食用植物油中痕量游离棉酚的超高效液相色谱-串联质谱测定

食用植物油中痕量游离棉酚的超高效液相色谱-串联质谱测定王雅朦郭咪咪魏征段章群张东李晓宁薛雅琳(国家粮食局科学研究院, 北京100037)摘要：本实验建立了超高效液相色谱-三重四级杆-串联质谱法（UPLC-ESI-MS/MS）测定食用植物油中游离棉酚的含量，实验以乙醇为提取溶剂提取食用植物油中的游离棉酚，采用Waters AQUITY UPLC BEH C18色谱柱进行分离，以乙腈-0.1%的甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱。

在电喷雾离子源（ESI）负离子模式和多反应通道监测（MRM）模式下进行定量分析。

结果表明：棉酚的质量浓度在0.005~5.0 μg/mL范围内线性关系良好，方法检出限LOD (S/N≥3)为10 μg/kg，定量限LOQ (S/N≥10)为50 μg/kg。

以0.25、2.5、25 μg/g三个不同棉酚浓度进行加标后测得平均加标回收率为80.3%~112.6%，相对标准偏差小于11%，精密度0.42%。

该方法灵敏度高，测定结果准确，回收率稳定，适用于确证检测食用植物油中的棉酚残留。

关键词：食用植物油棉酚超高效液相色谱-串联质谱中图分类号：O657.63; TS207.3 文献标志码：A 文章编号：Determination of free gossypol in edible vegetable oil by ultra performance liquidchromatography with tandem mass spectrometryWang Yameng, Guo Mimi, Wei Zheng, Duan Zhangqun, Zhang Dong, Li Xiaoning, Xue Yalin,（Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037）Abstract:A method was developed for the determination of free gossypol in edible vegetable oil by ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UPLC-ESI- MS/MS). In this method, ethanol was used as the extraction solvent to extract free gossypol from edible vegetable. The separation was carried out on a Waters AQUITY UPLC BEH C18 column with gradient elution. Acetonitrile and water (containing 0.1% (v/v) formic acid) were used as the mobile phase. The detection was achieved using electrospray ionization in negative ion (ESI-) mode and multi reaction channel monitoring (MRM) mode for quantification of the analytes. A good linearity for gossypol in the range of 0.005~5.0 μg/mL under the optimal conditions. The limit of detection (LOD, S/N≥3) was 10 μg/kg and the limit of quantification (LOQ, S/N≥10) was 50 μg/kg. The average recoveries of gossypol at three spiked levels of 0.25、2.5、25 μg/g were 80.3%~112.6% with the relative standard deviation less than 11.0%, and the degree of precision was 0.42%. With the advantages of easy and fast operation, higher recoveries, accurate results and good precision, the method was suitable for the confirmation and quantification of gossypol residue in edible vegetable oil.Key words:edible vegetable oil, gossypol, ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UPLC-ESI- MS/MS)1棉酚主要存在于锦葵植物棉花的种子、根皮及茎秆等色腺体中的一种黄色有毒多酚物质[1,2]。

我国拥有丰富的棉花资源，除小部分留作种用，大部分均用于榨油，在棉籽制油过程中，棉酚主要残留在棉籽油和棉籽饼粕中[3, 4]。

研究表明，当棉籽油中游离棉酚含量过高会对动物的神经系统、血管组织、生殖系统等有毒害作用[5-7]，长期食用棉酚含量较高的棉籽油会引起中毒。

鉴于棉酚的危害，美国食品药品监督管理局和世界卫生组织分别建议将食品中游离棉酚的含量限制为450 mg/kg和600 mg/kg，我国要求棉籽油中游离棉酚的限量需小于等于0.02%[8, 9]。

现如今我国毛油加工企业中有现代化的大型企业，也有遍布乡镇的榨油小作坊，榨油的技术水平差别很大，导致部分经精炼的棉籽油仍含有过量棉酚。

与此同时，由于食用植物油的品种、产量、营养价值等不同，其价格差异也非常大，这就导致一些不法经营者为谋取暴利而进行食用植物油掺假，如在芝麻油、花生油中掺入大豆油、棉籽油等低附加值食用油，2013年台湾爆发黑心油掺假事件，就是在橄榄油中掺入棉籽油，为此台湾地区卫生福利部将食用油中棉酚限量值规定为1 mg/kg。

