质粒提取
提取质粒的主要步骤原理
提取质粒的主要步骤原理提取质粒是一种分离和纯化质粒DNA的常见实验技术。
质粒是细菌细胞内环状的DNA分子，通常用于基因克隆、转化、表达和基因组编辑等研究。
下面将详细介绍质粒提取的主要步骤原理。
1. 细菌培养：首先，选择含有目标质粒的细菌菌株进行培养。
通常使用大肠杆菌等常用实验菌株。
将细菌接种到含有适当营养物质（如LB培养基）的培养物中，并在适当条件下培养，如37摄氏度、220 rpm振荡培养。
2. 收获细菌：将培养至适当生长期的细菌用离心机离心，收集菌体沉淀。
通常使用1500×g离心10分钟，得到一个细菌菌体的沉淀。
3. 质粒裂解：利用物理或化学方法将细菌菌体裂解，释放内部的质粒DNA。
物理方法包括超声波处理和冻融法，而化学方法则涉及使用碱性裂解液（如SDS 和NaOH）。
该步骤破坏了细胞壁和细胞膜，以及核酸酶等酶的活性。
4. 蛋白质沉淀：为了去除细菌染色体DNA和蛋白质，可通过蛋白质沉淀步骤使质粒DNA纯化。
一种常用的方法是加入混合溶液，其中包含非离子性洗涤剂（如SDS）和蛋白酶K。
SDS具有溶解细菌膜和蛋白质的作用，而蛋白酶K能够降解杂质蛋白质。
该反应可以在高温条件下进行，如50-60摄氏度，以增加SDS和蛋白酶K的活性。
5. DNA沉淀：通过加入盐和酒精，可以使DNA溶液中的质粒DNA沉淀。
正常情况下，添加等体积的冷异丙醇，再加入适量的盐溶液。
因为质粒DNA在冷异丙醇和高盐浓度下更容易沉淀。
经过离心，沉淀的DNA可被分离出来。
6. 洗涤和溶解：将DNA沉淀洗涤一两次，以去除盐和其他杂质。
通常使用70%乙醇洗涤，再次离心以分离DNA沉淀，然后去除液体，使其干燥。
最后，用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解质粒DNA，以得到高纯度的DNA溶液。
以上步骤提取质粒的主要原理如下：在收获细菌步骤中，细菌通过离心过程被分离出来，得到菌体沉淀。
在质粒裂解步骤中，通过物理或化学方法破坏细胞结构，释放质粒DNA。
质粒提纯的原理
质粒提纯的原理质粒是一种由DNA分子组成的环状双链结构，常见于细菌细胞中。
质粒提纯是指从细菌细胞中分离纯净的质粒DNA，并去除其他细菌细胞成分和杂质的过程。
质粒提纯的原理主要包括质粒提取、细胞裂解、DNA溶解、去除杂质、DNA沉淀、洗涤和干燥等步骤。
1. 质粒提取：质粒提取是通过裂解细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
常见的方法有碱裂解法、酶裂解法和热裂解法。
其中，碱裂解法是最常用的一种方法。
在碱裂解法中，首先将含有质粒的细菌培养物经离心分离得到菌体沉淀，然后用碱溶解菌体，使细胞壁和细胞膜破裂，释放质粒DNA。
2. 细胞裂解：细胞裂解是指将细菌细胞壁和细胞膜破裂，释放细胞内的质粒DNA。
细胞裂解的方法包括机械破碎、超声波裂解和酶裂解等。
机械破碎法是将经离心得到的菌体沉淀在低温下用椎管等器械进行破碎，使菌体破裂，释放DNA。
超声波裂解法则是利用超声波的高频振动实现细胞破碎，释放DNA。
酶裂解法则通过添加蛋白酶、脱氧核酸酶等酶，使细胞壁和细胞膜被酶降解，释放DNA。
3. DNA溶解：DNA溶解是指将裂解的细胞中的DNA从其他细胞成分中分离出来。
一般来说，DNA可以通过溶于乙醇或异丙醇的方式沉淀下来，然后经过离心分离得到。
此步骤的目的是将DNA和其他细菌细胞成分如蛋白质、RNA等分离。
4. 去除杂质：在DNA溶解的过程中会有一些杂质如蛋白质、RNA等混入溶液中。
为了获得纯净的质粒DNA，需要去除这些杂质。
一般可以通过加入酶解剂如RNase A或蛋白酶K进行酶解，使RNA或蛋白质被降解。
然后通过盐酸/乙醚等混合液体沉淀蛋白质，或者通过乙醇沉淀RNA等方式去除杂质。
5. DNA沉淀：通过加入适量的盐和乙醇，使DNA与DNA溶液中碱性pH值条件下的盐结合形成DNA盐沉淀，同时DNA与乙醇结合形成DNA乙醇沉淀。
此过程中DNA成为不溶性盐和DNA乙醇复合物，通过离心分离沉淀下来。
沉淀条件可以根据实验需要进行调整，如调节盐和乙醇的浓度、温度等。
