依诺肝素钠宽分布相对分子质量对照品研制

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浅析药品依诺肝素钠的生产工艺

浅析药品依诺肝素钠的生产工艺作者：薛发珍来源：《科技创新与应用》2015年第11期摘要：这项生产工艺是本课题大量实验的相关成果，借鉴法国公司依诺肝素钠生产情况，采用一种原材料，经过科学、严谨的生产过程，所研制的依诺肝素钠样品符合欧洲药典标准。

根据实验情况，文章总结了生产过程中需要重视的环节，使这种药品国产化成为可能。

关键词：依诺肝素钠；生产；酯化率；成环率；纯化药品依诺肝素钠（enoxaparin sodium）是一种低分子肝素药物，这种药品是治疗预防与脑血栓的最佳药品之一，具有抗血栓作用强、出血危险性小等特征，经临床试验表明，依诺肝素钠能达到抗凝血、抗血栓形成的显著疗效，故此，这种药品具有重要的医疗价值，对生物制药企业而言，大面积生产这种药品，能带来大量的经济效益，同时也能满足我国的医疗需求。

1 依诺肝素钠的生产工艺1.1 依诺肝素钠现行的生产工艺依诺肝素钠主要特征为分子中有一个4-烯吡喃糖醛酸结构（图1）。

目前，医疗上使用的依诺肝素钠都由法国Aventis公司研发，并由这家公司在1993年申请专利。

由于这项专利未涉及生产过程中酯化率、成环率及产物纯化等关键工艺，因此存在一定的缺陷，这就使得法国这家公司运用该专利生产的药物样品时，距离欧洲药典4.0版规定的标准尚有一定的距离。

1.2 这项生产工艺的研究目的这项研究主要是通过对相关反应条件的控制，研制出可以实现流水线生产依诺肝素钠的生产工艺，生产出来的样品，经过多次实验，表明这些样品的溶液颜色符合欧洲药典4.0版要求，其余质量指标均符合欧洲药典5.3版。

1.3 这项工艺所需的仪器与试剂根据生产过程的相关要求，结合前期的研究情况，这项工艺所需的仪器、设备和试剂，有如下几种：1100型高效液相色谱仪、TSK-GEL 凝胶色谱柱及1100型示差检测仪均为Agilent产品；UV-2101PC型紫外检测仪（日本岛津）。

肝素钠（南京健友公司）；苄索氯铵[benz e thoniumchloride，化学名为苄基二甲基[2-[2-[4-（1，1，3，3-四甲基丁基）苯氧基]乙氧基]乙基]氯化铵，Sigma公司]；二氯甲烷、氯苄（上海三爱思试剂有限公司）；H103型非极性大孔聚苯乙烯吸附树脂（南开大学化工厂，柱径3.6cm，柱床体积550ml）；依诺肝素钠标准品（欧洲药典标准品）；其他试剂均为分析纯。

依诺的肝素的制备和纯化剖析

江西浩然生物医药有限公司项目研发计划项目名称：HR-08技术研究负责人：起止时间：项目编号：HR-08-1503002目录内容页码一背景资料………………………………………………………二立项目的………………………………………………………三研究内容………………………………………………………四资金预算…………………………………………………五实验研究时间计划……………………………………一、背景资料依诺肝素钠(enoxaparin sodium，1)属于低分子肝素⋯，主要特征为分子中有一个4一烯吡喃糖醛酸结构(图1)。

本品抗血栓作用强、出血危险性小，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治疗药物之一，肝素通过酶或化学的方法部分降解就可以获得低分子肝素。

低分子肝素因为分子量较小，不易被I V因子中和，抗凝血效果和纤溶作用得以增强，而抗血小板，影响血小板功能，影响血液的凝固性，诱发出血的作用大为减弱，加之生物利用度高达98%，量效关系明确，抗凝效果易于预防，血浆半衰期较普通肝素长2-3倍，同时具有快速和持续的抗血栓形成作用，改善血流动力学。

