基因工程与体外表达
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
基因工程的原理和技术
基因工程的基本原理：
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细 胞中稳定和高效的表达。根据不同的实验目的，目 的基因可以有很多种，如抗虫基因、抗病基因、抗 除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。因 此表达的产物各不相同。通过基因工程的基本操作 ，就能实现目标。
二、基因操作的基本步骤
第三步：将目的基因导入受体细胞
选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：
基因工程的 最终目的
得到大量特 殊蛋白质
得到转基因动物 得到转基因植物
常用的受 体细胞
大肠杆菌 等微生物
受精卵 植物体细胞
导入的方法
Ca2＋处理法 显微注射法 农杆菌转化法
将目的基因导入微生物细胞
常选细菌 作受体细胞的原因：它 们繁殖力极强，生长速 度很快，短期内就会产 生大量后代，所以把目 的基因转入这些细菌， 就能在短时间内得到大 量的目的基因产物。
细菌的检测：
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的 菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
多细胞生物的检测： 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体， 检测这些个体是否表现出相应的性状。
例：抗虫棉检测
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不 出现中毒症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。
例：下列有关基因表达载体的构建说法正确的是( C ) A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子 B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性 核酸内切酶 C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来 源的DNA重新组合的过程 D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处， 先形成磷酸二酯键，再形成氢键
DNA体外重组技术介绍
星活性: 酶切反应条件不能满足最适 条件,导致某些酶产生第二活性.
EcoR I*
GAATTC
AATT
酶切反应体系的建立：
标准的酶切体系 1μgDNA，20μl总反应体积，1U酶，推 荐的Buffer和温度，反应1h
酶切体系组成
• 内切酶 根据实验目的选择，保存，使 用，稀释（避免失活与污染）
第五章
DNA体外重组技术
概述
一、DNA重组技术相关概念
克隆(clone) 来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细 胞
或克动 隆物 化（(c常lo被ni成ng为) 副本或拷贝）。 获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。
DNA克隆(DNA cloning)
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子。
• 大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶， 分解X-gal，使菌落为蓝色。
pBR322质粒：一种克隆质粒
结构：
ORI：复制起始点， 保证高拷贝自我复制。
Ampr, Tetr：
Ampr
两个抗性基因用于
Tetr
筛选阳性克隆。
Pst I, BamH I：
两个单酶切位点用于 ORI 插入目的基因
pfxBlue: 克隆质粒
质粒载体
体 酵母人工染色体
粘性载体
二、不同载体的特点与分类 （一）质粒载体 1. 质粒(plasmid)
定义: 细菌染色质以外的双链环状DNA， 能自我复制和表达其携带的遗传信息。
染色质 质粒 细菌培养
大肠杆菌
质粒扩增并表达蛋白质
基因工程重点
绪论一、基因的概念：基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。
二、基因工程的概念：基因工程是在分子水平上，提取（合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，在和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA 分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA （基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们大的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下一代。
三、基因工程诞生理论三大发现和技术的三大发明1、理论上的三大发现（1）20 世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA（2）20 世纪50年代提出了DNA 双螺旋结构（3）20 世纪60 年代确定了遗传信息的传递方式中心法则，提出了遗传信息流，即DNA>RNA>蛋白质，从而在分子水平上揭示了遗传现象。
2、技术上的三大发明（1）限制性核酸内切酶的发现（2）DNA 连接酶的发现，1967年，发现了DNA 连接酶，1970 年，发现了T4 噬菌体DNA 连接酶。
（3）基因工程载体的研究与应用，载体是特定的、具有自我复制能力的DNA 分子上。
在完成以上三大理论发现和三大技术发明后，基因工程诞生的条件已经成熟。
1973年Cohen和Boyer的基因重组实验，分别用EcoR I切割质粒pSC101和PSC102然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况，同时设计一些合理的对照实验。
这标志着基因工程正式诞生了。
四、基因工程的基本过程基因工程的基本过程（主要内容）：①带有目的基因的DNA 片段的分离或人工合成。
②限制性核酸内切酶分别将外源DNA 和载体切开。
③在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。
④重组DNA 分子导入受体细胞（也称宿主细胞或寄主细胞）⑤带有重组DNA 分子的细胞培养，获得大量的细胞繁殖群体。
⑥筛选和鉴定转化细胞，获得外源基因高效稳定表达的细胞。
基因工程名词解释