质粒提取方法详解
第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,缍钥股氐目剐缘取质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed cont rol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%.第二节利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质-粒-提-取-原理及步骤
质-粒-提-取-原理及步骤概述质粒提取，又称DNA提取，是一种分离和提取所需DNA的过程。
质粒提取在许多实验中都是非常重要的步骤，例如基因工程、分子生物学、遗传学和其他DNA相关实验。
本文将介绍质粒提取的原理及步骤。
原理DNA提取的过程通常包括细胞破碎、DNA纯化、DNA溶解和复性等步骤。
对于质粒提取，主要步骤通常包括以下内容：1.细菌培养：在质粒提取之前，需要将细菌培养在含有适当抗生素的培养基中，用于扩增质粒数量。
2.细胞破碎：使细胞破裂以释放出含有质粒的细胞内物质，此步骤需要进行严格的抗污染措施，以避免污染质粒样本。
3.除去污染物：除去细胞壁、蛋白质、核酸和其他污染物。
4.离心分离：将上述步骤中提取出的样本进行离心分离，使DNA沉淀，以便进一步纯化。
5.溶解：通过加入一定的缓冲液或去离子水，使DNA重新溶解。
步骤以下是一种常见的质粒提取步骤：1.处理样本：将含有所需质粒的细胞收集，并进行初始处理，包括细胞壁破裂、核酸纤维溶解等。
2.傅里叶纯化：通过傅里叶变换纯化，将细胞内杂质和有机污染物清除。
3.离心分离：将细胞样本离心，使DNA沉淀到底部，并且将上层样本移除。
4.乙醇沉淀：加入乙醇沉淀，将DNA纯化到上清液。
5.重振溶解：最后使用适当缓冲液重振重振溶解DNA，也可以使用去离子水重振。
以上就是质粒提取的原理和步骤，这是一个非常重要的操作，在DNA研究和实验中有着广泛的应用。
我们需要注意的是，在操作过程中需要进行高标准的质量控制，以确保实验结果的准确性。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
提取质粒的方法
提取质粒的方法提取质粒是分子生物学实验中的常见步骤之一，其目的是将细菌中的质粒分离出来，以进行后续的实验操作。
提取质粒有多种方法，本文将介绍其中的几种常用方法及其优缺点。
一、CACl2热激转化法CACl2热激转化法是经典的提取质粒方法之一。
其过程如下：1. 将含有目的质粒的细菌培养物进行扩增，使细菌数达到一定程度。
2. 离心将细菌沉淀下来，将培养液中的菌落去除。
3. 用无菌水洗涤细菌沉淀，用CACl2溶液缓慢重悬细菌，使CACl2浓度达到0.1M。
4. 加入pH 6.5的冷缓冲液，浸泡在冰上15分钟。
5. 在热水浴中40-45℃，热激转化。
6. 加入含有抗生素的琼脂糖平板上进行筛选。
该方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，且质粒提取量较大。
但其缺点也显而易见，即有毒化学物质CACl2使用，对质粒构建的影响较大，在序列克隆等需要高质量的质粒时不适用。
二、碱裂解法碱裂解法是一种有效的质粒提取方法，是利用质粒DNA与蛋白质的不同耐碱性，将质粒分离出来的方法。
其操作流程如下：1. 将细菌沉淀用含50mM Tris-HCl（pH 8.0）的盐水洗涤。
2. 加入含50mM Tris-HCl（pH 8.0）、25mM EDTA和1%SDS的Lysis Buffer（血浆蛋白）溶液，充分振荡混合，放在65℃水浴中加热，使细胞破裂并释放DNA和蛋白质。
3. 加入冷异丙醇，低温离心，使DNA和蛋白质分开。
注意此步骤中异丙醇的体积比例对DNA的提取量有较大影响，需根据实验需要酌情设置。
4. 倒出上清液，将沉淀用50%异丙醇洗涤。
5. 将洗涤后的沉淀用无菌水重悬，进行后续实验操作。
碱裂解法优点较多，其操作简单、快捷，可以得到较纯的质粒DNA，适用于后续实验需要高质量的DNA。
