检测猪圆环病毒2型DNA的套式PCR方法的建立及应用
猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立
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第 ２ 卷 ４期 １
中 国 病 毒 学
ＶⅡ ｏＬｏＧＩ ＣＡ ＤｎＣＡ Ｓ
２ （ ：３ －７ １ ４） ７１３ ４
Ｊ ｌ ２ ０ ｕｙ ０６
２０ ０ ６年 ７月
猪 圆环病毒 ２型 Ｔ ｑ ｎ实时 Ｐ Ｒ检测方法 的建立 ａＭａ Ｃ
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DNA病原—圆环病毒2型PCR检测方法
猪圆环病毒2型PCR检测方法操作程序廖荣斌，何启盖（华中农业大学动物医学院）一、原理猪圆环病毒2型感染引发的仔猪断奶衰竭综合症、肾炎与皮炎、增生性肠炎以及母猪繁殖障碍。
通过病原检测和病毒分离是确证本病的重要手段。
猪圆环病毒分为2种，即圆环病毒1型和圆环病毒2型。
前者不致病，后者可致病。
猪圆环病毒2型（PCV2）的基因组大小为1768 bp或1767bp。
其中，PCV2ORF2基因与免疫保护和毒力等重要特性有关，同时，此基因与PCV1的同源性较低，通过合理设计引物，扩增ORF2，从而可检测并区分PCV2与PCV1。
PCR技术具有快速、敏感的优点，已经用于许多动物疾病病原的检测。
本试验是利用我们设计的引物，通过反应条件的优化，以感染猪组织或血液为模板，扩增PCV2的ORF2基因，从而作出感染的结论。
二、材料准备1、手术器械：采样用。
根据样品数量来确定。
2、微量移液器（规格：2.5μl，10μl，100μl，200μl，1000μl）3、反应引物上游引物：CAC GGA TAT TGT AGT CCT GGT；下游引物：CGC ACC TTC GGA TAT ACT GTC4、磁珠：用于吸附和分离DNA4、PCR仪：东胜创新5、电泳仪：北京六一电子设备6、紫外检测仪：Bi0-RAD凝胶成像系统7．相关溶液及配方：1╳TAE buffer（电泳缓冲液）配方：（1）称量Tris：242g，Na2EDTA.2H2O：37.2g，置于1L的烧杯中；（2）向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌溶解；（3）加入57.1ml的醋酸，充分搅拌；（4）加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；（5）使用时将室温保存的该溶液稀释50倍即可使用。
扩增产物的样品缓冲液：全式金生物6╳Loading buffer。
三．样品采集感染猪或流产的胎儿的肺脏、淋巴结、脾脏和肾脏；发热期猪的抗凝血或血清；每个样品用单独的剪刀或刀片，避免交叉污染。
猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ Ｖ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ ｔ ｒｎ ｒ ｄ ｃｎｅ
猪 细 小 病 毒 、 狂 犬 病 病 毒 和 猪 圆 环 病 毒 ２型 伪 多重 Ｐ ＣＲ 检 测 方 法 的 建 立 及 应 用
测 方法可 用 于临床样 品 的检 测 ， 为疾病诊 断提供 参 考 。
关键 词 ： 细 小病 毒 ； 猪 伪狂 犬病 病毒 ； 圆环病毒 ２型 ； 猪 多重 Ｐ Ｒ Ｃ
中图 分 类 号 ： ８ ； ８ ８ ２ Ｑ７ ９ ￥ ５ ． ８ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７ ５ ３ （ ０ １ ０ — ０ ５０ １０ —０ ８ ２ １ ）８０ ２—７
的发 生 ， 如感染 仔猪 先天 性震 颤 、 奶仔 猪 多系 统衰 断
用方 法 ， 也为 养殖 企 业对 这 ３种 疫 病 的 防控 提 供基
础 资料 和参考 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