依诺肝素钠由法国AVentis 公司研发，并与1993年申请专利。

但该专利未涉及生成过程中酯化率，成环率及生产纯化等关键工艺。

采用该转利生成的样品无法达到欧洲药典4.0版规定的标准。

本研究通过控制上述反应条件，得到适合于工业生成的依诺肝素钠工艺，所得的成品溶液颜色符合欧洲药典4.0版要求，其余质量指标均符合欧洲药典5.3版。

二、实验目的建立HR－０８制备和纯化的工艺技术参数，进行工艺放大和工艺稳定性研究。

三、实验内容：实验步骤：3.1．成盐：3.1.1 称取06样品（例如100g）用纯化水(1000ml)溶解到10%溶液，边加入边搅拌，至均匀；称取06样品质量2.5倍的苄索氯胺(250g)用纯化水(1250ml)溶解至20%溶液；3.1.2将上述20%苄索氯胺溶液缓缓加入肝素钠溶液中，边加边搅拌，加完后继续搅拌0.5小时；3.1.3将反应液离心收集沉淀（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关，一般选用沉降式离心机？；3.1.4将沉淀捣碎（尽量捣碎）加入1.1中肝素钠质量10倍量的纯化水(1000ml)搅拌洗涤0.5小时，离心收集沉淀（离心速率与时间根据离心机直径调整，一般来说离心上清越清越好，离心效果直接与回收率相关。

低分子肝素论文：低分子肝素分子量测定用对照品的研制

低分子肝素论文：低分子肝素分子量测定用对照品的研制【中文摘要】低分子肝素(low molecular weight heparin, LMWH)是肝素经化学或肝素酶降解或物理分级方法制备而成的肝素片段或组分,其平均分子量在8000以下,小于8000的组分不少于60%,抗FXa 活性不低于70IU/mg,抗FXa/抗Flla不小于1.5。

LMWH与肝素钠主体结构一致,是由艾杜糖醛酸或葡糖醛酸与氨基葡糖以及它们的硫酸化和乙酰化衍生物组成的多糖链混合物为双糖单位,以(1→4)糖苷键连接而成。

近30年来临床实践证明,LMWH是优良的抗凝抗血栓药物,与肝素钠相比抗血栓活性相当,但安全性更高。

我国是世界肝素第一生产大国,但目前的状况是80%以上的肝素产量以原料药形式出口,出口的肝素原料药经加工后变成价格更高的LMWH制剂返销回国。

我国虽然已有十余个厂家生产LMWH制剂,但国内LMWH质量标准与国外相比明显较低,主要满足低分子肝素定义中分子量及活性的要求,未按工艺进行分类,而不同工艺制备的LMWH有不同的末端结构,不同的工艺相关杂质,不同的平均分子量及分布,这些都影响低分子肝素的活性及体内过程。

因此,参照国外标准,并结合国情,尽快提高国内LMWH质量标准十分必要。

分子量及分布是LMWH质量标准的的一个重要指标。

目前,还没有国产LMWH分子量测定用对照品,只有欧洲药典(European Pharmacopoeia,EP)LMWH分子量测定用对照品,WHO LMWH 分子量测定用对照品(International Reference Preparation LMWH for molecular weight calibration)和美国药典(United StatesPharmacopoeia,USP)依诺肝素钠分子量测定用对照品。

本课题致力于研制国产LMWH分子量对照品,研制了系列窄分布的LMWH分子量对照品和附带一宽分布标样表的宽分布的LMWH分子量对照品,并将两种对照品分别与WHO和USP对照品的测定结果进行了对比。