三、亲水性亲油性法亲水性亲油性法又称酚-氯仿法，其原理是利用亲油性有机溶剂和亲水性酚盐在酚-氯仿-异丙醇三相体系中分离质粒和其它细胞成分。
其操作流程如下：1. 培养含有质粒的细菌，并进行扩增。
三种提取质粒的方法及原理
三种提取质粒的方法及原理《三种提取质粒的方法及原理》一、离心法离心法是最常用的一种提取质粒的方法，它通过离心力的作用，使细胞或质粒（例如DNA、RNA等）从悬浮液中分离出来，从而得到提取的质粒。
分离过程如下：1.从对象（例如细胞）上提取纯化的质粒，使其形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量离心机中，加入适当的离心剂，并配置合适的离心条件（如离心速度，离心时间）。
3.根据离心力，细胞及其他悬浮液的组分会在离心机的内壁及底部形成层，质粒则聚集在中心处，形成离心质粒。
4.把离心质粒从中心处取出，即可得到纯化的质粒。
二、丙酮离心法丙酮离心法是一种以丙酮、乙醇和水作为分离剂的提取质粒方法，它可用于提取活性质粒，如抗体、RNA和DNA等，这是因为丙酮和乙醇可以良好地维持质粒的活性，并可以使悬浮液以柱状分离，有利于质粒的提取。
丙酮离心法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如200 ml丙酮），形成悬浮液。
2.将悬浮液置于微量离心机中，并配置合适的离心条件。
3.由于丙酮和乙醇的作用，悬浮液以柱状分离，并形成梁状质粒在柱峰中。
4.把梁状质粒从柱峰中取出，即可得到纯化的质粒。
三、超滤法超滤法是一种用于提取质粒的物理分离方法，它通过扩散作用及滤膜孔径的大小，可以有效地将非蛋白质物质等从悬浮液中分离出来，而不改变其本身的结构和性质。
超滤法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如水），形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量超滤器中，并配置合适的超滤条件（如超滤压力、超滤温度）。
3.根据超滤的原理，液体及其他悬浮物质会被超滤滤膜过滤，而质粒则不会被过滤，从而被滤过的液体中提取出质粒。
4.把质粒从超滤液中取出，即可得到纯化的质粒。
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pcDNA3.0-X
质粒提取
• 原理 (碱裂解法) 溶菌，释放DNA 1. 溶菌酶 2. 碱裂解： SDS, NaOH pH 12.0-12.5 蛋白质、DNA变性 3. 中和： pH 4.8 醋酸钠 中和、质粒DNA复性
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差 异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开 而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补 链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至 中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确， 而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们 缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物 等一起沉淀下来而被除去。
质粒提取
• 步骤 • 注意事项
1. 菌浓度，OD值 2. P1充分重悬菌体沉淀 3. P2裂菌时间不超过5min，动作温和。 4. 洗涤后充分离心
限制性内切酶酶切
限制性内切酶：
来源于细菌限制体系， 识别特定的DNA序列， 同工酶、同尾酶 产生平末端或粘末端 活性与离子浓度、最适温度有关 酶活性单位是指在50μ l 的反应体系里，采用随酶提 供的 NE Buffer，用1个小时的时间，彻底消化1μ g 底物DNA所需要的酶量。
2.
3.
