琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物
琼脂糖凝胶浓度对电泳结果的影响
总结词
琼脂糖凝胶浓度对DNA分子的迁移速度和分离效果具有重要影响。
详细描述
不同浓度的琼脂糖凝胶对DNA分子的迁移速度和分离效果不同。高浓度的琼脂糖凝胶可以增加DNA分子的阻力， 减缓其迁移速度，从而提高分辨率。而低浓度的琼脂糖凝胶则会使DNA分子迁移速度加快，但分辨率降低。因此， 应根据DNA分子的大小和数量选择合适的琼脂糖凝胶浓度。
可视化
通过染色剂染色，可以 将DNA片段可视化，便 于观察和记录结果。
缺点
分辨率有限
琼脂糖凝胶电泳的分辨率有限，对于一些长度相近的DNA片段可能无 法区分。
易产生误差
由于操作过程中涉及到人为因素，如加样、凝胶制作等，容易产生误 差。
对小片段DNA检测效果不佳
对于小片段的DNA，琼脂糖凝胶电泳的检测效果不佳，可能会漏检。
电泳温度对电泳结果的影响
总结词
电泳温度对DNA分子的运动速度和琼脂糖凝胶的黏度有影响，进而影响电泳结 果。
详细描述
在一定范围内，较高的电泳温度可以提高DNA分子的运动速度，从而提高分辨 率。但温度过高可能导致凝胶变形和DNA分子变性，影响电泳结果。因此，应 根据DNA分子的大小和性质选择适宜的电泳温度。
在电场中，DNA分子会受到正极的吸引，向正极方向移动。
迁移速度与DNA分子大小相关
02
DNA分子越小，迁移速度越快；DNA分子越大，迁移速度越慢。
分离效果
03
通过琼脂糖凝胶的孔径大小和电场强度，可以将不同大小的
DNA分子进行分离。
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的原理
琼脂糖凝胶孔径大小
DNA染料染色
琼脂糖凝胶具有不同孔径大小，可分离不 同大小的DNA分子。
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制 性片段长度多态性分析、基因突变检测等 。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、 单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测 序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题 与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致 条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带 拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条 带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高， 导致DNA在凝胶中扩散。
琼脂糖凝胶电泳-完 整整理
目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝 胶中进行的电泳技术，主要用于 分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同 样品中目标DNA片段的浓 度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪 音的比例，评估DNA片段 的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶的特点
（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合 物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量 测定 6.有热可逆性
（三）结 构 特 征
CM 甘油三脂 胆固醇 蛋白质 带电量（Q） pH8.6为例 颗粒大小（mm） 密度 电泳速度 形态 多 多 少 少 大 低 慢 规则 不规则 VLDL LDL HDL 少 少 多 多 小 高 快
pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电 泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力 小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL 跑在前。
2. 按超速离心法分 乳糜微粒(chylomicron,CM) ( < 0.96 ) 极低密度脂蛋白 (0.961.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.0061.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) 低密度脂蛋白LDL(1.0191.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.0631.21) (high density lipoprotein, HDL)
脂 蛋 白
血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE
甘油三酯 （TG） 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 1. 按电泳法分 乳糜微粒（chylomicron,CM） -脂蛋白 （-位） 前-脂蛋白（2-位）） -脂蛋白 （1-位）
琼脂糖凝胶电泳技术
电泳检测技术是指利用带电颗粒在电场中能向异性电极泳动这一现象来分离、纯化或分析检测供试品的一种生物化学技术。
原理：许多生物分子都带有电荷，在电场作用下可发生移动，由于混合物中各组分所带电荷性质、数量以及相对分子质量各不相同，使在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速率也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，包括电荷效应和分子筛效应。
琼脂糖是由天然的琼脂加工制得，是一种直链杂聚多糖，溶于热水，形成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的大网孔径凝胶。
由于孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，该电泳技术是目前分离、分析DNA片段的标准方法。
DNA琼脂糖凝胶电泳的原理DNA 分子是两性电解质，在高于其等电点的溶液（pH8.0~pH8.3 DNA分子本身的大小和构型、凝胶浓度决定了DNA分子的迁移速度。
）中，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离，DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA分子大小对迁移速率的影响：相对分子质量大，迁移慢；相对分子质量小，迁移快。
DNA分子构型对迁移速率的影响：迁移速度：闭环﹥直链DNA﹥开环DNA。
琼脂糖凝胶浓度的影响：同样大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移速度不同，浓度越大，迁移的越慢常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度。
溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，能插入DNA分子中形成荧光结合物，EB在紫外线照射下的发射荧光。
荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。
EB是强致癌剂。
电泳操作步骤(整个过程要求带一次性手套1、胶槽准备①将凝胶托盘放入制胶盒中;②将加样梳垂直插入到制胶盒的小凹槽内，梳齿底端和凝胶托盘有1mm的间隙;③将制胶盒放在调整好的水平台上。
2、凝胶准备用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶。
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳1.原理琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具备网络结构，物质分子通过时会受阻力，大分子物质在汹涌时受的阻力小，因此在凝胶电泳中，磁铁颗粒的拆分不仅依赖于天量电荷的性质和数量，而且还依赖于分子大小，这就大大提高了辨别能力。
但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广为应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据ph不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。
电泳缓冲液的ph在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。
常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。
琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的dna片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。
普通琼脂糖凝胶分离dna的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的dna片段。
dna分子在琼脂糖凝胶中泳动时存有电荷效应和分子筛效应。
dna分子在低于等电点的ph溶液中带负电荷，在电场中向负极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链dna几乎具备等量的净电荷，因此它们能够以同样的速率向负极方向移动。
2操作方式流程准备干净的配胶板和电泳槽琼脂糖凝胶电泳：水平电泳注意dna酶污染的仪器可能会降解dna，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。
(1)电泳方法1一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大dna链应该使用脉冲凝胶电泳。
注意巨大的dna链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。
(2)凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用以展开大片段核酸的电泳，高浓度的用以展开大片段分析。
低浓度胶坚硬，小心操作方式和采用质量不好的琼脂糖就是解决办法。
琼脂糖凝胶电泳
液 缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室
温
加样：制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有 1 × TAE 或 TBE 工作液的电 泳槽中使用。用微量加样器将添加了１× Loading Buffer 的样品分别加 入样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品 孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部。
基因工程常用研究技术
DNA水平凝胶电泳 DNA horizontal electrophoresis
原理
琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖熔化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体 基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH 的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。 它主要用于分离、鉴定核酸，如 DNA 鉴定，DNA 限制性内切酶图谱 制作等，为 DNA 分子及其片段分子量测定和 DNA 分子构象的分析提 供了重要手段。
电泳温度
琼脂糖DNA电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也 可在室温下进行。
在琼脂糖凝胶浓度低于 0.5% 时，由于胶太稀，最好在 4℃进行电泳以 增加凝胶硬度。
质粒的电泳图谱
形、开口环状。
g /ml 加入EB，混匀。
倒胶：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；将有机玻璃内槽两端封好，置于 一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至 65℃ 左右的琼脂糖
凝 胶液，小心地倒在有机玻璃内槽上，控制灌胶速度和量，使胶
液 缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室
温
EB的作用
EB：即 3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐（Ethidium Bromide）。 它能够插入 DNA 分子中的碱基对之间而与 DNA 结合。由于
琼脂糖凝胶电泳
二、实验方法
• 1．50×TAE的稀释：如 制备50mL 1×TAE，取 1mL 50×TAE加入 49mL水定容至50mL。
• 2．制备1%的琼脂糖胶 液：取0.2g琼脂糖溶于 20mL TAE中，在短时间 里加热琼脂糖全部熔化， 使溶液冷却至60℃.(加入 浓度为10mg/mL的EB 2μL，使EB的终浓度为 1μg/mL)。
• 3．用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用 乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后 用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。
• 4．用胶带封住胶床，放好梳子。
Hale Waihona Puke • 5．将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间， 凝固20—60min。
• 6．在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽 内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。
Thanks
农药学
贮存温度 4℃
室温
4℃
4℃ 4℃
• 加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入 样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作 更为便利。
• 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的 2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长 300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖 凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。
• 7．向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面 1cm。
• 8．分别将DNA/RNA样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品 加入加样孔。
• 9．正确连接电泳槽和电源，设定稳压为75V，电流一般为 50mA。
• 10．电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察。
三、注意事项与实验技巧
琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳
琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳1. 什么是琼脂凝胶电泳？大家好，今天我们来聊聊一个科学小话题——琼脂凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳。
听起来有点复杂，其实它就像是科学界的“选美比赛”，不过选的不是小姐姐，而是分子哦！这两个小家伙都是用于分离和分析生物分子的方法，主要在基因和蛋白质的研究中大显身手。
琼脂凝胶电泳是用琼脂凝胶来分离生物大分子，比如DNA、RNA和蛋白质；而琼脂糖凝胶电泳则是用琼脂糖，专门用于DNA的分析。
听起来是不是有点像“同门兄弟”的感觉呢？1.1 琼脂凝胶电泳的工作原理琼脂凝胶电泳的原理其实很简单。
想象一下，一条河流，河水流动，河里的石头和沙子各自沉浮。
琼脂凝胶就像这条河，而DNA分子就像在河里漂浮的小石头。
电流流过时，带电的分子在电场的作用下开始移动，移动的速度和距离就取决于它们的大小和形状。
小分子跑得快，大分子跑得慢，最终在凝胶里形成不同的位置，像极了学校运动会上那场激烈的接力赛。
1.2 琼脂糖凝胶电泳的应用而琼脂糖凝胶电泳主要是针对DNA的。
因为DNA分子比较大，所以我们需要用琼脂糖来制造凝胶。
这个过程可不简单，首先得把琼脂糖溶解，然后倒入模具里，等它凝固。
接着，咱们就可以把样品放进去，通电后就能观察到DNA分子的分离了。
这就像在举行一场大聚会，大家按身高、体重分组，最后排成一条长龙，看看谁的身形最抢眼！2. 准备工作与步骤当然，做电泳可不是随便搞搞就完事的。
咱们得先做好准备工作。
首先要准备好琼脂和琼脂糖，根据实验需求调配浓度，这就像做饭调味一样，浓度太高，分子跑不动；浓度太低，又不够清晰，真是个“难兄难弟”。
然后，得把样品和缓冲液混合，搅拌均匀，这一步就像调色板，颜色调和得越好，最后的效果才越惊艳！2.1 凝胶的制备接下来，咱们需要制作凝胶。
把琼脂和琼脂糖加热至完全溶解，然后迅速倒入模具，待其凝固。
这个过程就像等待美食出炉一样，既期待又有点小紧张。
凝固后，再在凝胶上打个小洞，放入样品，别忘了在样品的旁边加上分子量标准，这样最后才能评比，看看谁最出色。
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