依诺肝素质量标准

依诺肝素质量标准1. 产品描述与定义依诺肝素是一种低分子量肝素，主要应用于肺血栓栓塞和静脉血栓栓塞等疾病的预防和治疗。

依诺肝素以注射剂的形式供应。

2. 性状和外观依诺肝素应呈无色或几乎无色、透明的溶液，不应有可见的异物。

3. 标准要求3.1 粒度依诺肝素注射剂的粒径分布应符合以下要求：- 95%的粒径应小于等于10微米；- 99%的粒径应小于等于15微米。

3.2 透明度依诺肝素注射剂的透明度应符合以下要求：- 使用2英寸玻璃比色皿检测，不得有可见沉淀或浑浊，光透过度应达到98%以上。

3.3 酸碱度（pH）依诺肝素注射剂的酸碱度应符合以下要求：- pH值应在5.0至7.0之间。

3.4 游离钠含量依诺肝素注射剂的游离钠含量应符合以下要求：- 游离钠含量不得超过每毫升15微克。

3.5 杂质依诺肝素注射剂中杂质含量应符合以下要求：- 重金属杂质（如铅、砷、铬等）含量不得超过每毫升5微克；- 其他有害杂质含量不得超过每毫升25微克。

3.6 活性成分含量依诺肝素注射剂的活性成分含量应符合以下要求：- 每毫升依诺肝素注射剂应含有不少于90国际单位的活性成分。

4. 性能验证与测试方法4.1 粒径测试方法：采用光散射法测定依诺肝素颗粒的粒径大小。

4.2 透明度测试方法：使用2英寸玻璃比色皿，对依诺肝素溶液的透明度进行测定。

4.3 酸碱度测试方法：采用电位法测定依诺肝素注射剂的pH值。

4.4 游离钠含量测试方法：采用离子选择电极法测定依诺肝素注射剂中游离钠的含量。

4.5 杂质测试方法：采用相关的色谱法或其他适用的分析方法对依诺肝素注射剂中的重金属和其他有害杂质进行测定。

4.6 活性成分含量测试方法：采用适用的生化法或其他准确的分析方法测定依诺肝素注射剂中的活性成分含量。

5. 包装与储存依诺肝素注射剂应采用符合相关药品包装标准的密封包装，并在阴凉干燥的条件下储存，远离光线和热源。

注：以上依诺肝素质量标准仅供参考，具体标准应根据实际情况和相关法规进行制定。

依诺肝素钠药学研究资料基本要求

发布日期20101110栏目化药药物评价>>综合评价标题依诺肝素钠药学研究资料基本要求作者余立、赵慧玲、陆益红、张震、黄晓龙部门审评四部正文内容依诺肝素钠（Enoxaparin Sodium）为低分子肝素类（low molecular weight heparin，简称LMWH）品种之一，EP、BP、USP等均已收载，我国也已有依诺肝素钠注射液进口，执行进口药注册标准（JX20000267，规格20mg/0.2ml、40mg/0.4、60mg/0.6ml、80mg/0.8ml、100mg/1.0ml）。

因依诺肝素钠生产的起始原料肝素钠为生物提取的大分子多组分生化药，所以药学研究申报资料除应符合《化学药品注册分类及申报资料要求》[1]外，还应参考《多组分生化药注射剂技术审评基本要求》[2]，结合该品种的特点重点注意以下方面。

一．制备工艺欧洲药典（EP）7.0版[3]对依诺肝素钠制备方法简要描述为：依诺肝素钠是一种低分子肝素钠盐，它通过对猪肠粘膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚而获得。

专利US005389618A[4]即采用这种碱解聚的β-消除法，其基本步骤为：以猪粘膜肝素为起始原料，经肝素季铵盐制备、肝素苄酯的制备、对肝素苄酯进行碱解聚、以酸中和、醇沉淀，精制、脱色，脱水干燥，得到依诺肝素钠成品。

由于依诺肝素钠的结构与组成比较复杂，在结构确证与质量标准控制上存在一定的不确定性，所以起始原料和生产过程的研究与控制就尤为重要。

除按一般的化学药要求提供工艺研究资料外，还需要重点提供以下信息：1．起始原料的来源和质量起始原料应来源于猪肠粘膜，并在相关内控标准中予以明确。

1）使用已获批准上市的肝素钠作为起始原料应提供肝素钠原料药的批准证明文件、药品质量标准、检验报告、原料药生产企业的营业执照、《药品生产许可证》、《药品生产质量管理规范》认证证书、销售发票、供货协议等复印件，以及有关病毒灭活方法及其选择依据、病毒灭活验证资料、申报单位对肝素钠的供应商进行审计的资料。

对比研究宽分布对照品测定依诺肝素钠分子量

Advances in Analytical Chemistry 分析化学进展, 2019, 9(1), 30-37Published Online February 2019 in Hans. /journal/aachttps:///10.12677/aac.2019.91005Comparative Study on the Determination of Molecular Weight of Enoxaparin Sodium by Broad Distribution Reference SubstanceQinjuan Xu, Hongmeng Cui*Weihai Ocean Vocational College, Rongcheng ShandongReceived: Jan. 7th, 2019; accepted: Jan. 21st, 2019; published: Jan. 28th, 2019AbstractObjective: Comparative study on the European Pharmacopeia (EP) and the World Health Organi-zation (WHO) low molecular weight heparin reference substances (RS) (both broad distribution reference substance, hereinafter referred to as EP RS and WHO RS), in the determination of the molecular weight and molecular weight distribution of enoxaparin sodium. Methods: A high per-formance size exclusion chromatography was applied by TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm) column. The mobile phase was 0.2 mol·L−1 sodium sulfate aqueous solution adjusted the pH value of 5.0 with sulfuric acid and 0.1 mol·L−1 ammonium acetate aqueous solution, respectively. An iso-cratic elution was performed at a flow rate of 0.5 mL·min−1, and the column temperature was maintained at 30˚C. UV detection with the wavelength at 234 nm was applied. A differential refrac-tion detector and its temperature was kept at 35˚C, with an injection of 25 μl was used. Results: By using EP RS and WHO RS in two different mobile phase systems, the molecular weight and mole-cular weight distribution of enoxaparin sodium CRS (weight-average molecular weight labeled as 4480 Da), enoxaparin sodium injection (clexane), enoxaparin sodium drug substance and enox-aparin sodium injection (self-produced) were determined. And according to the results, the dif-ference of the weight-average molecular weight between samples was less than 100 Da, mean-while, the difference of the molecular weight distribution was less than 1%. Conclusion: The re-sults of eight batches of samples showed that there was no significant difference in the determina-tion of the molecular weight and molecular weight distribution for enoxaparin sodium via em-ploying EP RS and WHO RS.KeywordsEnoxaparin Sodium, Molecular Weight and Molecular Weight Distribution, Low-Molecular-Mass Heparin Reference Substance, Broad Distribution Reference Substance, Weight-AverageMolecular Weight对比研究宽分布对照品测定依诺肝素钠分子量*通讯作者。