竭综 合征 和猪皮 炎 与肾炎 综合 征 等［ 。 ４ ］ 聚 合 酶 链 反 应 （ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅ ｃｉｎ ｐ ｌｍｅａｅ ｃ ａｎ ｒａｔ ， ｏ
Ｐ Ｖ） 伪狂犬 病病 毒 （ ｓｕ ｏａ ｉｓｖｒｓ Ｐ Ｐ 、 Ｐ ｅ ｄ ｒ ｂｅ ｉ ， ＲＶ） 猪 ｕ 、
圆环病 毒 ２型 （ ｏ ｃ ｅｃ ｃ ｖｒ ｓｔｐ ， Ｃ ２ 是 Ｐ ｒｉ ｉ ｏ ｉ ｙ ｅ２ Ｐ Ｖ一） ｎ ｒ ｕ 当前 影 响 养 猪 业 发 展 的 ３种 重 要 的 病 原【 。 由 于 １ ］ Ｐ Ｖ、 Ｒ Ｐ Ｖ ２单 独 感 染 或 混 合 感 染 均 能 引起 Ｐ Ｐ Ｖ、 Ｃ 一 猪发病 ， 造成 母 猪 的 繁 殖 障 碍／ 染 猪 的 免疫 抑 制 ， 感 为其他 病原 的继 发 感染 提 供 了便 利 ， 至会 造成 猪 甚 群 中疫病 的流 行 ， 养殖 生 产蒙 受损 失 ， 使 并有 可 能 引 发 公 共 卫 生 问 题［ 。Ｐ Ｖ 和 Ｐ Ｖ 是 造 成 猪 繁 殖／ ２ ］ Ｐ Ｒ
猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立
．
２ 兽 医研 究 ２．
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猪 圆环病毒２ 型 Ｐ Ｒ 测 方法 的建立 Ｃ 检
董信 田 肖 剑 金 俊 杰 金 大春 王跃川
Ｐ Ｖ Ｒ ２ 因的引物． Ｃ ２Ｏ Ｆ 基 通过 对 Ｐ Ｒ方 法 的 优 化 ． 立 了快 速 的Ｐ Ｒ 测 方 法 用 于病 Ｃ 建 Ｃ 检
购 自Ｔ Ｋ Ｒ 公 司 。其余 试 剂 均 为分 析 ａａａ
纯产品
１４ 主 要 仪 器 ．
料 中Ｐ Ｖ 感 染 的 检 测 。 用 本 方 法 对 猪 瘟 病 毒 （ Ｃ 、 猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 Ｃ ２ Ｈ Ｖ）
１３ 主 要试 剂 ．
（． 江省 温 州 市畜 牧 兽 医局 ， １ 浙 浙江 温州 ３ ５０ ；． 江 省 温州 市 农科 院 ； ２０ ０ ２浙
３浙 江 省瑞 安 市 畜牧 兽 医局 ） ．
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理 变 化 。与Ｐ Ｖ１ 同 ．Ｃ ２ 因组 全 猪 的肺 脏 和淋 巴结 中分 离 得 到 。 对 照 毒株 Ｃ 不 ＰＶ基
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法 。 这 些 方 法 中 。 通Ｐ Ｒ方法 具 有 较 高 在 普 Ｃ 的敏 感 性 和 特 异性 ． 且操 作 简 便 ． 别 适 而 特 合 于 临床 的快 速 诊 断 。本 研 究 根 据Ｐ Ｒ技 Ｃ
陕西省猪圆环病毒2型PCR检测及流行株的遗传变异分析的开题报告
陕西省猪圆环病毒2型PCR检测及流行株的遗传变异分析的开题报告1.选题背景猪圆环病毒2型是一种引起猪圆环病的病毒，主要侵犯猪的肠道和胃，引起猪的腹泻、呕吐、头晕、厌食等临床症状，严重的情况下会危及猪的生命。
随着全球化发展，猪圆环病毒2型已经成为一种重要的猪病毒，对猪养殖业产生了严重的经济损失。
目前，猪圆环病毒2型的检测主要依赖于PCR技术。
然而，由于猪圆环病毒2型存在多种亚型和变异株，线性PCR技术检测的准确性和特异性不高。
因此，通过开展猪圆环病毒2型PCR检测及流行株的遗传变异分析，对于研究猪圆环病毒2型的流行病学特征、基因变异乃至疫苗研发具有重要的意义。
2.研究目的（1）建立一种快速、简便、准确、特异性高的猪圆环病毒2型PCR 检测技术，用于现场实时检测猪圆环病毒2型。
（2）收集陕西省各地猪圆环病毒2型病毒标本，通过PCR扩增和基因测序技术分析猪圆环病毒2型病毒的流行株和遗传变异情况，为深入研究猪圆环病毒2型的流行病学特征和基因变异提供支撑。
3.研究内容及方法（1）建立猪圆环病毒2型PCR检测技术通过对猪圆环病毒2型的基因组序列进行分析，设计一对适用于猪圆环病毒2型的特异性PCR引物，建立特异性高、敏感性好的PCR检测方法。
并利用临床病例进行验证，检测方法的准确性和特异性将通过与其他病毒引起的类似临床症状进行比较来进行评估。
