1聚合酶链式反应(PCR)
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1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等；
2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
2
二、PCR 反应系统的组成
22
PCR
23
原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（ 90-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两 条单链DNA模板；而后在低温（35～65℃）情况下， 两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板 结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃） 下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料， 沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每 一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个 步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复 进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环 的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数 形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基 因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
19
7、PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一 般是循环次数过多，非特异性背景严重， 复杂度增加。当然循环反应的次数太少， 则产率偏低。所以，在保证产物得率前提 下，应尽量减少循环次数。
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三、PCR扩增过程
在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、 四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及 两个合成DNA引物，并有Mg2+ 存在。其循环的温 度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶 的耐热性。
➢加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过
95℃。
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（4）模板核酸的量与纯度
➢PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法 通常采用SDS处理标本。 ➢SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核 蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀。 ➢用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 ➢RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要 防止RNase降解RNA。
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（2）dNTP与PCR反应
➢ 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的
活性。 ➢ 使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时 核苷酸错误掺入。 ➢ 高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降 低反应物的产量。 ➢ PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其 中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会 引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量，或过早 终止反应。
4
（1）引物的设计
1. 长度最高不超过30个核苷酸，最佳长度为15～25个 核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列， 如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆 和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外 的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。
2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端， 即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱 基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” （Primer dimer）。
过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下 降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错 配，非特异性产物增加。一般实验中退火温度 Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解 温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式 进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典 型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒 即可完成。
10
2、寡核苷酸（dNTP）
（1）dNTP的质量与浓度
➢dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生 物学活性。 ➢dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节 到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。 ➢多次冻融会使dNTP降解。 ➢dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
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3、Taq DNA聚合酶
➢ Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来 的。 ➢催化一典型的PCR所用酶量为2U。常用范围为1～ 4U/100μl。 ➢由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件 的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致 非特异产物的增加。
13
4、模板(靶基因)核酸
21
(1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下 （90-95 ℃ ）变性，双链解链；
(2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物 在低温（35-65℃,一般低于模板Tm值的 5℃左右），与模板DNA互补退火形成 部分双链；
(3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72℃)， 在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物 为复制起点，模板DNA的一条双链在解 链和退火之后延伸为两条双链。
Taq DNA polymerase: 0.5 l(5U/l)
10×buffer（Mg+）: 5 l
ddH2O:
37.5l
50 l
26
PCR条件：
94℃变性5min后开始以下循环
• 94℃变性反应45 sec； • 65℃退火反应45 sec； • 72℃延伸反应1 min； • 进行30个循环； • 最后72℃反应7min； • 4 ℃冷却恒定。
7
（2）引物的浓度
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μM（或10～100pmol）之间。浓度过高易 形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般 来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低， 不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
8
（3）引物退火温度 决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但
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四、实验仪器及材料
PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离 心管、凝胶电泳系统等 TaKaRa Taq (5U/ l) 10×PCR Buffer (Mg2+ Plus) dNTP Mixture (each 10mM or 2.5mM) 模板 (10ng) 引物（Primer 1 and 2, 10 M)
（1）模板的种类 ➢单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。 ➢若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条 cDNA。 ➢用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但 在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接 用做模板。 ➢当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时， 如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果 会更好。
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6、PCR缓冲液
➢用 于 PCR的 标 准缓 冲 液为 10 ～ 50mM 的 Tris – HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。 ➢在72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位， 接近于7.2。 ➢二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异 性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无 任何作用。 ➢首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓 度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。