一种依诺肝素钠及其生产纯化方法[发明专利]

专利名称：一种依诺肝素钠及其生产纯化方法
专利类型：发明专利
发明人：汤庆刚,季春香,王新扬,赵育,屈建兴,牛洪森申请号：CN201210029323.4
申请日：20120210
公开号：CN102585037A
公开日：
20120718
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种依诺肝素钠，依诺肝素钠的平均分子量在于3500-5500道尔顿之间，溶血栓生物活性100-125IU/mg，抗Xa与抗IIa的比值在3.3-5.3之间。

依诺肝素钠生产纯化方法：肝素苄索氯铵盐的制备；肝素苄酯的制备：肝素苄酯的纯化；依诺肝素钠的制备；依诺肝素钠的纯化。

依据本发明，并控制产品分子量和分布区间，最终得到的精品依诺肝素钠产品质量符合欧洲药典质量标准。

本发明以肝素钠粗品为起始原料，能有效降低生产成本；精制肝素苄酯，稳定了最终产品质量，简化纯化难度，有效解决生产中色素问题，提高产品质量。

申请人：麦科罗夫(南通)生物制药有限公司
地址：226000 江苏省南通市南通经济技术开发区中央路52号406室
国籍：CN
代理机构：南京正联知识产权代理有限公司
代理人：顾伯兴
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依诺肝素钠相对分子量的EP与USP分析方法对比研究

依诺肝素钠相对分子量的EP与USP分析方法对比研究伯小霞;崔慧斐【摘要】目的以国产依诺肝素钠和其原研药为样品,比较欧洲药典(EP)和美国药典(USP)测定依诺肝素钠相对分子质量(Mr)方法的差异,为国内该品种的药典标准制定提供参考.方法采用这两种方法分别检测了10批国产依诺肝素钠原料药和2批原研药注射液LOVENOX的Mr情况.结果 USP方法测得平均Mr均较EP方法结果偏高在200以内,Mr2 000以下组分比例EP方法偏高,而Mr2000 ～8 000组分比例USP方法偏高,但差距均在4％以内.国产依诺肝素钠Mr与原研药的基本一致.结论 EP和USP方法分析依诺肝素钠Mr结果较为接近.%Purpose To analyze the difference of the relative molecular weight (Mr) analysis method of Enoxaparin Sodium in european Pharmacopoeia ( EP) and the United States Pharmacopoeia ( USP ) through the analysis of domestic samples and the branded, and to provide some opinions for Enoxaparin Sodium domestic standard. Methods Ten batches of Enoxaparin Sodium samples and 2 batches brand Injection Lovenox Enoxaparin Sodium were analyzed in EP and USP method. Results The average Mr by EP method was higher than that by USP method with difference of less than 200. The percentage of less than 2 000 by EP method was higher,and that of 2 000 - 8 000 by USP method was higher and both differences within 4% . The Mr of domestic samples was comparable to the branded. Conclusion The results of Mr of Enoxaparin Sodium by EP method were closed to those by USP method.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2012(033)006【总页数】4页(P818-821)【关键词】依诺肝素钠;相对分子量质量;欧洲药典;美国药典【作者】伯小霞;崔慧斐【作者单位】山东大学药学院,山东济南250012;东营天东生化工业有限公司,山东东营257067;山东大学药学院,山东济南250012;(山东大学)国家糖工程技术研究中心,山东济南250012【正文语种】中文【中图分类】R927.1依诺肝素钠是一种低分子肝素钠盐，系通过对猪肠黏膜肝素的苄基酯衍生物进行碱解聚β-消除而获得。

