质粒DNA的提取与PCR
带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电
场强度下, DNA分子的迁移速度取决于分子筛 效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动 速度不一样,可进行分离.凝胶电泳不仅可分离 不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质
பைடு நூலகம்
量相同,但构型不同的DNA分子。
• 在细菌的细胞内，质粒以超螺旋形式（cccDNA）
700ul）于一新的Eppendorf管.加入等体积
异丙醇,混匀后放置5分钟,12000rpm离心10
分钟,弃去上清.
(6)用无水乙醇清洗一次,离心管倒置在吸水
纸上2min,自然干燥. (7)加入20ul TE 溶液溶解提取物,充分溶解. (8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.
五、电泳检测试验结果
六、结果分析
粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生 素耐药性等。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本
步骤：培养细菌扩增质粒；收集和裂解细菌；
分离和纯化质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高
pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂， 将质粒DNA释放到上清液中。碱性溶剂使碱基 配对完全被破坏，闭环质粒DNA双链由于处于 拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
4.灭菌水
5.0.2ul Eppendorf 管
四.试验步骤:
（一）PCR体系： PCR Mix 10ul H2O 9 ul 引物1 0.5ul 引物2 0.5ul 质粒模版 0.5ul
(二) PCR循环条件 94℃ 3 min 94℃ 30 s 60 ℃ 30 s 30 cycle 72 ℃ 1 min 72 ℃ 7 min 4℃ forever 电泳检测实验结果
存在。在提取质粒的过程中，还有另外两种存
在形式：线性（linear DNA）和松弛型
(ocDNA)。
三. 试剂:
◆溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖 25mmol/L Tris．Cl(pH8.0) 10mmol/LEDTA(pH8.0)
◆溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释） 1%SDS
(DNA)分子。现在专指细菌、酵母菌和放
线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在
基因工程中质粒常被用做基因的载体。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，绝大多数的细菌质粒都是 闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。相对分子质量一般约为细菌染色 体的0.5%-3%, 在1Kb-200Kb之间。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质
当pH值恢复到中性时，重新形成完全天然
地超螺旋结构。在裂解过程中，细菌蛋白质、
破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕
成大型复合物，与PDS一起沉淀。离心除去变
性剂，从上清液中回收复性的质粒DNA。
3. 质粒DNA的琼脂糖凝胶检测
DNA分子在琼脂糖凝胶中时有电荷效应和
分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中
实验三、四 质粒DNA的提取与PCR
2 0 12. 1 0
实验三、质粒的提取与电泳检测
一、实验目的：
1.学习利用碱变性方法提取细菌中的质粒 DNA。 2.掌握利用琼脂糖凝胶电泳方法检测质粒 DNA
• 二、实验原理：
质粒是染色体外能够进行自主复制
的遗传单位，包括真核生物的细胞器和
细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸
思考题:
1. 电泳结果出现几个条带?各是什么?
2. 为什么这一方法被称为碱变性法？溶液 1,2,3在其中各起到什么作用？
实验四、PCR扩增目的基因
实验目的：
1.学习PCR实验操作与原理 2.掌握PCR扩增基因电泳检测方法
二. PCR实验原理
三. 试剂:
1.Taq酶：Mix
2.引物1,2
3.模版：质粒DNA
300ul溶液Ｉ,充分吹打混匀后,室温放置5分钟. (3)加入300ul新配置的溶液Ⅱ（100ul NaOH +100ul
SDS,用蒸馏水稀释至10ml）,轻柔颠倒5-10次,零下 20度放置5分钟.
(4)加入300ul溶液Ⅲ,颠倒5-10次,放置5分钟.
