定量逆转录聚合酶链反应
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
实验方法 原理
• RT-PCR 技术
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是： 提取组织或细胞中的总 RNA，以其中的 mRNA 作为模板，采用 Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶 反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
展开
1．在实验过程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在总 RNA 的提取过程中，注意避免 mRNA 的断裂；
2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3．内参的设定：主要为了用于靶 RNA 的定量。常用的内参有 G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin （β-肌动蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量误差、加样误差以及各 PCR 反应体系中扩增效率不均 一各孔间的温度差等所造成的误差；
注意事项 其他
轻轻混匀，离心。42℃孵育 2-5 min；
4．加入 SuperscriptⅡ1 μl ，在 42℃水浴中孵育 50 min；
5． 于 70℃加热 15 min 以终止反应；
6．将管插入冰中，加入 RNase H 1 μl ，37℃孵育 20 min，降解残留的 RNA。-20℃保存备用。
三、PCR
1．取 0.5 ml PCR 管，依次加入下列试剂：第一链 cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游 引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
检测miRNA方法
检测miRNA方法
检测miRNA的方法主要有以下几种：
1. Northern blotting（北方印迹法）：通过RNA电泳分离和迁移，然后使用探针结合miRNA进行检测。
2. qRT-PCR（实时定量逆转录聚合酶链反应）：利用逆转录将miRNA转录为cDNA，然后使用PCR进行定量检测。
3. Microarray技术（芯片技术）：将已知的miRNA探针固定在芯片上，通过杂交检测待测miRNA。
4. Next-generation sequencing（下一代测序）：利用高通量测序技术，将小RNA转录本进行测序，然后通过比对和统计分析来确定miRNA的存在和表达水平。
5. 免疫细胞化学染色：利用抗体和荧光标记来检测miRNA的表达和定位。
6. 探针法：通过使用与目标miRNA互补的标记探针来检测miRNA。
这些方法各有优缺点，选择合适的方法需根据实验目的、预算、样本量等因素综合考虑。
逆转录聚合酶链式反应名词解释
逆转录聚合酶链式反应名词解释嘿，朋友！你知道逆转录聚合酶链式反应吗？这名字听起来是不是
特别高大上，让人有点摸不着头脑？其实啊，它就像是一个神奇的魔
法工具，能帮我们解开好多生物谜题呢！
比如说，我们想知道某个病毒在人体内到底有多活跃，或者研究一
种特殊基因在细胞里的表达情况，这时候逆转录聚合酶链式反应就派
上大用场啦！
它到底是咋工作的呢？简单来说，就是先把 RNA 逆转录成 DNA ，这就好比把一本外文的书翻译成我们熟悉的中文。
然后再通过聚合酶
链式反应，像复制工厂一样大量复制这些 DNA 。
这不就跟我们复印文
件一样，一下子就能得到好多好多的“副本”嘛！
想象一下，我们身体里的细胞就像一个巨大的城市，基因就是城市
里的居民。
逆转录聚合酶链式反应就像是一个超级侦探，能够精确地
找到我们想要了解的“居民”，然后把关于他们的信息大量地收集起来。
再比如说，科学家们研究癌症的时候，通过这个反应就能清楚地知
道哪些基因出了问题，从而找到治疗的办法。
这难道不神奇吗？
总之，逆转录聚合酶链式反应就是生物研究领域里的一把利剑，帮
助我们不断探索生命的奥秘！我觉得它真的太重要啦，你说呢？。
qpcr和rt pcr
qpcr和rt pcrqPCR（quantitative polymerase chain reaction，定量聚合酶链式反应）和RT-qPCR （reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，逆转录定量聚合酶链式反应）是分子生物学中常用的实验技术，用于检测和量化DNA或RNA的存在和表达水平。
qPCRqPCR是一种基于聚合酶链式反应的技术，它可以在短时间内扩增DNA序列并实现定量检测。
在qPCR中，首先通过特定引物和荧光探针选择性地扩增目标序列。
引物是短的DNA片段，它们与目标序列的两个末端完全匹配，起始和结束位点确定了扩增的目标片段。
荧光探针是带有荧光染料和荧光猝灭剂的标记物，它们可以与扩增产物结合，并且当发生扩增时，染料释放出的荧光信号可以被检测到。
为了进行定量检测，qPCR使用标准曲线法或比较阈值循环数（Ct value）法。
标准曲线法通过制备一系列已知浓度的标准品，然后使用这些标准品的Ct value绘制标准曲线。
接下来，测量样品的Ct value，并通过标准曲线确定目标序列的初始浓度。
比较阈值循环数法则是根据样品的Ct value与内部参照物（如内参基因）的Ct value进行比较，计算其相对表达水平。
