浸泡在转移缓冲液中5min。
B 依次将压缩滤纸、凝胶、滤纸、压缩滤纸放在一起，膜一侧在下，凝胶一面在上。
C 接通电源电压15V，转移时间约半小时。
D 转移结束后，取出装置，依次取掉各层，在膜上剪角做标记。
3.杂交检测：A 膜的封闭：将NC膜放入小平皿中，加入封闭液（TBS-5%脱脂奶粉），37℃轻轻震荡2h。
B TBS洗三遍，每次5 min。
C 加入稀释的一抗（稀释液为TBS-1%脱脂奶粉），37℃轻轻震荡2h。
D 洗膜：弃去反应液，用TBS-0. 05%Tween-20洗三次，每次10min。
E 加入稀释的酶标二抗（稀释液为TBS-1%脱脂奶粉），37℃轻轻震荡2hF 洗膜：弃去反应液，用TBS-0. 05%Tween-20洗三至四次，每次10min。
G 将膜放入显色液中（注：二抗一般有两种常用标记酶，HRP和AP，其相对应的显色底物试剂盒为DAB和BCIP/NBT，HRP也可采用TMB底物，但显色条带易消退），室温轻轻摇动，10-30min。
H 待条带出现后，立刻用水洗膜，然后转入PBS中，观察记录。
（三）注意事项1. 确保灌胶均匀，一次完成2. 设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样，上样体积不能过大，容易造成样品不完全堆积导致带型不齐或串孔。
3．注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液4．电泳Buffer重复利用的时候要注意不能混浊，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度，Buffer一定要淹过梳子孔；5．跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何6．转膜前要用玻璃棒赶气泡7．膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法8．一般一抗比较珍贵，最好重复利用，一般确保能在短期内（3天）重复用。
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Western blot
1.蛋白提取：细胞或者组织匀浆液
Ripa裂解液的配置：
总体积：100ml
向烧杯中加入30ml millipore水，置于搅拌器上，放入搅拌子搅拌，
加入0.876g 氯化钠，
加入0.5g 脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，
加入1ml NP-40，
加入1m 10% SDS，
加入5ml 1M Tris-Cl (ph=8.0)，
待溶解完全并混匀后转移到量筒中，并用millipore水洗几次烧杯，然后倒入量筒中，
定容到100ml，倒入到试剂瓶中，标记备用。
配置细胞裂解液：1ml ripa buffer+5ul 0.1M PMSF + 1ul 1ug/ul leupeptin + 5ul 1M DTT（二硫苏糖醇）
Protease Inhibitor Target Protease Working Concentration
Serine proteases 0.1 – 1 mM
PMSF (Phenylmethylsulfonyl
fluoride苯甲基磺酰氟)
Benzamidine（苯甲脒）Serine proteases 1 mM
Pepstatin A （胃酶抑素）Thiol proteases（巯基蛋白酶） 1 μg/ml
Leupeptin（亮抑酶肽）Thiol proteases 1 μg/ml
Aprotinin （抑肽酶）Serine proteases 5 μg/ml
Antipain （抗蛋白酶）Thiol proteases 1 μg/ml
EDTA and EGTA Metalloproteases 0.1 – 1 mM
检测磷酸化的蛋白时需加入氟化钠NaF和钒酸钠Na3VO4来保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。
在做磷酸化的signal transduction时必需添加。
蛋白提取：
细胞：向培养皿中加入细胞裂解液，置于冰上摇10分钟，收集裂解液，4度离心，最大转速离心15分钟，收集上清液，备用，（分装，放到-20度保存）
组织：向新鲜组织中加入裂解液，用匀浆器裂解混匀，4度离心，最大转速离心15分钟，收集上清液，备用，（分装，放到-20度保存）
2.制胶：根据待测蛋白大小制备不同浓度的胶
分离胶：见配胶浓度表对于1mm制胶版需至少5ml分离胶
浓缩胶：见配胶浓度表需3ml浓缩胶
H2O 30% acrylamide(丙烯
10%APS TEMED 1.5M Tris(8.8) 1.0M Tris(6.8) 酰胺)
2.3ml 1.3ml 50ul 5ul 1.3ml
8%分离胶
（5ml）
2.1ml 0.5ml 30ul 3ul 0.38ml
5%浓缩胶
（3ml）
3.玻璃板用酒精棉球擦一遍，晾干，短板向外夹好在绿色架上。
4.先加分离胶，用乙醇封片，直到胶凝后倒出乙醇，其余用滤纸吸干，再加入浓缩胶，插梳子，待凝后拔出用针枪吹出气泡。
5.煮样本：100度沸水煮样本2-3分钟使样本变性，加6xloading buffer
6.电泳：上样，30ul/孔，将短波板向里，加ruuning buffer,内槽倒满，外槽加到2 gal处。
跑胶：先在较低电压跑胶，80V,20min,至条带到浓缩胶和分离胶的界面处，改为较高电压（100伏）跑1-1.5小时，等溴酚蓝跑到最下面就可以了，取出胶，在胶的右下角剪一个缺口标记好。
7.转膜：
大于20kD的蛋白用0.45um的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2um的膜，如过用0.45um的膜就会发生"Blowthrough"的现象
负极---纤维垫、滤纸、胶、膜、滤纸、纤维垫（1X transfer buffer 15min）---正极(白色) （与SDS结合的蛋白质带有负电荷，在电场的作用下从胶上转移到膜上，由疏水相互作用而与膜结合，转膜时间根据经验来调整，较小的分子一个小时左右即可，大的分子要2-3小时。
）
将红色放正面，加满1X transfer buffer，100V,2-3h,四周放入碎冰块降温，缓冲液可重复使用3-4次。
8.新配50ML 5%的脱脂奶粉，待转膜完毕后将膜放入脱脂奶粉中封闭，室温封闭1小时，或者4度过夜，封闭时需震荡，
9.加上一抗（不同抗体有不同稀释比例，需要摸索），膜正面向上，使抗体完全覆盖膜表面但又不溢出，室温于水平摇床上轻轻震荡1小时，
10.用TBST洗3次，每次10分钟，
11.加上二抗（稀释比例，通常1:2000---1:3000），室温于水平摇床上轻轻震荡1小时，
12.用TBST洗3次，每次10分钟，
13.制备ECL，加到膜上，（ECL淬灭较快，所以操作需要快速），在暗处反应1分钟，用保鲜膜包好硝酸纤维膜，去除多余的ECL，注意如沾到手套上要擦干净。
14.在暗室压片。
15.胶片曝光，显影定影。
注：显影液：27.6g显影粉+ 400ml H20(40~60℃) 混匀至清澈后，定容至500ml,棕色瓶中避光保存定影液：38.5g定影粉+ 400ml H20(40~60℃) 混匀至清澈后，定容至500ml,棕色瓶中避光保存。