（2）流行株的遗传变异分析收集陕西省各地猪圆环病毒2型病毒标本，利用PCR扩增和基因测序技术，对全部病毒标本进行基因序列测定。
利用生物信息学工具对基因序列进行分析，包括进化关系分析、核酸、氨基酸序列标志位的比较，裂解位点、切割位点等的比较等。
同时，对流行株的基因序列进行聚类分析，观察其遗传变异情况，并与其他病毒株进行比较。
4.预期成果及意义经过本研究，预计能够建立一种准确、特异性高的猪圆环病毒2型PCR检测技术，并收集陕西省各地的猪圆环病毒2型病毒标本，开展其基因分析研究，得出以下成果：（1）建立猪圆环病毒2型PCR检测技术，实现对猪圆环病毒2型实时检测，提高疾病诊断的准确性和敏感性。
检测猪圆环病毒2型PCR方法的建立
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安徽农 业科 学。ｏｒａ ｏ Ａ ｈ ｉ ．ｃ．０８ ３ （６ ：６ ８ ６９ ６０ Ｊｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ Ｓｉ２０ ，６ １ ）６７ —６ ７ ，７ｏ
责任编辑
孙红忠
责任校对
Байду номын сангаас卢瑶
检 测猪 圆环 病 毒 ２型 Ｐ Ｒ 方 法 的 建 立 Ｃ
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猪圆环病毒2型检测技术及研究进展
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展猪圆环病毒2型（PRRSV-2）是一种重要的猪类病毒，它会引起猪的严重疾病，并对全球猪业产生了极大的经济影响。
对猪圆环病毒2型的检测技术和研究进展一直备受关注。
本文将从PRRSV-2的检测技术和研究进展两个方面进行介绍。
一、猪圆环病毒2型检测技术1. 实时荧光RT-PCR技术实时荧光RT-PCR技术是目前用于PRRSV-2检测的主要方法之一。
该技术通过分离RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化为cDNA，再利用聚合酶链式反应（PCR）进行扩增，最后通过荧光探针实时检测扩增产物的数量。
这种技术具有灵敏度高、特异性好、快速准确等优点，已经成为PRRSV-2检测的金标准。
2. 基因组测序技术随着生物技术的不断发展，基因组测序技术在PRRSV-2的检测中也得到了广泛应用。
通过对PRRSV-2的基因组进行测序，可以对该病毒的进化特征、毒株变异等进行深入研究，为疫苗研发、病毒溯源等提供重要参考。
3. 免疫学检测方法除了分子生物学方法外，免疫学检测方法也是PRRSV-2检测的重要手段之一。
ELISA、免疫荧光法等免疫学检测方法可以通过检测猪血清中的抗体水平，来进行PRRSV-2感染的诊断和流行病学调查。
4. 快速检测试剂盒随着POCT（ Point of Care Testing）技术的发展，一些快速检测试剂盒也逐渐应用于PRRSV-2的检测中。
这些试剂盒可以在实验室外、无需专业设备的情况下进行快速检测，为疫情监测、动物交易等提供了便利。
以上几种技术各有优缺点，但在实际应用中可以根据需要进行选择和结合，以提高PRRSV-2的检测效率和准确性。
1. 病毒进化特征研究随着基因组测序技术的广泛应用，人们对PRRSV-2的毒株进化特征有了更深入的了解。
研究表明，PRRSV-2存在着较高的遗传多样性和进化速度，不同地区、不同时间和不同种类的PRRSV-2之间存在着较大的遗传差异，这对疫苗的制备和疫情防控提出了更高的要求。
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展
猪圆环病毒2型检测技术及研究进展猪圆环病毒2型（PPV-2）是一种广泛存在于猪群中并引起严重疾病的病毒。
近年来，随着人们对病毒监测和研究的深入，PPV-2的检测技术不断更新，研究也取得了一系列的进展。
本文将对PPV-2的检测技术及研究进展进行详细介绍。
一、PPV-2检测技术1. PCR技术PCR技术是目前研究人员常用的一种PPV-2检测方法。
PCR通过扩增病毒核酸来实现对病毒的检测，具有高灵敏度和特异性。