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食品与药品
ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇ
２０１５年第１７卷第ａｍ
１５３
・
论著・
依诺肝素钠宽分布相对分子质量对照品研制
李志敏，马志华，杜旭召，姬胜利
（河北常山生化药业股份有限公司，河北石家庄０５０８００）
ｓｅｌｆ－ｐｒｅｐａｒｅｄＲＳｗｉｔｈｂｒｏａｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＳＥＣ），ａｎｄ
关键词：依诺肝素钠；相对分子质量；高效分子排阻色谱法；对照品中图分类号：Ｒ９１７文献标识码：Ａ文章编号：１６７２．９７９Ｘ（２０１５）０３．０１５３．０４
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡＲｅｌａｔｉｖｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＭａｓｓＲｅｆｅｒｅｎｃｅＳｕｂｓｔａｎｃｅｗｉｔｈＢｒｏａｄＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｆｏｒ
ｅｎｏｘａｐａｒｉｎｓｏｄｉｕｍ．ＭｅｔｈｏｄｓＡＭｒＲＳｗｉｔｈｂｒｏａｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｒｆｅｎｏｘａｐａｒｉｎｓｏｄｉｕｍｗａｓｐｒｏｄｕｃｅｄｔｈｒｏｕｇｈａｓｅｒｉｅｓ
ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＭｒａｎｄｉｔｓｄｉｓｔｉｂｒｕｔｉｏｎｏｆＥＰＭｔＣＲＳ．ＴｈｅＭｔａｎｄＭｔｄｉｓｔｉｂｒｕｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｌｏｔｓｏｆｅｎｏｘａｐａｒｉｎｓｏｄｉｕｍｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｕｓｉｎｇｓｅｌｆ－ｍａｄｅＲＳａｎｄＥＰＣＲＳ．ａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅＵＶａｎｄＲＩｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓａｎｄｔｈｅＭｒａｎｄＭｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｌ￣ｍａｄｅＲＳａｎｄＥＰＣＲＳｗｅｒｅｓｉｍｉｌａｒ．ＴｈｅＭｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｎｏｘａｐａｒｉｎｓｏｄｉｕｍ
ｏｆｓｔｅｐｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓａｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ｅｓｔｅｒｉｉｆｃａｔｉｏｎａｎｄｆｌ－ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｕｓｉｎｇｈｅｐａｒｉｎｓｏｄｉｕｍａｓｓｔａｒｔｉｎｇｍａｔｅｒｉａ１．ＵｓｉｎｇＥＰｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅ（ＣＲＳ）ｏｒｆＬＭＷＨａｓｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅ，ｔｈｅＭｒａｎｄｉｔｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ＥｎｏｘａｐａｒｉｎＳｏｄｉｕｍ
ＬＩＺｈｉ－ｍｉｎ，ＭＡＺｈｉ — ｈｕａ，ＤＵＸｕ— ｚｈａｏ，ＪＩＳｈｅｎｇ－ｌｉ
（ＨｅｂｅｉＣｈａｎｇｓｈａｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈｊｉｉａｚｈｕａｎｇ０５０８００，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓ（）ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｕｂｓｔａｎｃｅ（ＲＳ）ｗｉｔｈｂｒｏａｄｄｉｓｔｒｉｂ诺肝素钠宽分布相对分子质量（Ｍｒ）对照品。方法以肝素钠为起始原料，经过成
盐、酯化、ｐ．消除降解等步骤制各依诺肝素钠宽分布对照品；以欧洲药典低分子肝素（ＬＭＷＨ）Ｍｒ对照品
为对照，利用高效分子排阻色谱法（ＨＰＳＥＣ）测定自制依诺肝素钠宽分布对照品的及其分布，并与ＥＰ对照品比较。分别用自制对照品与ＥＰ对照品检测依诺肝素钠原料药的及其分布，并比较检测结果。结果自制
对照品与ＥＰ对照品的Ｕｖ图谱与ＲＪ图谱相近，及其分布接近，两种对照品测得依诺肝素钠及其分布接近。结论以ｐ．消除降解法制各的依诺肝素钠宽分布对照品可准确测定依诺肝素钠的及其分布，为不同ＬＭＷＨ
按各自生产工艺制备其对照品提供参考。