外源基因表达与基因工程药物
基因工程药物的研究热点
基因工程药物的研究热点随着社会的发展，人們对内在追求的迫切需要越来越强烈，所以导致现在人们对生物制药技术的发展更加的迫切，同时在各个时期涌现出对其不同程度、不同方向的热点研究。
以下讲述的研究内容为表达系统、细胞因子、转基因植物药用蛋白的热点研究简述。
标签：基因工程药物；研究应用；热点；表达系统；细胞因子；转基因植物；药用蛋白当今社会的四大科学之柱为微电子、生物技术、新型材料以及航天技术。
而随着社会的发展，生物制药的重要性尤其突出，人们对内在追求的迫切需要越来越强烈，所以导致现在人们对生物制药技术的发展更加的迫切，同时在各个时期涌现出对其不同程度、不同方向的热点研究。
简单来说，基因工程药物是指先确定对某种疾病有预防或者治愈的蛋白质，将控制其蛋白质合成的基因取出来，经过一系列基因操作，后经过表达系统表达后，成功的大规模生产这些蛋白质的研究方向和过程。
基因工程药物的发展过程中，首先是转基因的研究以及深入后，后基因组时代就到来了，生物反应器，反义核酸技术等基因技术不断发展和完善，直到今日发展和完善生物药物制剂、大分子药物吸收、转运机理研究和给药系统研究、新药研发等都成为基因工程药物研究的大热点，结合基因组学、蛋白质组学、药物基因学等学科使研究药物更加广泛化和效用化。
一、开发热点之一：表达系统研究可以高效表达外源基因的表达系统是基因工程制药中研究和应用的重要内容之一。
表达系统的高效性决定了外源基因表达的高效性，后对基因工程药物的效用也会产生直接的影响。
我们通常使用大肠杆菌来作为实验的表达载体，也表达成功了许多外源基因。
但是它的缺点也更加明显，比如不能表达复杂的蛋白质、II型分泌表达产物产量低下等原因。
后来，我们又研究哺乳类细胞、昆虫类细胞的表达系统，虽然可以成功的表达结构复杂的蛋白质，但是表达能力低下，产物含量低且操作过于复杂，价格显得过于昂贵，不易普遍推广。
随着研究的进行，研究发现酵母细胞在表达系统上有很强的优势性。
外源基因的导入和表达机制
外源基因的导入和表达机制随着生物技术的飞速发展，外源基因的导入和表达成为了基因工程领域中的重要课题。
其涉及到基因治疗、转基因作物、药物生产等许多领域。
在导入和表达外源基因的过程中，要考虑到基因的适应性、表达的稳定性、特异性以及对宿主生物的影响等多个方面。
本文将探讨外源基因的导入和表达机制，包括基本原理、工具和技术以及存在的问题和挑战。
基本原理导入和表达外源基因的基本原理是将外源DNA序列引入到宿主细胞中，使其被转录和翻译成蛋白质。
具体而言，一般有两种方式：直接转染和向宿主基因组中嵌入外源基因，后者也称为基因整合。
直接转染是将外源DNA序列直接引入到细胞外，在细胞膜相关的受体介导下，外源DNA序列被进入到细胞质中。
直接转染的DNA所携带的信息将指导它在宿主细胞内的表达。
基因整合是将外源DNA序列整合到宿主细胞染色体上，使其成为宿主细胞的一部分。
基本原理是将外源DNA构建为一个适合于整合的载体，然后具体通过发生基因重组或嵌入基因导入宿主细胞的染色体中。
被整合的外源脱氧核糖核酸(DNA)序列将被遵循宿主细胞一样转录并翻译成蛋白质。
工具和技术导入和表达外源基因要解决的核心问题就是如何将外源DNA 送入宿主细胞。
为此，研究者现有许多的工具和技术可供选择。
电穿孔是将宿主细胞暴露在高电场的冲击下，使细胞膜通透性增强，外源DNA得以进入的技术。
这种技术既可以使用简单的电刺激来进行，也可以通过利用特殊设备专门进行。
这种技术在大多数细胞类型中都是有效的。
群粒化法是利用氟化物和离子溶液百炼生化学反应，在其中产生群粒化团块，通过进一步化学反应打开细胞膜，使外源DNA进入细胞内部。
这种技术适用于一些难以被电穿孔的细胞类型。
病毒载体是将外源DNA序列植入病毒中，通过感染宿主细胞扩增表达，使表达的目标基因在细胞内获得较高的表达水平。
存在的问题和挑战虽然外源基因的导入和表达在许多方面得到了极大的改进，但仍然存在着一些问题和挑战。
第二章基因工程制药
第一节
概 述
基因工程技术诞生：20世纪70年代 现代生物技术的发展
基因工程：
应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物
遗传性，创造新的生物物种，通过工程化手段为人类提供有用产品
和服 务的技术。
一、基因工程技术生产药品的优点