qPCR广泛应用于生物医学研究和临床诊断中，例如检测某个基因在不同组织或病理状态下的表达水平，分析病毒或细菌感染的程度，以及评估药物的疗效等。
RT-qPCRRT-qPCR是在qPCR的基础上结合了逆转录反应（reverse transcription）的技术，用于检测和分析RNA的表达水平。
在RT-qPCR中，首先需要通过逆转录反应将RNA转录为互补的DNA（cDNA）。
逆转录反应使用逆转录酶将RNA作为模板合成互补的cDNA，逆转录过程中还需要引物，这些引物称为随机引物或特异性引物，用于引导逆转录酶的合成。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
1． 随机六聚体引物：当特定 mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长 序列时，可采用随机六聚体引物这一丌特异的引物来拷贝全长 mRNA。用此种方法时，体 系中所有 RNA 分子全部充当了 cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的 特异性。通常用此引物合成的 cDNA 中 96%来源于 rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对 mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞 mRNA 具有 3’端 Poly(A+)尾，此引物不其配对，仅 mRNA 可被转录。由于 Poly(A+)RNA 仅占总 RNA 的 1-4%，故此种引物合成的 cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的 cDNA 在数量和复杂性 方面均要小。 3． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标 RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物， 若 PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由不 mRNA 3’端最靠近的配对引物起 始。用此类引物仅产生所需要的 cDNA，导致更为特异的 PCR 扩增。 三、 试剂准备 1．RMA 提取试剂 2．第一链 cDNA 合成试剂盒 3．dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2mM 4．Taq DNA 聚合酶 四、操作步骤 1. 总 RNA 的提取：见相关内容。 2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种 cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同， 但 操 作 步 骤 丌 一 。 现 以 GIBICOL 公 司 提 供 的 SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
详细 实验方法
逆转录-聚合酶链反应实验方法 实验材料
组织或细胞样品 试剂、试剂盒
实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（RT
实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应 (RT姜红涛姚秀林抚顺市疾病预防控制中心，辽宁抚顺113006目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。
方法采用实时荧光定量RT-PC R及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法，同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。
结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份，实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份，χ2=8.1， P 0.005。
结论通过该实验，验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感，适用于实验室快速诊断。
教关键词实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应；细胞培养法；流感病毒R4 A 1674-074２（２０１5）03（b）－０192-02 姜红涛（1965-），女，天津人，本科，主管检验师，主要从事病毒检验工作。
2017年出现的流感病毒H7N9经自然重配，致病迅速，易变异，给人们带来极度恐慌，引起WH O 的高度重视，从而使流感病毒病原学的准确快速诊断显得尤为重要。
该实验室在2017年1月采用整群抽样法对抚顺市流感监测哨点医院的80份疑似流感样标本进行了实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（R T-PCR）法与细胞培养法进行了检测流行性感冒病毒的方法比较，现报道如下。
1资料与方法 1.1一般资料2017年1月在抚顺市国家级流感监测哨点医院，每周采集内科和儿科门诊就诊的流感样病例（体温≥38℃，同时伴有咳嗽或者咽喉疼痛等症状的急性呼吸道感染者）的咽拭子标本，放人pH7．4-7．6的DM EM采样液中，当日低温送流感实验室检测，每周采集20份流感样病例的咽拭子标本。