棉酚作为棉籽油的特征物质可以为不法商家以廉价棉籽油冒充高附加值食用油的佐证。

因此，该方法的建立旨在建立棉酚高选择性、高灵敏度的检测方法，鉴别是否在食用植物油中掺有棉籽油[10-12]。

目前游离棉酚常用的分析检测技术主要有分光光度法[13]、薄层色谱法[14]、高效液相色谱法（HPLC）[15,16]、高效液相色谱质谱联用法（HPLC-MS）等[17]。

其中分光光度法操作简便，但是稳定性差，易受其它因素干扰；薄层色谱法使用设备简单，但是由于棉酚类似物较多，实验条件或处理方式不当会造成定量结果不准确；高效液相色谱法虽然得到广泛的应用，但该方法的检出限和定量限较高。

食品安全国家标准中数据显示，以植物油体样品取样 1.0 g 时，该方法的检出限为 2.5 mg/kg ，定量限为7.5 mg/kg，检出限较高，不满足痕量棉酚的检测要求[18, 19]。

HPLC-MS将色谱对化合物的分离能力和质谱的高选择性、高灵敏度以及精准分析化合物分子结构等优点相结合，在检测痕量残留时具有很大的优势，UPLC是一种基于小颗粒填料的液相色谱技术，比传统的HPLC具有更高的分析能力，与质谱联用能够进行更加精确的测定[20, 21]，该法的定量限可以低至50 μg/kg，能满足目前市场的检测需求。

施琦贻等[22]建立了HPLC-MS 法测定鲜蛋黄中的棉酚残留，该方法的定量下限为1 ng/mL，棉酚含量在1~100 ng/mL范围内线性关系良好。

张文华等[23]建立了HPLC-MS法测定饲料中棉酚的残留，方法的定量下限为1 mg/kg，棉酚含量在10~100 μg/L范围内线性关系良好。

Coward等[24]使用芹菜素作为内标，建立HPLC-MS内标法定量分析小鼠血浆中的棉酚类似物，该方法线性范围为10~2000 ng/mL，加标回收率为90.8%±12.9%，精密度小于15%，但是目前采用液质联用法测定食用植物油中的游离棉酚至今鲜少有人报道。

本文旨在建立测定食用植物油中痕量棉酚的超高效液相色谱-三重四级杆-串联质谱测定方法（UPLC-ESI-MS/MS），对于推进食用植物油中痕量游离棉酚残留的有效监测具有重要意义。

1 材料与方法1.1 材料与试剂棉籽、食用植物油样品均来自于国内市场。

标准品：棉酚（HPLC级，纯度≥95%，美国sigma公司）；乙醇、丙酮、乙腈、甲酸均为色谱纯。

1.2 仪器与设备TSQ Quantum Ultra三重四级杆质谱仪（搭配Acquity超高效液相系统）美国Thermo公司；AB204-S分析天平瑞士Mettler T oledo公司；KQ5200DE超声发生器昆山市超声仪器有限公司；3-18KS高速冷冻离心机德国sigma公司；Rotavapor R-215旋转蒸发仪瑞士BUCHI公司；JSP-100型高速多功能粉碎机浙江省金德机械有限公司。

1.3 试验方法1.3.1 标准溶液的配制准确称取适量棉酚标准品，用丙酮溶解并定容，配成1 mg/mL的标准储备液；用无水乙醇逐级稀释溶液至5, 1, 0.5,0.1, 0.05, 0.01, 0.005 μg/mL的梯度溶液。

用UPLC-ESI- MS/MS进行MRM扫描，绘制标准曲线。

1.3.2 样品前处理将不同产地的棉籽脱壳，粉碎机粉碎，过筛。

将经处理的棉籽放入锥形瓶中，按料液比1：10加入正己烷，采用超声强化提取，过滤出渣，提取液于40℃减压蒸馏，即得粗制棉籽油。

准确称取食用植物油样品0.5000 g于10 mL离心管，加入2.5 mL无水乙醇，涡旋振荡混匀，超声10 min，静置分层2 h，13000 r/min高速离心10 min，转移上清液至5 mL容量瓶中，下层重复提取棉酚一次，合并上清液，定容，以备UPLC-ESI-MS/MS检测。

1.3.3 色谱条件Waters ACQUITY C18柱（100×2.1 mm, 1.7 μm），柱温25°C，流速为0.3 mL/min，进样量5 μL。

流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为乙腈。

洗脱梯度：0~2 min, 50% B; 2~3 min, 50%~90% B; 3~8 min, 90% B; 8~9 min, 90%~50% B; 9~12 min, 50% B。