聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
聚合酶链式反应
示例电泳结果
1 2 3 4 5 M
M：DNA marker
1：为阳性对照
2：为阴性对照
3-5：为扩增出的DNA条带
实验注意事项
1. EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套,
并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器 或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的实验垃 圾需专门回收处理。 2. 观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有 切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并 采 用 长 波 长 紫 外 灯 (300-360nm ） ， 以 减 少 紫 外 光 切 割 DNA。 每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上
PCR反应条件：
94 ℃ 3min
94℃ 50℃ 72℃
72℃
30sec 30sec 80sec Cycle 40
10min
注：根据实际情况可调整退火温度，变性时间，退火时 间等参数
PCR反应步骤
1.按PCR扩增体系将反应物一一加入，混合均匀。 2. 根据计算好的PCR反应条件为实验用PCR仪设定反应程序。 3. 反应结束后，电泳检测反应产物及长度。 4. PCR产物的纯化 （酚/氯仿法） ① 取反应产物加100μLTE。 ② 加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15s, 用 ③ 移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次, 可除 去覆盖在表面的矿物油。 ④ 再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次, 每次回收上层水相。 ⑤ 在水相中加300μL95％乙醇, 置-20℃下30min沉淀。 ⑥ 在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入 1mL70％乙醇，稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将 沉淀溶于7mL ddH2O 中，待用。
第15章_聚合酶链式反应
1．Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃ 5min。现在人们又发现许多DNA聚合酶, 这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30 min， 掺入10 nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 在100μl PCR反应中，1.5-2 U的Taq DNA聚合酶就足 以进行30轮循环。用的酶量可根据DNA、引物及其它因 素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性 增加，过少则使产量降低。
复性温度决定 与所用引物的长短与碱基组成，一般需要 通过实验来确定。
（三）DNA变性时间与终延伸时间
为了使模板DNA双链充分打开 ，开始时模板DNA变性 要适当延长，一般设预变性（predenature)94℃ 3~5min。一 般在扩 增完成后，PCR产物中可能含有长短不一的分子， 都需要一步长时间的延伸反应，称为终延伸（post extention），时间要保持在10 min左右，以获得尽可能完整 的产物，这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。反应终止 后，可以放到4 ℃中保存，以备电泳检测。
PCR的特点
灵敏度高
1.
2.
皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水 平
能从100万个细胞中检出一个靶细胞
3. 4.
病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成 单位） 细菌检测的最小检出率为3个细菌 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活 组织等组织的粗提DNA
2
4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824
PCR的基本原理
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
PCR原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶耐热DNA聚合酶--Taq酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
什么是PCR
什么是PCR？定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），聚合酶链式反应具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
编辑本段发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。
但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。
但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis 在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。
从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis 也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。
1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。
尔后，Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶，使得PCR技术的扩增效率大大提高。
也正是由于此酶的发现使得PCR技术得到了广泛地应用，使该技术成为遗传与分子生物学分析的根本性基石。
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实验9 聚合酶链式反应（PCR）技术
【实验目的】
掌握PCR反应的原理及操作技术。
【实验原理】
PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。
PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。
反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。
以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。
【器材与试剂】
1．器材
DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统
2．材料
模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。
3．试剂
(1) 10×PCR 缓冲液
(2) MgCl2 15mmol/L
(3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L
(4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl
(5) 引物1和引物2：2 μmol/L
(6) 琼脂糖凝胶电泳试剂
【操作步骤】
1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl
10×PCR 缓冲液 2 μl
MgCl2（15mmol/L） 2 μl
dNTP（2.5mmol/L） 2 μl
引物1 (2μmol/L) 2 μl
引物2 (2μmol/L) 2 μl
模板DNA 2 μl
Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl
总体积20 μl
2．按下述循环程序进行扩增
程序阶段程序名称温度时间循环数
1 预变性94℃ 3 min 1
变性94℃30 sec
2 退火52℃30 sec
30
延伸72℃30 sec
3 保温4℃∞ 1
3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。
【要点提示】
1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。
一般94~95℃下30~60sec。
时间过长使TaqDNA聚合酶失活。
2．退火温度一般在45~55℃。
退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。
3．延伸温度一般在70~75℃。
此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。
一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。
当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
4．引物长度通常用20bp左右。
两个引物扩增的片段大小300~500bp为宜。
【思考题】
1、PCR反应的原理是什么？
2、如何确定PCR反应中的退火温度和延伸时间？。