1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得（富集）的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。
超声破碎法
四、固液分离
分离细胞碎片常用的方法有：
1. 离心沉淀：高速离心、超速离心 2. 膜过滤：微滤、超滤和反渗透
3. 双水相萃取：聚乙二醇-葡聚糖
聚乙二醇-无机盐
五、重组蛋白质的分离纯化
分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括： 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。
发夹结构 RNaseH S1核酸
4．cDNA克隆
质粒 入噬菌体 酶、 定向、A T克隆
化 学 法 电 击 转 染
5．将重组体导入宿主细胞 差示 抗体 抗性获得 抗性失活 显色
二、大肠杆菌中的基因表达
2．影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
（1）外源基因的拷贝数 （2）启动子的强弱 （3）SD序列的有效性 （4）SD与ATG的间距 （5）密码子的组成（偏爱性） （6）产物的稳定性 （7）产物对宿主的影响
二、大肠杆菌中的基因表达
3．表达形式
（1）融合蛋白，增强稳定性。 （2）非融合表达。
五、重组蛋白质的分离纯化
3. 亲和层析： 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非 常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既 是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这 种结合解除。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
基因工程应用的具体例子
基因工程应用的具体例子基因工程是一门应用广泛且前景广阔的学科，通过对生物体的基因进行修改和调控，可以实现对生物体性状的改良和功能的增强。
下面将列举10个具体的基因工程应用例子。
1. 人类胚胎基因编辑人类胚胎基因编辑是一项具有潜在影响力的基因工程技术，它可以通过修改人类胚胎的遗传信息，来预防或治疗一些遗传性疾病。
例如，科学家们可以利用CRISPR-Cas9技术，修复携带遗传疾病的基因，并防止其遗传给后代。
2. 转基因作物转基因作物是指通过基因工程技术将外源基因导入植物基因组中，使其具备一些新的性状或功能。
例如，转基因作物可以抗虫害、耐旱、耐盐碱等，从而提高作物的产量和抗逆能力。
3. 基因治疗基因治疗是一种利用基因工程技术来治疗疾病的方法。
通过将正常基因导入患者体内，修复或替代缺陷基因，从而恢复患者正常的生理功能。
例如，基因治疗可以用于治疗遗传性疾病、肿瘤和免疫系统相关的疾病等。
4. 基因工程药物基因工程药物是利用基因工程技术生产的药物，它们可以通过改变患者的基因表达来治疗疾病。
例如，基因工程药物可以用于治疗癌症、糖尿病、血友病等疾病。
5. 基因工程疫苗基因工程疫苗是利用基因工程技术生产的疫苗，它们可以通过引入病原体的基因片段，激活患者的免疫系统，从而预防疾病。
例如，基因工程疫苗可以用于预防流感、乙肝、艾滋病等疾病。
6. 基因工程动物基因工程技术可以用于改造动物的基因组，使其具备人类所需要的一些性状或功能。
例如，科学家可以通过基因工程技术制造转基因小鼠模型，用于研究人类疾病的发生机制和治疗方法。
7. 基因工程显微生物基因工程技术可以用于改造微生物的遗传信息，使其具备一些新的功能。
例如，科学家可以通过基因工程技术制造转基因大肠杆菌，用于生产人类重组蛋白和药物。
8. 基因工程生物燃料基因工程技术可以用于改造植物和微生物的基因组，使其具备高效生产生物燃料的能力。
例如，科学家可以通过基因工程技术改造藻类和细菌，使其能够利用太阳能和二氧化碳合成生物燃料。
生物技术制药试题
生物技术制药试题生物技术制药试题1. 生物技术制药生物技术制药是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法进行药物制造的技术。
