聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
第15章_聚合酶链式反应
1．Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min。现在人们又发现许多DNA聚合酶, 这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min， 掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 在100μl PCR反应中，1.5-2 U的Taq DNA聚合酶就足 以进行30轮循环。用的酶量可根据DNA、引物及其它因 素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性 增加，过少则使产量降低。
复性温度决定 与所用引物的长短与碱基组成，一般需要 通过实验来确定。
（三）DNA变性时间与终延伸时间
为了使模板DNA双链充分打开 ，开始时模板DNA变性 要适当延长，一般设预变性（predenature)94℃ 3~5min。一 般在扩 增完成后，PCR产物中可能含有长短不一的分子， 都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸（post extention），时间要保持在10 min左右，以获得尽可能完整 的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应终止 后，可以放到4 ℃中保存，以备电泳检测。
PCR的特点
灵敏度高
1.
2.
皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水 平
能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 4.
病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成 单位） 细菌检测的最小检出率为3个细菌 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活 组织等组织的粗提DNA
2
4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
PCR的基本原理
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
什么是PCR
什么是PCR？定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
编辑本段发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。
但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。
但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis 在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。
从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis 也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。
1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。
尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。
也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。
第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。
PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。
因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。
在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。
这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。
由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。
5.1 PCR技术原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。
它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。
聚合酶链式反应
定义（英文全称：Polymerase Chain Reaction），性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
编辑本段技术原理复制成同样的两分子挎贝。
在 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
编辑本段反应五要素 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR反应条件的选择 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
编辑本段酶及其浓度2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物5’端可加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有
适宜的酶切位点。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明
显同源性，Blast检索分析。
⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～0.5umol，以最低引物量产
生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性
13
dNTP的质量和浓度
PCR反应的原料，浓度在50-200μm/L,四 种dNTP要等摩尔配制
小量分装，-20℃冰冻保存
14
缓冲液和盐离子
Mg2+ 1.5-2.0mmol/L为宜，
Mg2+浓度过高，反应特异性降低；浓度过低反应产物减少
K+离子 50mmol/L为宜， 10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8)
6
PCR扩增产物
长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引
物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。
7
PCR的反应动力学
反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。
Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效 率，n代表循环次数。
反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式， 随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段 不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应”,即平台期
19
循环次数
循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环 次数主要取决于模板DNA的浓度。一般 的循环次数选在30左右，循环次数越多， 非特异性产物的量亦随之增多。
20
PCR扩增产物的分析
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼 脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰 胺凝胶971年Korana最早提出核酸体外扩增的 设想
1985年美国Mullis 等发明了具有划时代 意义的聚合酶链反应
1988年Saiki 等利用一种耐热DNA聚合酶， 实现了PCR技术的自动化
各种PCR技术的发展
4
PCR技术的基本原理
①模板DNA的变性：94℃热变性，使DNA双 链解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备；
活性(%)
100
110
100
118
107
82
100
53
11
100
82
17
100
86
39
105
10
〈0.1
12
模板(靶基因)核酸
宜用ng量级的克隆DNA,μg量级 的染色体DNA 或104拷贝的待扩增片段 PCR核酸标本来源广泛:纯培养的细胞或微生物， 血、尿、粪、体腔积液、漱口水，活检组织及石 蜡包埋组织等临床标本、血斑、精斑、毛发等标 本. 模板的纯度
9
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，避免5个以上的嘌呤或
嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别
是3‘端的互补，否则会形成引物二聚体。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要
②模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半 保留复制链
5
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可 获得更多的“半保留复制链”，而且这 种新链又可成为下次循环的模板。每完 成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能 将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction , PCR
1
PCR定义：指由一对引物介 导的基因或克隆的特定DNA 序列的酶促扩增的反应过程， 是DNA的体外扩增技术，本 质是DNA的体外复制。
2
PCR技术的优点
➢ 特异性强 ➢ 灵敏度高 ➢ 操作简单、省时 ➢ 对待检原始材料质量要求低 ➢ 高效率的基因扩增技术
扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
10
Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃
60核苷酸/S/酶分子
55℃
24核苷酸/S/酶分子
一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠 菌合成的基因工程酶。
其特性：5’ 3’聚合酶活性， 5’ 3’外切酶活性，无3’ 5’外切酶活性 酶量
GTTTGGCTGGTGTGGATC
18
③延伸温度与时间：
Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃
60核苷酸/S/酶分子
55℃
24核苷酸/S/酶分子
PCR反应的延伸常用温度为72℃，一般1Kb以 内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。
在循环反应结束后，再加一个总延伸时间，约 10min
11
其它化学物质对Taq DNA聚合酶活性的影响
变性剂 乙醇 尿素
DMSO DMF 甲酰胺 SDS
浓度 ≤3% 10% ≤0.5mol/L 1.0mol/L 1.5mol/L 2.0mol/L ≤1% 10% 20% ≤5% 10% 20% ≤1% 15% 20% 0.001% 0.01% 0.1%
15
PCR反应条件
温度 时间 循环参数
16
①变性温度与时间
93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性， 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败 的最主要原因之一。 在循环反应中一般 用 94℃ 30s,进行PCR循环前先94℃ 5min充分变性
17
②退火(复性)温度与时间
引物的复性温度可通过以下公式帮助选 择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T) 复性温度=Tm值-(5～10℃)
8
PCR反应体系
10×扩增缓冲液 10 μ l
4种dNTP混合物 各200 μ mol/L
引物
0.1-0.5μmol/L
模板DNA
0.1～2 μ g
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100 μ l
PCR反应体系五要素：㈠引物、 ㈡ 酶、 ㈢ dNTPs、 ㈣模板和㈤Mg2+