10× PCR Buffer： (100 mM Tris-HCl, pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)
25
PCR Mixture:
Template DNA:
1 l (10ng)
Primer 1:
1 l (10M)
Primer 2:
1 l (10M)
dNTPs:
4 l (2.5mM)
14
（2）模板的用量 虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自
单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应 用ng级的DNA。
15
（3）模板变性温度 ➢它决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不 到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就 不会启动。 ➢变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复 性，因而减少产量。一般取90～95℃。 ➢样 品 一 旦 到 达 此 温 度 宜 迅 速 冷 却 到 退 火 温 度 。 DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之， 在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活 力。
6
5、Tm 值高于55C 。Tm允许的范围内选择较高的退火温度可 大大减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR的特异性。
6、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对。
7、引物扩增跨度以300-500碱基为宜。 8、引物的特定性，引物应与核苷酸序列数据库的其它序列物
有明显同源性。
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5、Mg2+浓度
➢ Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。 ➢在 一 般 的 PCR 反 应 中 ， 各 种 dNTP 浓 度 为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 ➢Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反 应产物减少。
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（4）引物延伸温度 ➢取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～ 75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达 35～100个核苷酸/秒。 ➢每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲 溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。 ➢根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温 度。 ➢对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延 伸时间控制在1～7min。
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五、PCR产物分析
取3-5l PCR产物，采用1.2％ 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 的量、引物扩增的特异性。并 可根据标准DNA的量粗略计算 PCR产物的总量。
28
PCR结果：
3.0kb
0.8kb
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第一章 生物转化的基因工程原理 第一节 聚合酶链式反应(PCR)
多 聚 酶 链 式 反 应 (Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是一种对特定的DNA片段在体外 进行快速扩增的方法。
1
一、PCR 的特点及应用
PCR操作简便、省时；灵敏度高；对原始材料的质和 量要求低；特异性强。因此，广泛应用于许多领域。
PCR反应系统的组成主要包括：
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、
模板DNA、缓冲液、水。
3
1、引物
➢要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物, 实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷 酸片段。 ➢两引物间距离决定扩增片段的长度。 ➢两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。 ➢引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关 键。 ➢引物设计十分重要。
3. (G+C）%含量：引物的组成应均匀，尽量避免含有 相同的碱基多聚体，45%-55%为宜。 G+C太少扩增 效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好 随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。
4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是 发夹结构（hairpin structures）。
2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
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二、PCR 反应系统的组成
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PCR
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原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（ 90-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两 条单链DNA模板；而后在低温（35～65℃）情况下， 两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板 结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃） 下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料， 沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每 一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个 步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复 进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环 的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的 DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数 形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基 因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
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7、PCR循环次数 常规PCR循环次数一般为25～40个周期。一 般是循环次数过多，非特异性背景严重， 复杂度增加。当然循环反应的次数太少， 则产率偏低。所以，在保证产物得率前提 下，应尽量减少循环次数。
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三、PCR扩增过程
在微量离心管中加入适量缓冲液、微量模板DNA、 四种脱氧单核苷酸（dNTP）和耐热Taq聚合酶及 两个合成DNA引物，并有Mg2+ 存在。其循环的温 度取决于引物的Tm值、模板的种类以及聚合酶 的耐热性。
➢加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过
95℃。
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（4）模板核酸的量与纯度
➢PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法 通常采用SDS处理标本。 ➢SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质， 因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核 蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀。 ➢用乙醇或异丙醇沉淀核酸。 ➢RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要 防止RNase降解RNA。
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（2）dNTP与PCR反应
➢ 在PCR反体系中,dNTP终浓度高于50mM会抑制Taq酶的
活性。 ➢ 使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时 核苷酸错误掺入。 ➢ 高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度太低，势必降 低反应物的产量。 ➢ PCR常用的浓度为50～200μM，不能低于10～15μM。 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其 中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会 引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量，或过早 终止反应。
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（1）引物的设计
1. 长度最高不超过30个核苷酸，最佳长度为15～25个 核苷酸。有时可在5’端添加不与模板互补的序列， 如限制性酶切位点或增强因子等，以完成基因克隆 和其它特殊需要，但要在酶切位点的5‘端加上额外 的3－4个核苷酸，以确保附加的酶切位点有效。
2. 两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端， 即使无法避免，其3’端互补碱基也不应大于2个碱 基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体” （Primer dimer）。