2. 基因表达基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子.生物体内的各种功能蛋白质和酶都是同相应的结构基因编码的。
3. 质粒的分裂不稳定通常将质粒不稳定性分为两类:一类是结构不稳定性,也就是质粒由于碱基突变、缺失、插入等引起的遗传信息变化;另一类是分离不稳定性,指在细胞分裂过程中质粒不能分配到子代细胞中,从而使部分子代细胞不带质粒(即P-细胞)。
在连续和分批培养过程中均能观察到此两类现象发生。
一般情况下具有质粒的细胞(即P＋细胞)需要合成较多的DNA、RNA和蛋白质,因此其比生长速率低于P-细胞,从而P-细胞一旦形成能较快速地生长繁殖并占据培养物中的大多数。
4. 补料分批培养发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。
它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。
因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。
但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。
5. 人-鼠嵌合抗体嵌合抗体（ chimeric atibody ）是最早制备成功的基因工程抗体。
它是由鼠源性抗体的 V 区基因与人抗体的 C 区基因拼接为嵌合基因，然后插入载体，转染骨髓瘤组织表达的抗体分子。
因其减少了鼠源成分，从而降低了鼠源性抗体引起的不良反应，并有助于提高疗效。
6. 悬浮培养非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
基因工程在生物制药领域的应用探讨
基因工程在生物制药领域的应用探讨作者：匡光永来源：《中国民商》2021年第08期摘要：随着经济社会的发展，生物制药领域开始引入基因工程技术，使用基因工程技术对自身进行改造和发展。
本文从生物制药领域中的基因操作技术分析概念入手，进行以基因工程为基础的其中几类药物类型的分析，从而了解基因工程生物制药所面临的机遇以及需要解决的问题，从而使其得到更好的发展。
关键词：基因工程;生物制药;前景一、生物制药领域中的基因操作技术分析（一）基因大分子分离技术DNA大分子的分离技术，最常用的是DNA电泳。
在电泳之前，首先要提取基因所在的位置，以细菌的质粒DNA为例，现阶段使用的提取方法是碱裂解法，具体是将含有质粒的大肠杆菌用NaOH和SDS混合的变性液进行处理，再用高速离心机离心处理，从而将质粒DNA分离出来。
进一步地，如果想要分离出目的DNA片段，就需要用到DNA电泳技术，常用的电泳是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
凝胶电泳的原理其实很简单，DNA是一种多聚阴离子，将其放置在电场中，DNA分子就会迁移到正电极的方向，DNA分子的长度越长，携带的净电荷越多，向正电极方向迁移的速率就越快，因此，在电场强度一定的条件下，DNA 分子的迁移速率取决于DNA片段的大小和构型。
电泳的步骤为：配胶-制胶板-样品的处理-点样-电泳-检测。
（二）PCR技术PCR技术，即聚合酶链式反应，是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，可以实现短时间内少量甚至微量DNA分子的大量扩增。
PCR技术是分子克隆技术的基石，是基因工程中必不可少的技术。
PCR技术的原理来源于DNA的半保留复制，在生物体内，DNA的复制过程分为三个阶段：复制的起始、延伸和终止，PCR也分为三个阶段：高温变性、复性和延伸，这三个阶段不断的循环往复，从而得到大量的目的基因。
PCR技术已广泛应用于基因的克隆，分子探针的制备和基因定位等实验中，在生物制药领域中也常用于诊断试剂的开发。
生物药物分析与检验基因工程药物检验
2、有限代次的生产
提供培养生产浓度与产量恒定性的数据； 依据宿主细胞-载体系统稳定性，确定最高 允许传种代数和细胞倍增数，并应提供最适 培养条件的详细资料。
3、连续培养生产
应提供经长期培养后所表达基因的分子 完整性资料，以及宿主细胞的表型和基因 型特征。
4、纯化
对于收获、分离和纯化的方法应详细记 述，应特别注意污染病毒、核酸以及有害抗 原性物质的去除。
基因工程产物的杂质包括蛋白质和非蛋 白质两类。
蛋白类杂质： 残留宿主细胞蛋白 采用 免疫分析的方法