(5)12000rpm离心15分钟,取上清液（不大于
◆溶液Ⅲ
5mol/Ｌ乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml
◆异丙醇
◆无水乙醇
四.试验步骤:
(1)培养细菌:大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5ml 中,37度振荡培养8-16小时. (2)取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离
心3分钟,去掉上清液，重复收集一次。加入
大肠杆菌质粒DNA的提取
一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1％SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
有时不同溶菌酶也能溶菌。
质粒dna的提取
质粒DNA的提取1. 引言质粒DNA提取是在分子生物学研究中常用的实验操作之一。
质粒是一类圆环状的DNA分子，存在于原核生物中。
质粒DNA提取的目的是为了获取纯度高的DNA样品，以便进行后续的实验操作，如聚合酶链式反应（PCR）、限制性酶切、测序等。
2. 实验材料在进行质粒DNA提取实验前，需要准备以下实验材料：•细菌培养液：含有所需质粒的培养液。
•碱裂解液：用于裂解细胞并释放质粒DNA的实验液。
•高盐含量的溶液：用于提取DNA。
•蛋白酶K：用于消化蛋白质。
•硅胶粉末：用于吸附DNA。
•乙醇：用于沉淀DNA。
•TE缓冲液：用于溶解和储存提取的质粒DNA。
3. 实验步骤3.1 细菌培养与收获首先，需进行细菌培养和收获，以获取含有所需质粒的培养液。
培养液中的细菌应为含有目标质粒的菌株，如大肠杆菌。
3.2 细胞破碎与质粒DNA释放将收获的细菌培养液进行离心，去除培养液并沉淀细胞。
然后将细胞重悬于碱裂解液中，用震荡器在适当的温度和时间条件下裂解细胞，释放质粒DNA。
3.3 蛋白质消化为了去除细胞中的蛋白质，加入适量的蛋白酶K，进行蛋白消化。
消化的时间和温度应根据实验要求进行调整。
蛋白消化完成后，通过离心将蛋白质沉淀分离。
3.4 DNA提取将消化液中的DNA溶液转移到其它离心管中，并加入高盐含量的溶液。
通过离心将DNA与其他杂质分离。
此步骤中，DNA会被溶液中的硅胶粉末吸附，以去除杂质。
3.5 DNA沉淀将去除杂质的DNA溶液转移到新的离心管中，加入冰冷的乙醇。
通过离心，将沉淀的DNA分离出来。
注意，在沉淀过程中，应避免DNA的过度离心，以免损坏DNA分子。
3.6 DNA溶解和储存将DNA沉淀后，溶解在适量的TE缓冲液中。
TE缓冲液具有适当的pH值和离子浓度，能够稳定DNA分子，并提供良好的保存条件。
4. 实验注意事项在质粒DNA提取实验中，需要注意以下几点：•操作过程应严格遵守无菌操作，避免外源性DNA的污染。
实验一、质粒DNA的提取及检测实验报告
实验一、质粒DNA的提取及检测【实验目的】1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术3、学会PCR操作的基本技术第一部分质粒DNA的提取一、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于～这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、仪器与试剂1、仪器恒温摇床、台式离心机2、试剂溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿三、实验步骤1、将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
2、取培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。
3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
4、将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。
5、加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。
6、加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。
冰上放置15min。
7、12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。
8、向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，将上清转移到另一离心管中。
9、向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。
12000r/min，离心5min。
质粒DNA的提取定量PCR鉴定
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定量PCR：使用定量PCR仪进行定量PCR反应，获取质粒DN的拷贝数
提取质粒DN：使用碱裂解法或柱层析法等方法提取质粒DN
数据分析：使用定量PCR软件分析定量PCR结果，获取质粒DN的拷贝数
结果验证：使用电泳法或荧光定量PCR等方法验证定量结果
定量注意事项
确保样品的纯度和完整性
PCR反应需要四种主要成分：模板DN、引物、DN聚合酶和dNTP
PCR反应可以快速复制特定的DN片段，用于基因克隆、突变检测、基因表达分析等领域
PCR反应体系
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模板DN：提供待扩增的DN序列
DN聚合酶：催化DN复制
Mg2+：稳定DN聚合酶活性
酶抑制剂：防止非特异性扩增
电泳试剂：用于电泳分析的试剂，如溴化乙锭、琼脂糖等
荧光定量PCR仪：用于定量PCR分析的仪器
实验步骤和实验操作
质粒DN提取：选择合适的菌株，培养至对数生长期，然后进行质粒DN的提取。
PCR鉴定：设计特异性引物，进行PCR反应，然后进行电泳分析。
实验操作：按照实验步骤进行实验操作，注意操作规范和实验安全。
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因功能研究
PCR鉴定：用于基因突变、基因表达和基因功能研究
质粒DN提取和PCR鉴定：用于药物开发和生物制药