研究人员可以设计特异性引物和探针，用于扩增和检测PPV-2的核酸，从而实现对该病毒的快速检测。
PCR技术还可以用于对病毒的变异情况进行分析，为进一步研究病毒的传播和演化提供重要数据。
2. 传统病毒学方法除了PCR技术外，传统的病毒学方法如病毒分离和培养、免疫组化染色等也可以用于PPV-2的检测。
这些方法虽然较为耗时且操作复杂，但在一些实验室条件较差的情况下仍然具有一定的应用价值。
3. 试剂盒检测试剂盒检测试剂盒对PPV-2的检测更加简便快速，通常采用酶联免疻法（ELISA）、荧光PCR等技术，具有高灵敏度和可重复性，适用于大规模的病毒检测。
目前市面上已经有多种PPV-2检测试剂盒，可以满足不同使用需求。
二、PPV-2研究进展1. 流行病学调查近年来，越来越多的研究表明，PPV-2在全球范围内存在，并且呈现出不同的流行特点。
一些研究人员通过流行病学调查发现，PPV-2在某些地区的发病率较高，且与其他病毒如猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）等联合感染时，会导致更加严重的临床症状。
这些研究结果为制定针对性的防控策略提供了重要的依据。
2. 病毒基因组学研究病毒基因组学研究是近年来的热点领域之一，通过对病毒基因组进行全面的测序和分析，可以揭示病毒的遗传变异、传播规律以及与宿主的相互作用等重要信息。
对PPV-2基因组的研究发现，该病毒存在一定的变异性，不同毒株之间有着较大的差异，这为进一步研究病毒演化和毒株间的差异性病毒对照提供了重要数据。
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检测猪圆环病毒2型DNA的套式PCR方法的建立及应用靳玉芬 (安阳工学院生物与食品工程学院,河南安阳455000)摘要 为了进一步调查研究PVC2的流行病学及其致病机制,根据猪圆环病毒2型G D株及已发表的PC V2的全基因组序列,对来自广东、广西、湖南、海南等地287个猪场送检的1560个可疑病料进行PCR扩增,并对扩增产物进行克隆、酶切、测序鉴定,建立了PC V2检测的套式PCR方法。
结果表明,PCR扩增获得了预期大小的片断,将测序结果与G enBank收录的PC V2序列进行比较,发现同源性均在90%以上。
该PCR方法对PC V2是特异的,并具有良好的重复性和稳定性。
用该PCR方法对287个猪场的1560份样品进行了检测,其中983份为PC V2阳性,表明该病在我国广泛流行。
关键词 猪圆环病毒2型;套式PCR中图分类号 S855 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)07-01950-02E stablishm ent and Application of N ested PCR Assay for T esting PCV2JIN Yu2fen (C ollege of F ood S cience and Biotechn ology,Anyang Institute of T echn ology,Anyang,H enan455000)Abstract According to the published gen om e sequence of porcine circovirus ty pe1and ty pe2(PC V1,.PC V2),1560d oubtful diseased sam ples from 287pig farms in G uangd ong,G uangxi,Hunan,H ainan etc were m ade for PCR am plification.T he am plified product was m ade for clone,enzym e restric2 tions test sequencing analysis and identification,then the nested polym erase chain reaction(nPCR)assay was established for PC V2.Results sh owed that PCR am plification g ot