【江苏省自然科学基金】_定量逆转录聚合酶链反应_期刊发文热词逐年推荐_20140816
科研热词 预后 逆转录聚合酶链反应 运动训练 转化生长因子β 1 脂蛋白脂酶 肉芽肿 缺氧 白血病,淋巴细胞,慢性,b细胞 白血病 环磷酰胺 淋巴细胞 水迷宫 日本血吸虫 慢性 惊厥 小鼠 埃他卡林 免疫调节 人肺动脉平滑肌细胞 β 细胞 zn~(2+)转运体-3 atp敏感性钾通道
推荐指数 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
科研热词 推荐指数 阳性和阴性症状量表 1 腹主动脉瘤 1 耐药株 1 精神分裂症 1 白念珠菌 1 生物被膜 1 微小rna-494 1 多巴胺质膜转运蛋白质类 1 基质金属蛋白酶-2 1 基因表达 1 基因治疗 1 受体,多巴胺d2 1 前列腺癌 1 丹参酮 1 一氧化氮合酶 1 xog1 1 survivin 1 bgl2 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7
科研热词 红斑狼疮 系统性 抗核 抗体 小分子干扰 rna oaz信号通路
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2011年 科研热词 解整合素-金属蛋白酶8 荧光定量聚合酶链反应 结直肠癌 增殖细胞核抗原 埃他卡林 冬凌草甲素 人肺动脉平滑肌细胞 乳腺癌 atp敏感性钾通道 ap-1 推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2014年 科研热词 预后 肺肿瘤 基因表达 微小rna-145 mirna-221 推荐指数 2 2 2 1 1
2013年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
科研热词 推荐指数 预后 1 钛颗粒 1 过氧化物酶体增殖激活受体γ 1 胃癌 1 破骨细胞 1 炎症 1 微小rna-181b 1 微小rna 1 大麻素受体2 1 分子分型 1 乳腺癌 1
检测目的基因是否转录的方法
要检测目的基因是否转录（即是否在细胞中产生RNA分子），可以使用以下方法：
RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）：这是一种常用的方法，它将RNA转录为相应的互补DNA （cDNA），然后使用聚合酶链反应（PCR）扩增cDNA。
通过选择特定的引物，可以检测目的基因的转录水平。
RT-PCR可以定量或半定量地测量转录水平。
实时定量PCR（qPCR）：这是一种通过测量PCR反应的实时增长曲线来定量目的基因的转录水平的方法。
它结合了逆转录和PCR反应，可以在实时中监测PCR产物的累积。
根据PCR 产物的数量，可以计算出目的基因的转录水平。
Northern印迹分析：这种方法使用电泳将RNA样品分离，并将其转移到膜上，然后使用与目的基因序列互补的探针进行杂交。
这可以检测目的基因的RNA分子，并确定其存在与否以及相对丰度。
RNA测序：通过高通量RNA测序技术，可以对细胞中的RNA进行全面的测序，包括目的基因的转录产物。
这种方法可以提供关于目的基因转录水平的详细信息，并可用于检测整个转录组的变化。
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定量逆转录聚合酶链反应
定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，用于检测RNA的表达水平。
该技术包括两个步骤：逆转录反应和聚合酶链反应。
首先，通过逆转录酶将RNA转录成cDNA（反转录过程），然后使用DNA聚合酶扩增cDNA。
通过纳米量热法分析PCR 反应几率，可以定量分析样品中RNA的表达水平。
qRT-PCR技术具有高灵敏度，高特异性和较高的准确性。
与传统的聚合酶链反应（PCR）相比，qRT-PCR技术可以在更短的时间内得到更加准确的结果。
此外，它的操作简化了DNA 净化和定量，同时也避免了自发的DNA降解，使检测结果更加准确。
首先，需要合成一个逆转录引物的混合物，用于RNA转录成cDNA。
当这个组合物加入RNA样品中时，引物会与RNA序列配对并将其反转录成cDNA。
在该过程中，逆转录酶还需要加入两个重要的酶：RNA酶抑制剂和dNTP混合物。
RNA酶抑制剂可以预防RNA酶扩大反转录过程，而dNTP混合物是用于扩大cDNA的。
在RNA转录成cDNA之后，需要进行PCR扩增反应。
这个过程中，需要加入引物和标志性的探针。
引物即为PCR中的引物，被用于扩大cDNA，而标志性的探针则被用于量化PCR 产物。
这样就可以精确计算RNA表达水平。
标志性的探针通常是由一个荧光染料和一个探针组成。
当PCR反应产生荧光时，可以通过纳米量热法来计算PCR反应对应的RNA表达水平。
qRT-PCR技术有很多应用。
例如，在癌症研究中，研究人员可以通过qRT-PCR技术来优化治疗期间所用的化学药物剂量，以便最大限度地减少每次治疗的副作用。
同时，研究人员还可以通过qRT-PCR技术来研究修饰因子（例如过度表达或下调的基因），这些基因在癌症细胞中表现出类似于正常细胞的痕迹。
qRT-PCR技术也可以应用于病毒检测，检测外科标本中的微量染色体异常等等。
总之，qRT-PCR技术是一种高效，可靠且高灵敏度的分子生物学技术，可用于精确的RNA表达水平分析。
此外，它是一种流行的实验室技术，可用于多种生物学方面的研究，如细胞生物学，分子生物学，医学生物学等等。