在基因工程中的应用
质粒DN提取：用于基因克隆、基因表达和基因编辑等实验
PCR鉴定：用于检测基因突变、基因表达和基因拷贝数等实验
基因工程：通过改变生物的基因来改变其性状，如抗病、抗虫、抗除草剂等
质粒DNA的提取和PCR技术
3。琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时 如果能看到三条带，这三条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
操作步骤注意事项： 操作步骤注意事项
1。配置反应体系。 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 1ul 4种dNTP混合物 200umol/L 引物 各1～10pmol 模板DNA 10～200ng Taq DNA聚合酶 0.25u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 10ul 2。 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 50℃ 1分钟， 72℃ 1.5分钟， 共30轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 电泳结束，观察
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳 性的产生。
吸样枪:吸样枪污染值得注意.由于操作时不慎将样品或模板核酸 吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源。吸头、小离心管应 一次性使用 。 开关盖时注意不要接触到内壁，并且不要开盖时间太长，以免 污染。 2。预混和分装PCR试剂:PCR反应液应预先 配制好，然后小量 分装。节省时间并保证各管成分平行 。最好在加样时都在冰上 低温进行，以防止加入酶后反应立即开始。 3。阳性对照与阴性对照的设立。-重要！ 阳性对照与阴性对照的设立。 重要！ 阳性对照与阴性对照的设立 重要 有利于问题的解决， 有利于问题的解决，对于优化条件以及排除污染可能性都很有 用！
质粒的提取及酶切实验报告
质粒的提取及酶切实验报告
一、实验目标
本实验旨在提取低分子量DNA、质粒，通过酶切实验检测质粒DNA片段长度，并处理实验结果。
二、实验原理
1、质粒DNA提取：使用特定的提取试剂，先提取溶菌酶凝胶中的质粒DNA；
2、质粒DNA酶切：采用酶切的方法，对质粒DNA进行切割，形成小片段；
3、质粒DNA测序：采用测序仪对质粒DNA片段进行测序，从而确定其长度。
三、实验材料
1、提取试剂：主要由蛋白酶、乙腈、缓冲液、EDTA等混合而成；
2、PCR反应液：主要由dNTP、聚合酶、反应缓冲液等组成；
3、酶：主要由DNA内切酶和DNA外切酶组成；
4、测序仪：用于测序质粒DNA的片段长度；
四、实验步骤
1、提取质粒DNA：将实验样品放入提取试剂中，加热30分钟，然后用混合物洗涤一次，最后离心得到清澈的液体，含有提取的质粒DNA；
2、进行PCR反应：将提取的质粒DNA作为反应液™添加到PCR管中，在适当温度下反应10分钟；
3、酶切：将PCR管中的反应液加入内切酶和外切酶中，在规定温度下酶切1小时；
4、离心质粒DNA片段：将酶切后的反应液离心，以得到质粒DNA片段；
5、进行测序：将质粒DNA片段放置于测序仪中，逐一测序后得到结果；
五、实验结果及分析
实验结果：
质粒DNA片段长度：
0.31kbp、0.48kbp、0.51kbp、0.58kbp、0.68kbp等。
遗传学 实验四 质粒DNA的提取与鉴定
实验四质粒DNA的提取与鉴定一、实验目的1、熟悉细菌的培养和质粒的扩增。
2、学习和掌握从大肠杆菌中提取质粒DNA的原理和方法以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA的技术。
二、实验原理质粒广泛存在与原核细胞中，大多是双联的共价闭合环状DNA分子，长度可以从1kb 到200kb不等，是染色体外寄生性的自主复制子，在细胞分裂时能恒定地传递给子代细胞。
在分子生物学研究中，为了迅速扩增和提取大量的质粒DNA，通常使用松弛型（其复制受宿主的控制不严格，在宿主细胞中拷贝数较多）质粒。
从大肠杆菌中分离质粒的方法很多，常见的有煮沸法和碱变性抽提法。
碱变性抽提法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复兴差异而达到分离的目的。
在pH高达12.5的条件下，染色体DNA的氢键断裂、双螺旋解开而变性；质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链未完全分离，当用pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节pH至中性时，变形的质粒DNA又恢复到原来的构型，通过离心保留在溶液中，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的网状结构，与不稳定的大分子RNA、蛋白质等一起沉淀出来。
在抽屉过程中，由于各种因素的影响，同一质粒DNA可能呈现以下不同的构型：①超螺旋型，即共价闭合环状DNA（cccDNA）；②一条链发生一处或多处断裂，致使另一条链发生自由旋转，分子内的扭曲折叠消失，形成松弛的分子即开环DNA（ocDNA）；③两条链都发生了随机的断裂成为线状DNA。
在这三种构型中，cccDNA由于扭曲折叠，体积很小，在具有分子筛效应的琼脂糖凝胶电泳中受到阻力最小，迁移速度最快；ocDNA因扭曲状态被破坏而呈松弛的环状，迁移速度较慢；线状DNA受到的阻力最大，迁移速度最慢。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，除受分子构型的影响，还受所带净电荷多少的影响。
因此在鉴定质粒DNA纯度时，应尽量减少电荷效应。
增大凝胶浓度可以在一定程度上降低电荷效应，分子的迁移速度主要取决于受凝胶阻滞程度的差异，由此将不同构型的质粒DNA 分开。
质粒DNA的提取和PCR技术
试剂准备 ：