基因工程名词解释1 基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接;使遗传物质重新组合;然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内;进行无性繁殖;并使所需的基因在细胞中表达;产生人类所需的产物或新生物类型2 限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列;并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶3 粘性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构;它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来4 平末端：当限制酶从识别序列的中心轴西线处切开时;切开的DNA两条单链的切口;是平整的;这样的切口叫平末端5 酶的星号活性：极度非标准反应条件下;当条件改变时许多酶的识别位点会改变;导致与切割序列的非特异性;这种现象称为星号活性6 载体：将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具7 质粒的不相容性：两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象8PCR引物：在PCR反应中;与待扩增的DNA两侧碱基互补的寡核苷酸片段;其本质是单链DNA9cDNA文库：指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段;分别与克隆载体重组;储存于某种受体菌中;该群体就称该生物基因组的cDNA文库10基因组文库：指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段;在与合适的载体在体外重组;并转化相应的宿主细胞;获得的所有阳性菌落;这个群体就称为该生物基因组文库11DNA体外重组：将外源DNA用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上12 感受态细胞：经过适当处理后容易接受外源DNA进入的细胞13 受体细胞：从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞14 报告基因：一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因;也就是说是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因..把它的编码序列和基因表达调节顺序相融合形成嵌合基因;或与其它目的基因相融合;在调控序列控制下进行表达;从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控;筛选得到转化体15 简并序列：分子生物学中;同一种氨基酸具有两个或更多个密码子现象称为密码子的简并性;这样的序列就叫兼并序列16 目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段17 同尾酶：来源不同;识别靶序列不同;但产生相同的粘性末端的核酸内切酶..18 同裂酶：来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶;同裂酶进行同样的切割产生同样的末端;但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同19DNA连接酶：一类能够催化双链DNA片段;靠在一起的3‘-OH末端和5’磷酸之间通过形成磷酸二酯键使末端连接的一种酶20DNA聚合酶：能在引物和模板的存在下把脱氧核糖核酸连续加到双链DNA分子引物链的3‘OH末端;催化核苷酸的聚合作用21 基因组装：把合成的DNA片段构建成完整的基因的过程22 杂交探针：指具有一定序列的核苷酸片段;它能与互补的核酸序列复性杂交;并且通过适当标记进行检测23 转化率：外源DNA导入细菌的效率;通常用每克DNA获得转化体的数量表示24 感受态：受体菌接受外源DNA的能力的一种生理状态;一般在生长对数期的后期时间很短暂;可用氯化钙处理25 人工接头：一段人工化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体;长度一般8-12个碱基;上面有某种限制性内切酶的酶切位点;把这样的序列叫人工接头26 体外包装：在体外模拟入噬菌体DNA分子在受体细胞内发生的一系列特殊的包装反应过程;将重组入噬菌体DNA分子包装为成熟的具有感染能力的入噬菌体颗粒的技术27 生物安全：现代生物技术的研究、开发、应用以及转基因生物的跨国转移;可能对生物多样性、生态环境和人体健康所构成的潜在风险与威胁28 松弛型质粒：细菌内复制不受严格控制的质粒;在细菌染色体外能大量独立复制的质粒;每个细菌中可存在数百到数千个拷贝29 严谨型质粒：细菌内复制受到严格控制的质粒;在细菌细胞内只能形成少量拷贝的质粒30Ti质粒：是根癌农杆菌中发现的可引发植物产生冠瘿瘤的质粒31 克隆载体：指用于扩增或保存外源DNA片段而设计的载体32 噬菌粒：由质粒载体和单链噬菌体结合而成的新型载体系列33cosmid质粒：是一类用于克隆大片段DNA的载体;是由入噬菌体的cos末端及质粒重组而成的载体34 穿梭质粒载体：人工构建具有两种不同复制起点和选择标记可以在两种不同的重组细胞中有活性复制的质粒载体35 基因文库：是指将某种生物体基因转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组;再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞;获得所有阳性菌落;这个群体称为微生物基因组文库36 转化子：统计每个培养皿中的菌落数;转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子37 转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞;并在受体细胞内稳定维持和表达的过程38 转染：是专指感受态大肠杆菌细胞;捕获和表达噬菌体DNA分子的过程39 衔接物：指人工合成的一段由10-20nt组成具有一个或数个限制性内切核苷酸酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段40 植物细胞全能性：指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息;从而具备发育成完整植株的遗传能力41 重组子：两个突变位点之间可发生交换产生野生型的最小单位;即不能由重组分开的基本单位42 无细胞翻译系统：没有完整细胞的体外蛋白质翻译合成系统..通常利用无细胞提取物提供所需要的核糖体、转移核糖核酸、酶类、氨基酸、能量供应系统及无机离子等;在试管中以外加的信使核糖核酸mRNA指导蛋白质的合成43包涵体：在某些生长条件下;大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子 ;它们致密地集聚在细胞内;或被膜包裹或形成无膜裸露结构;这种水不溶性的结构称为包涵体44 简并引物：由于一个氨基酸可以对应一个到多个密码子;因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列;称之为简并序列..相应合成这一段序列作PCR扩增体系的引物即为简并引物45 转基因动物：将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中;从而形成在体表达外源基因的动物;称为转基因动物46 反向PCR：是对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增;获得未知序列的一种快捷方法;其原理是：用限制性内切核酸酶消化部分序列已知的DNA;将酶切产物自连接成环状;再用已知序列上一对相反方向的特异性引物进行PCR;从而扩增出已知序列侧翼的未知DNA47 多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列;含有多个限制内切酶识别位点..能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案58基因文库的完备性：在构建的基因文库中任意基因存在的概率..他与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=lin1-p/lin1-f49 基因沉默：基因沉寂是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段..是转基因的失活和在细胞中的不表达;由于组蛋白的乙酰化修饰和DNA的甲基化修饰..50mRNA差异显示技术：51 末端转移酶：52 共抑制：53 盒式PCR：54 插入效应：55DNA接头：56 基因组装：57RACE技术cＤＮＡ末端的快速扩增技术：。