the factions that their size fixed in w ith ex pectation.C om paris on of sequencing results and PC V2sequence emb odied by G enBank sh owed that the h om ology was m ore than90%.T he PCR assay was specificity to PC V2and had g ood repeat and stability.1560sam ples from287pig farms had been detected for PC V2,from which983sam ples g ot the positive results for PC V2,suggesting that PC V2in fection is very popular in China.K ey w ords P orcine C ircovirus T y pe2(PC V2);Nested P olym erase Chain Reaction(nPCR) 猪圆环病毒(porcine circovirus,PC V)最早被发现于一种猪肾细胞系中,可持续感染PK215细胞但不引起细胞病变。
Brian等认为可根据PC V的致病性、抗原性及核苷酸序列将PC V分成PC V1和PC V22种基因型。
PC V1无致病性,包括PK2152PC V及其他流行于猪群但无致病性的分离株,试验证明其广泛存在于猪原代细胞系及猪群中;PC V2具有致病性,与近年来世界各国广泛流行的断奶仔猪多系统衰竭综合症(P ost W eaning Multisystemic W asting S yndrome,P MWS)密切相关。
该病主要以进行性消瘦和多系统病理损伤为特征,给全球养猪业造成了严重的经济损失。
PC V2全基因为1767bp或1768bp,共有11个阅读框,其中ORF1和ORF2是其最主要的阅读框。
各毒株的序列同源性介于91.9%～100%,氨基酸同源性为90.2%～100%,较为保守。
ORF1为945bp,编码315个氨基酸,编码病毒的复制蛋白,与PC V1的ORF1编码蛋白有相同的抗原性。
ORF2为705bp,编码234个氨基酸,编码PC V2囊膜的主要结构成分,具有较好的免疫原性,是构建重组疫苗和检测的首选基因。
ORF2的氨基末端区域的12～18和34～41位氨基酸对核定位起重要作用,而69～83和117～131位氨基酸所形成的位点对PC V2抗血清有特异性。
为此,笔者选用ORF2的1个片段对不同地区来源的可疑病料进行PCR扩增,并对扩增产物进行克隆、酶切、测序鉴定,建立了PC V2检测的套式PCR 方法,为PC V2的流行病学调查和致病机制研究奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料 ①仪器。
PCR仪(ABI)、凝胶成像分析系统(Al2 phaM aster)、高速冷冻离心机(E ppend orf)。
②试剂。
PCR试剂盒(Invitrogen)、DNA片断回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等购自T aK aRa公司(大连);组织基因组DNA提取试剂盒购自基金项目 中国博士后科学基金(2003033120)。
作者简介 靳玉芬(1964-),男,河南辉县人,硕士,副教授,从事预防兽医学方面的教学与研究。
收稿日期 2006211227Whats on公司;Xba I、BamH I、Hind III与T4DNA连接酶购自New England Biolabs公司;pM D182T载体购自T aK aRa公司(大连);③病料。
供试猪为广东、广西、湖南、海南等地287个猪场送检的1560份样品;④菌种。
大肠杆菌DH5α购自Invitro2 gen公司。
1.2 引物设计 根据国外已发表的文献[6],选择PC V1 (U49186)和PC V2(AF027217)作为扩增对象,采用套式PCR扩增目的片段。