非蛋白质类杂质：
①病毒污染检查 ②无菌试验 ③热原质试验 ④残余细胞DNA测定。 ⑤抗原性物质检查 ⑥其他外源性物质
常用检测方法：
杂质和污染物
内毒素 宿主细胞蛋白 其它蛋白杂质 残余DNA 蛋白变异
3.表达
应详细叙述在生产过程中，启动和控制克 隆基因在宿主细胞中的表达所采用的方法及 表达水平。
(二)生产的控制
在工程菌的贮存中，要求种子克隆纯而稳定；
在培养过程中，要求工程菌所含的质粒稳定， 始终无突变；
在重复生产发酵中，工程菌表达稳定；
始终能排除外源微生物污染。
1、原始细胞库
应详细记述种子材料的来源、方式、保存 及预计使用寿命；应提供在保存和复苏条件 下宿主载体表达系统的稳定性证据；采用新 的种子批时，应重新作全面检定。
4.稳定性考察
药品的稳定性是评价药品有效性和安 全性的重要指标之一，也是确定药品贮 藏条件和使用期限的主要依据。
5、 产品一致性的保证
只有对从原料、生产到产品的每一步 骤都进行严格的控制和质量检定，才能 确保各批最终产品都是安全有效、含量 和杂质限度一致并符合标准。
第三节 基因工程药物的检验
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早 期 基 础 理 论
克里克等提出中心法则
复制
转录 DNA 逆转录 RNA
翻译 蛋白质
科技探索之路：
基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的 遗传密码，1966年霍拉纳用实验加以证明。
二、分子遗传学新方法是 基因工程的技术基础
2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿,我国约6000万。 治疗糖尿病特效药——胰岛素。 每100kg 猪或牛的胰腺中仅可提取4~~5g。
1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内， 实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。
胰岛素
人生长激素 干扰素 白细胞介素2 粒细胞集落刺激因子 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 红细胞生成素 EPO 组织纤溶酶原激活剂 生长激素 促生长素 抗血友病因子Ⅷ 脱氧核糖核酸酶 葡糖脑苷脂酶 鼠单克隆抗体
酶，简称限制酶或切割酶。
根据酶的功能、大小和反应条件，及切割ＤＮＡ
的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ 型酶、 Ⅲ型酶
限制酶（Ⅱ型）
特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列 的DNA片断
理论上的可行性。
科技探索之路：
基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律
科技探索之路：
基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
摩尔根证明基因在染色体上， 并提出基因的连锁互换定律。
科技探索之路：
基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
外源基因表达
利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基 因转录成mRNA，进而翻译成肽链或加工成活
性蛋白质的过程。
学习要求
掌握：基因表达的基本原理，外源基
因表达的基本过程。
熟悉：外源基因表达的基本类型，外 源基因表达载体的基本组成与功能。 了解：外源基因表达在生产基因工程 药物中的应用。
（一）外源基因表达（基因工程）的概念 指在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪 切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重 新组合，然后导入受体（宿主）细胞内使之持 续稳定繁殖，目的基因扩增、表达，获得人类 所需的产品的工程。 基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。