过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下 降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错 配，非特异性产物增加。一般实验中退火温度 Ta(annealing temperature)比扩增引物的融解 温度Tm(melting temperature)低5℃，可按公式 进行粗略计算： Ta = Tm - 5℃= 4(G+C) + 2(A+T) -5℃ 其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。在典 型的引物浓度时（如0.2μmol/L）,退火反应数秒 即可完成。
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2、寡核苷酸（dNTP）
（1）dNTP的质量与浓度
➢dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生 物学活性。 ➢dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后， 以1M NaOH或1M Tris HCL的缓冲液将其PH调节 到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。 ➢多次冻融会使dNTP降解。 ➢dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
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3、Taq DNA聚合酶
➢ Taq DNA聚合酶最早是从嗜热水生菌中提纯出来 的。 ➢催化一典型的PCR所用酶量为2U。常用范围为1～ 4U/100μl。 ➢由于DNA模板的不同和引物不同，以及其它条件 的差异，聚合酶的用量亦有差异，酶量过多会导致 非特异产物的增加。
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4、模板(靶基因)核酸
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(1)变性阶段 加热使模板DNA在高温下 （90-95 ℃ ）变性，双链解链；
(2)退火阶段 降低溶液温度，使合成引物 在低温（35-65℃,一般低于模板Tm值的 5℃左右），与模板DNA互补退火形成 部分双链；
(3)延伸阶段 溶液反应温度升至中温(72℃)， 在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物 为复制起点，模板DNA的一条双链在解 链和退火之后延伸为两条双链。
Taq DNA polymerase: 0.5 l(5U/l)
10×buffer（Mg+）: 5 l
ddH2O:
37.5l
50 l
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PCR条件：
94℃变性5min后开始以下循环
• 94℃变性反应45 sec； • 65℃退火反应45 sec； • 72℃延伸反应1 min； • 进行30个循环； • 最后72℃反应7min； • 4 ℃冷却恒定。
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（2）引物的浓度
引物在PCR反应中的浓度一般在0.1～ 1μM（或10～100pmol）之间。浓度过高易 形成引物二聚体且产生非特异性产物。一般 来说用低浓度引物经济、特异，但浓度过低， 不足以完成30个循环的扩增反应，则会降低 PCR的产率。
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（3）引物退火温度 决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但
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四、实验仪器及材料
PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离 心管、凝胶电泳系统等 TaKaRa Taq (5U/ l) 10×PCR Buffer (Mg2+ Plus) dNTP Mixture (each 10mM or 2.5mM) 模板 (10ng) 引物（Primer 1 and 2, 10 M)
（1）模板的种类 ➢单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。 ➢若起始材料是RNA，须先通过逆转录得到第一条 cDNA。 ➢用质粒作模板时，线性化的比环状的效果好，但 在实际操作中，往往不需要将质粒线性化，而直接 用做模板。 ➢当使用高分子量的DNA（如基因组DNA）做模板时， 如果用适当的酶先进行消化再作为模板，扩增效果 会更好。
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6、PCR缓冲液
➢用 于 PCR的 标 准缓 冲 液为 10 ～ 50mM 的 Tris – HCl缓冲液（pH8.3）和1.5mM MgCl2。 ➢在72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位， 接近于7.2。 ➢二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异 性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无 任何作用。 ➢首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓 度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。
10× PCR Buffer： (100 mM Tris-HCl, pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2)
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PCR Mixture:
Template DNA:
1 l (10ng)
Primer 1:
1 l (10M)
Primer 2:
1 l (10M)
dNTPs:
4 l (2.5mM)
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（2）模板的用量 虽然PCR可以仅用极微量的样品，甚至是来自
单一细胞的DNA，但为了保证反应的特异性，还应 用ng级的DNA。
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（3）模板变性温度 ➢它决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不 到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就 不会启动。 ➢变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复 性，因而减少产量。一般取90～95℃。 ➢样 品 一 旦 到 达 此 温 度 宜 迅 速 冷 却 到 退 火 温 度 。 DNA变性只需要几秒种，不需要时间过久；反之， 在高温时间应尽量缩短，以保持DNA聚合酶的活 力。
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5、Tm 值高于55C 。Tm允许的范围内选择较高的退火温度可 大大减少引物和模板的非特异性结合，提高PCR的特异性。
6、引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格 要求配对。
7、引物扩增跨度以300-500碱基为宜。 8、引物的特定性，引物应与核苷酸序列数据库的其它序列物
有明显同源性。
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5、Mg2+浓度
➢ Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。 ➢在 一 般 的 PCR 反 应 中 ， 各 种 dNTP 浓 度 为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 ➢Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反 应产物减少。
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（4）引物延伸温度 ➢取决于DNA聚合酶的最适温度。一般取70～ 75℃，在72℃时酶催化核苷酸的标准速率可达 35～100个核苷酸/秒。 ➢每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于缓冲 溶液的组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。 ➢根据扩增片段长度的不同来设计引物延伸的温 度。 ➢对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延 伸时间控制在1～7min。
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五、PCR产物分析
取3-5l PCR产物，采用1.2％ 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物 的量、引物扩增的特异性。并 可根据标准DNA的量粗略计算 PCR产物的总量。
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PCR结果：
3.0kb
0.8kb
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第一章 生物转化的基因工程原理 第一节 聚合酶链式反应(PCR)
多 聚 酶 链 式 反 应 (Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是一种对特定的DNA片段在体外 进行快速扩增的方法。
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一、PCR 的特点及应用
PCR操作简便、省时；灵敏度高；对原始材料的质和 量要求低；特异性强。因此，广泛应用于许多领域。
PCR反应系统的组成主要包括：
引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、
模板DNA、缓冲液、水。
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1、引物
➢要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物, 实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷 酸片段。 ➢两引物间距离决定扩增片段的长度。 ➢两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。 ➢引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关 键。 ➢引物设计十分重要。
3. (G+C）%含量：引物的组成应均匀，尽量避免含有 相同的碱基多聚体，45%-55%为宜。 G+C太少扩增 效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好 随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列。两个引物中（G+C）%含量应尽量相似。
4. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是 发夹结构（hairpin structures）。