外部引物为P1:5’2C AACTG CTG T CCC AG CTG T AG23;P2:5’2AGG AGG CG TT ACCG C AG AAG23’。
内部引物为P3: 5’2T AGG TT AGGG CTG TGG CCTT23’;P4:5’2CCG C ACCT T CGG A T A2 T ACTG23’。
外部引物可扩增PC V1和PC V2,内部引物只扩增PC V2。
引物P1、P2、P3、P4由上海博亚生物有限公司合成。
1.3 模板的制备 取患P MWS的病猪血清加入蛋白酶K至终浓度100μg/ml、S DS至终浓度1%,55℃水浴2h,用苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提1次,吸取水相加入1/10倍体积的3m ol/L NaAC及2倍体积的无水乙醇沉淀1h,4℃12000r/min离心15min,沉淀悬浮于ddH2O中,取适量用作PCR模板。
1.4 病料的PCR扩增 引物浓度为10μm ol/L,整个PCR 反应体系50μl:Premix T aq(DNA P olymerase,Bu ffer,dNTP mix2 tures),上下游引物各1μl,模板DNA3μl,加ddH2O至50μl,均匀混合。
2次PCR采用相同条件即在94℃变性2min后,按94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸1min进行30个循环,最后72℃延伸5min。
反应结束后取5μl PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察。
1.5 PCR产物的克隆 按DNA回收试剂盒说明书回收PCR 产物,然后在10μl体系中分别加入2μl回收产物、5μl Lega2 tion S olutionⅠ、1μl pM D218T载体,2μl ddH2O,16℃水浴18h后取出,转化大肠杆菌DH5α,37℃培养12h。
1.6 阳性重组质粒的筛选及酶切、测序鉴定 用牙签挑取上述转化平皿中的白色单克隆菌落,接种到含Am p的LB液体培养基中,37℃振荡过夜至混浊,然后提取质粒;用Xba I、安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.S ci.2007,35(7):1950-1951 责任编辑 陈娟 责任校对 胡先祥BamH I/Hind 酶切鉴定重组质粒;对阳性重组质粒测序鉴定并与G enBank 收录的PC V2进行同源性比较。
1.7 敏感性测定 上述方法分别取PC V2阳性血清和细胞培养物(PC V22PK 15)200、100、50、10μl 稀释至200μl 提取DNA 作模板,检验该方法的敏感性。
1.8 特异性测定 为了论证该方法检测的特异性,常规提取非靶DNA (PC V1、HC V 、PRRS V 、PRV 、PPV DNA 或cDNA )及空白对照,用PC V2特异性引物进行PCR 扩增。
1.9 重复性检验 用所建立的套式PCR 法对3份不同的PC V2阳性组织样品分别进行5次重复性试验,检验该方法的重复性和稳定性。
1.10 套式PCR 的临床应用 应用所建立的套式PCR 方法对来自287个猪场的1560份样品进行检测,其中检测病理材料103份,血清1427份,精液20份。
检测样品分布为广东233场次,广西29场次,海南11场次,湖南14场次,湖北4场次。
2 结果与分析2.1 病料PCR 扩增及扩增产物的鉴定结果 血清经外部引物PCR 扩增得到1条880bp 的特异性扩增带,内部引物PCR 扩增得到263bp 的扩增带(图1)。
用Xba Ⅰ对重组质粒进行酶切,发现该目的片段中存在一个Xba Ⅰ酶切位点,用BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切重组质粒,得到1条340bp 左右的片段,与预期片段大小相符(图2);测序结果表明,PCR 扩增获得了预期大小的片段,该序列与G enBank 收录的PC V2同源性均在90%以上。
2.2 敏感性测定 敏感性测定结果表明,用50μl 的血清检测时仍能看到清晰的核酸带,但用10μl 的血清观察不到核酸带;而细胞培养物10μl也能检测到清晰的核酸带。