基因工程
1、基因工程，是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
（供体基因、受体细胞、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
）2、同尾酶：识别的靶序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。
这两个相同的粘性末端称为配伍未端。
3、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶。
同裂酶的切点位置可相同或不同。
4、1酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割1μg λDNA所需的酶活性5、星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称星号（*）活性。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、PCR扩增引物：是指与待扩增互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在15～30个核苷酸之间。
8、linker：是指用化学方法合成的一段由8~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。
9、衔接头：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶切的粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。
10、粘性末端：因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称），酶切后形成得具有互补碱基的单链末端结构。
酶切后产生两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。
11、平末端：因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。
12、基因克隆载体：通过不同途径将承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞且能在其中维持的DNA分子。
也称DNA克隆载体。
13、cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的书暗恋区域称为~~14、受体细胞:又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。
基因工程名词解释
名词解释：1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。
2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。
其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。
3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。
.基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。
Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。
plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性.multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。
粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。
并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。
《基因工程》名词解释
名词解释：1.Gene Engineering基因工程：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。
2.HGP人类基因组计划：是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。
其宗旨在于测定组成人类染色体（指单倍体）中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。
3.Gene Therapy 基因治疗：是指将外源正常基因导入靶细胞，取代突变基因，补充缺失基因或关闭异常基因，达到从根本上治疗疾病的目的。
.基因诊断：是利用重组DNA 技术作为工具，直接从DNA水平监测人类遗传性疾病的基因缺陷。
Vector载体：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。
plasmid质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
shuttle vector穿梭载体：是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。
质粒不相容性;同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒不相容性.multiple cloning sites，MCS多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制内切酶识别位点。
能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
α-互补：LacZ’基因的互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。
粘性末端：指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。
并在DNA连接酶的作用下, 使同一DNA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。
14
15
2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。
Published by AAAS
Synthetic Genome Brings New Life to Bacterium (2010/5/20)
E. Pennisi Science 328, 958-959 (2010)
Life re-created. Blue colonies (top) indicate a successfully transplanted genome, with selfreplicating bacteria revealed in an electron micrograph.