蓝白斑筛选
α互补现象 Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个 氨基酸）。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互 补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。Lac Z′基因编码的α肽链与失去 了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。β半乳糖苷酶， 能将无色的化合物X-gal （5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深蓝 色的底物5-溴-4-靛蓝。携带着lac Z′基因的质粒载体转化了β半乳糖苷酶突变的大 肠杆菌细胞后，在IPTG（异丙基硫代β-D-半乳糖苷）诱导后表达β半乳糖苷酶， 在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lac Z′中的多克隆位点后导致失活后产生的克隆往往是白色菌落。
琼脂糖凝胶电泳
•试剂
1、 5×TBE（5倍体积的TBE贮存液）
配1000ml 5×TBE： Tris 硼酸 0.5mol/l EDTA 54g 27.5g 20ml（pH 8.0）
2、 凝胶加样缓冲液（6×） 溴酚蓝 蔗糖 3、 4、 琼脂糖 溴化乙锭溶液（EB） 0.5μg/ml 0.25% 40%
2µl 6µ l 1µl 1µl 12-16℃ 过夜
核酸的体外连接
•注意事项
1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量， 一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连 接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻 保存将会降低转化效率。 4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适 反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端 则以15-20℃为好。 5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源 DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载 体连接的机会。
琼脂糖凝胶电泳
•注意事项
合适的凝胶浓度 正确的电泳方向
胶回收
•步骤
1.切胶,称重 2.溶胶
3.过柱
4.洗涤 5.洗脱
•注意事项
核酸的体外连接
• 原理
T4噬菌体DNA连接酶：粘性末端的DNA分子连接 平末端的双链DNA分子连接
• 连接体系：
线性化载体 片断 10ligase buffer T4 ligase
XX cDNA
PCR A 连接 转化 提质粒 pMD18-T-X A T
PMD18-T
T
T4 DNA Ligase
pcDNA3.0
BamHI EcoRI
酶切
BamHI EcoRI
酶切
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 5~60 1~20 0.8~10 0.5~7 0.4~6 0.2~4 0.1~3
•步骤
（一） 制备琼脂糖凝胶 称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml 0.5×TBE缓冲液， 置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液， 按100ml的凝胶加5μ l的EB。 （二）胶板的制备 1.将有机玻璃槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
质粒提取 限制性内切酶酶切
琼脂糖凝胶电泳 胶回收
核酸的体外连接
XX cDNA
PCR A 连接 转化 提质粒 pMD18-T-X A T
PMD18-T
T
T4 DNA Ligase
pcDNA3.0
XhoI EcoRI
酶切
XhoI EcoRI
酶切
电泳 胶回收
电泳 胶回收连接 转化来自提质粒T4 DNA Ligase
大肠杆菌感受态制备 转化实验
大肠杆菌感受态制备
• 原理
限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶 的突变体(Rˉ,Mˉ) 可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给 后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化 学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允 许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的 量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μ l 的 感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞 体积的5％。 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器 皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌, 且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率 或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
酶切体系：
15µl体系中
质粒
5-8µl
10 buffer
E1 E2 ddH2O：
1.5 µ l
0.25 µ l 0.25 µl 5-8 µl
37℃，2-4h
琼脂糖凝胶电泳
• 原理 1. DNA、 RNA的多核苷酸链中的磷酸基团 呈离子化状态，带负电. 磷酸戊糖重复性 决定了迁移速率取决于分子的大小和构型. 2.不同浓度的琼脂糖凝胶介质分离分子量 大小不同的DNA片断 3. EB显色 !!!
1 冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮ Ａ （ 体 积 ∞ 1 0 μl, Ｄ Ｎ Ａ ∞ 5 0 ng）， 轻 轻 旋 转 以 混 匀 内 容 物 ， 在 冰 中 放 置 3 0 分 钟 。 2. 将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 1 1 快 速 将 管 转 移 到 冰 浴 中 ， 使 细 胞 冷 却 １ － ２ 分 钟 。 3. 每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃ 摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转 化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转速不超过225转/分）。 4 将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相 应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl〉。可再加肉汤培养基，用一无 菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感 受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记， 全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗 性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的增加与 平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长掏 物 质 的 缘 故 。 1 4 〉 将 平 板 置 于 室 温 直 至 液 体 被 吸 收 。 15〉倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺 增板时密度较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄 青霉素抗性的转化可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这 样，铺平板时密度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培 养基中不用氨苄青霉素而改用羧苄青霉素，以及将抗生素浓度从60μg/ml增至100μg/ml，可使情 况有所改善，但不能彻底根除之。
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
2. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均 匀的胶面（注意不要形成气泡）。 3.待胶凝固后，加入电泳缓冲液至电泳槽中。 4.取出梳子。 （三）加样 （四）电泳 DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1~2cm处，停止电泳。
3 、 4 2 ℃ 水 浴 中 热 休 克 90 秒 , 热 休 克 后 迅 速 置 于 冰 上 冷 却 2 分 钟 。 4、向管中加入600 μ l LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢 复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。