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖 平衡渗透压，调节PH值，有利悬浮。 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 调节PH值 10mM EDTA(pH 8.0）鏊和离子 抑制DNase活性 高压灭菌15min ，贮存于4℃ 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS 裂解细菌，变性线性DNA 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）3M，pH 4.8 中和PH值，并与SDS
溶液二中NaOH不要暴露在空气中太久。可能会与空气中的CO2 与 NaOH作用,减弱了条
带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间 体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起），注意碱法抽提 得到质粒样品中应不含线性DNA ，另外如果发现运动得较慢的 带，可能是由于操作不慎污染的大肠杆菌基因组DNA的片断。
反应参数要素： 反应参数要素
1。PCR反应五要素
（1）Taq酶：酶量：催化一典型的PCR反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特 异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。保真性： rTaq-1~2kbp,LaTaq-~20kbp,Pfu（Pyrobest）-. 吸取时注意，保存在甘油中故比较粘稠。 （2）dNTP的质量与浓度 ：在PCR反应中，一般反应 中每种dNTP的终浓度为20-200µmol/L 。4种dNTP的 浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同 于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。 （3）模板；模板可以是DNA片断，基因组，质粒， 噬菌体，菌液等任何含DNA生物样品。可以是单链分 子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状 分子 一般反应中的模板数量为102 -105 拷贝。模板纯 化程度影响扩增效率。
注意问题：
1。防止核酸污染：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告引言DNA的提取是生物学实验中非常重要的一步，它可以用于后续的分子生物学研究，比如克隆、PCR、基因测序等。
而本次实验的目的是从细菌中提取质粒DNA，并对提取的结果进行分析，评估提取效果。
材料与方法1. 实验材料- 大肠杆菌菌液- 细胞裂解液- RNase A- 莱文斯坦缓冲液- 高盐裂解液- 乙酰盐- 氯仿- 异丙醇- TE液- 离心管等实验仪器和耗材。
2. 实验步骤- 调制莱文斯坦缓冲液，用于细胞裂解和质粒DNA的稳定。
- 预处理大肠杆菌菌液，用高盐裂解液处理使其细胞壁破裂，释放出质粒DNA。
- 添加异丙醇与氯仿，用于分离DNA和其他细胞组分。
- 加入乙酸盐处理DNA上的蛋白质，使其沉淀。
- 用异丙醇洗涤DNA沉淀，去除杂质。
- 用TE液溶解提取得到的DNA。
结果与讨论经实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了质粒DNA。
通过紫外光照射，我们观察到了明亮的DNA带，证明提取得到的DNA具有较高的纯度。
另外，我们还使用琼脂糖凝胶电泳对提取的DNA进行了分析。
从琼脂糖凝胶电泳的结果中，我们观察到细长而连续的DNA 条带，说明提取得到的质粒DNA具有较好的完整性。
此外，我们还注意到，在琼脂糖凝胶中，质粒DNA的迁移速率要快于细菌染色体DNA，这是因为质粒DNA的分子量较小。
在实验的过程中，我们注意到了一些实验技巧和注意事项。
首先，在进行细胞裂解和DNA提取过程中，必须保持材料的无菌状态，以免外源性DNA的污染。
其次，避免在提取过程中显著提高DNA样本的温度，以防止DNA的降解。
最后，注意避免DNA溶液与金属物质接触，因为金属离子可能对DNA具有毒性。
结论通过本次实验，我们成功地从大肠杆菌中提取到了高质量的质粒DNA，并在琼脂糖凝胶上观察到清晰的DNA带。
实验过程中，我们掌握了DNA提取的基本操作技巧和注意事项，这对我们今后的分子生物学研究将产生积极的影响。
然而，本次实验还有一些改进的空间。
质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定
1. 菌液煮沸10min 2、取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各
四、结果分析
1、用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定; 2、加5uLPCR产物进行电泳; 3、预期PCR产物大小约400~500bp;
五、实验原理
* 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得了 1993年的诺贝尔化学奖。
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应， 是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复 制DNA的过程。
保存：-20 ℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
Taq酶
72℃
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
(%)
100
酶 80
活 性
60
40
20
40 50 60 70 80 90
温度(℃)
（四）dNTP
• dNTP浓度取决于扩增片段的长度 • 四种dNTP浓度应相等 • 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产 量 • dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA 聚合酶的活性。
变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。 变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响 Taq DNA 聚 合酶的活性， 变性温度90-95 ℃为宜。
质粒DNA的提取、定量、 与PCR鉴定