2
Genetically modified crops
3
E. Stokstad Science 328, 295-a (2010) (2010)
Going green. Rather than plowing, farmers can control weeds by spraying biotech crops with herbicides, which lessens soil erosion and reduces fuel costs.
5. 几个小时之内，受体细菌内原 有DNA的全部消失，人造细胞不 断繁殖。新的生命诞生了。
6
第一节 基因克隆的工具酶
一、限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease） 能从双链DNA内部特异位点识别并且裂
解磷酸二酯键, 生成寡/寡聚核苷酸 。
7
8
2．限制性内切酶的命名 EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株
即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个
磷酸二酯键所出现的单链断裂；而不能封闭裂口（gap），
即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形
成的单链断裂。
23
5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制
备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止 载体自身连接，提高重组效率。
第八章
基因工程与体外表达
Gene Engineering and Expression in vitro
分子生物学研究中心
1
基因工程是指在体外对DNA分子按照
既定的目的和方案，进行剪切和重新连接，
然后把它导入宿主细胞，从而能够扩增有
关 DNA 片 段 ， 表 达 有 关 基 因 产 物 ， 进 行
有5ˊ→3ˊ聚合酶活性 有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
16
Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。
17
(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。
5ˊ-G-OH 3ˊ-CAATT-OH
Klenow d*ATP,dTTP
5ˊ-GTT*A*A-OH 3ˊ-CAA T T-OH
1. 选取一种名为丝状支原体的细 菌，将它的染色体解码。然后利 用化学方法一点一点地重新排列 DNA
2. 将重组的DNA碎片放入酵母液 中，令其慢慢地重新聚合。
3. 将人造DNA放入另外一个受体 细菌中。通过生长和分离，受体 细菌产生两个细胞，一个带有人 造DNA，另外一个带有天然 DNA。
4. 培养皿中的抗生素将带有天然 DNA的细胞杀死，只留下人造细 胞不断增生
端或钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ：
11
二、其他常用的工具酶 1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)
有聚合酶活性 有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
12
13
核酸外切酶(exonucleases)从多核苷酸链的一端开始
按序催化水解磷酸二酯键，降解核苷酸, 产生单个
DNA序列分析，基因治疗，研究基因表达
的调节元件（如启动子、增强子等），以
及研究基因的功能等。
Also called as genetic engineering, recombinant
DNA technology, genetic modification/
manipulation (GM) and gene splicing .
9Байду номын сангаас
3．限制性内切酶的识别和切割位点 通常是4～6个碱基对、具有回文序
列（palindrom）的DNA片段，大多数酶 是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性 末端（sticky end）。
如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：
10
PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端： 有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平
26
27
第二节 基因克隆的载体
载体 (vector):
将外源DNA片段（目的基因）转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。
19
20
4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）
由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码, 催化 双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的 5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具 有相同黏性末端或平端的DNA两端连接 起来。
21
22
DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口（nick），
(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。 (4) DNA序列分析。
18
3. 逆转录酶（reverse transcriptase）
是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以 RNA为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ ，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。
用于以m末端脱氧核苷酸转移酶
末 端 脱 氧 核 苷 酸 转 移 酶 （ terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT），简 称末端转移酶。它的作用是将脱氧核苷 酸加到DNA的3ˊ-OH上，主要用于探针 标记；或者在载体和待克隆的片段上形 成同聚物尾，以便于进行连接。