（5）筛选：重组体在受体细胞中复制和遗传；对转化
子筛选和鉴定；
（6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培
养，获得所需的遗传性状或表达出所需要
的产物。
基因工程的重大意义
1) 重组DNA技术填平了生物种属间不可逾越
的鸿沟。 跨越天然物种屏障，将原核和真核生物、 植物和动物，造福人类，在过去人们难以置 信的事情，现在已成为现实。
又称为基因克隆（gene cloning）或分子克隆（molecular cloning）。 克隆（ cloning ）：指无性繁殖系，即由一个细胞经过 无性繁殖后所形成的子代群体。
外源基因表达基本类型
根据宿主细胞不同：原核细胞表达系统；真核 细胞表达系统。
根据表达产物在宿主细胞生成的部位不同：胞 内表达、定位表达、分泌表达。 根据表达产物的溶解状况不同：可溶性表达、 包涵体表达。 根据表达产物的结构状况不同：非融合表达； 融合表达。
分
目的基因 基因载体
切 接
重组体
总 体 技 术 路 线
转 筛 表
外源基因表达（基因工程）的基本过程：
（1）分离：提取和获得目的基因和载体DNA； （2）切割：分别对目的基因和载体DNA酶切； （3）连接：用DNA连接酶连接目的基因与载体，形成 新的重组DNA分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体（宿主）细胞；
艾弗里证明DNA是主要遗传物质，DNA可 从一种生物个体转移到另一种生物个体。
科技探索之路：
基础理论和技术发展催生了基因工程
早 期 基 础 理 论
沃森、克里克提出DNA的双螺旋结构模型。
科技探索之路：
基础理论和技术发展催生了基因工程
பைடு நூலகம்
早 期 基 础 理 论
梅塞尔松、斯塔尔证明DNA的半保留复制
科技探索之路：
一把特殊的剪刀
—限制性内切酶的发现
阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯 (Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease, RE)
是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特
定碱基序列、并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切
本章节的地位：
现代科技革命
高新技术
生物技术
（生物工程）
基因工程 基因克隆
分子遗传学理论上的六大进展解决了
生命现象的遗传物质基础（均是核酸） 结构模型（同类构件、双螺旋） 复制方式（相似的机制） 遗传信息流动方向（共同的中心法则） 遗传密码（共用一套相同的密码） 表达和调控的机理（类同的方法） 基因突变机理、意义（变异与进化） 为基因工程技术的诞生典定了理论基础。
基因工程的产物：
多彩小鱼
转基因小鼠
蓝色玫瑰
辣椒香蕉
转基因小猪
黑籽番茄
思考：基因的表达与基因的什么过程有关？
DNA(基因) 转录 mRNA 翻译 蛋白质(性状)
密码子在生物界是 通用 的！
基因表达
指基因通过转录和翻译而产生其蛋白产物，或
转录后直接产生其RNA产物的过程。
（2）利用重组DNA技术可以在体外大 量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究 其结构、功能及调控机制，从而拓宽了 分子生物学的研究领域。
（3）医学上应用更为广泛，涉及各领域 正常人类生命活动的分子机制； 人类各种疾病发生的分子机理； 人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、 心血管疾病、传染病等病因的 查明、诊断、 治疗和预防。 药物的研发和生产； 疾病模型的建立； 人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）
首当其冲的是要解决： ① 如何自如地得到目的基因； ② 如何在体外改造基因，得到重 组体； ③ 在体外转移重组基因； 直到20世纪70年代中期，相继出现了 几项关键性技术，梦想成真。
基因操作的工具
基因的 剪刀 基因的 针线
基因的运 输工具
限制性核酸内切 酶
DNA
连接酶
运载体 （如质粒、 噬菌体和动 植物病毒等）