聚合酶链式反应原理

• 1.Oligo(dT)18 ： 能与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异 性结合，适合真核生物mRNA的转录,尤其是新鲜的组织或 细胞，当所提取的RNA片段长度小于2kb,无复杂三级结构
• 随机六聚体引物：适用于mRNA内含抑制反转录酶活性的 终止序列，适合提取无Poly(A)尾巴的RNA、石蜡和破碎 组织内提取的RNA，特别是当提取片段超过2kb，内部有 复杂的三级结构的，
• 标准曲线分析法
-学术活动-
unknown
104 103
相对定量分析
-学术活动-
无需制备标准品(2 -ΔΔc(t) 法)，但需要内参照基因， 且要求内参与目的基因扩增效率相近。
内参Ct值=15-14=1，21=2； 基因A: delta CT=20-18=2，22=4。 但是由于加样量是2倍，所以4/2=2，最后的相对 量是2倍
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’ 5’ 3’
5’ 3’
3’
循环3 X3个拷贝
-学术活动-
PCR反应模式
普通PCR结果分析
-学术活动-
荧光定量PCR
-学术活动-
3’
5’
退火
5’
3’
3’
ID
ID
Taq
5’
5’
Taq
ID
ID
ID
3’
l
3’
ID
l ID
l ID
Taq
ID
ID
l l
Taq 5’
3’
聚合酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
常立功 2014-09-29
-学术活动-
• PCR的起源与发展 • PCR基本原理 • 普通PCR过程与分析 • 荧光定量PCR过程与分析
-学术活动-
• PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无 论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶 杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一 丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是 “微量证据”的威力之所在。
延伸 检测激发的荧光
Q 5’
Q 5’
Q 5’
Taq
5’
Taq
5’
R
R
Taq
R
Taq
R
l
R
3’
退火
1. 链取代
3’
5’
2. 水 解
3’
5’
3. 聚 合
3’
5’
4. 检测荧光
3’
• 标准曲线分析法
-学术活动-
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
-学术活动-
• 现代实验室大多使用RT-PCR技术检测某个 基因的表达。
• 逆转录（Reverse Transcription RT）是将 RNA转录成cDNA的过程。
• 为什么要进行逆转录？ • 为什么要提取RNA而非DNA？
逆转录示意图
-学术活动-
逆转录体系
-学术活动-
逆转录引物区别
-学术活动-
-学术活动-
• 1953年，DNA被发现是细胞里携带遗传信息的分 子。
• 1956年，第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合 酶（此时的基因扩增仅在实验室，小规模的扩增， 操作繁复，成本高）。
• 1973年，台湾人钱嘉韵在黄石公园里热泉中发现 的嗜热菌中并分离出耐热的Taq聚合酶。
• 1984年，美国人K. Mullis (穆里斯 )和日本人才木 共同奠定了现代PCR技术的基础，使PCR技术进 入普通实验室，前者在1993年获得诺贝尔化学奖
• 特异性引物：用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更 为特异的PCR扩增。
普通PCR反应体系
-学术活动-
3’ 5’
3’
Taq
5’
退
火Leabharlann Baidu
3’
5’
Taq
延
伸
3’
重复
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’
循环2 X2个拷贝
5’ 3’ 5’ 3’
• DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行 分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单 方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成单股，等 温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然 DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白 质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为 这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中， 以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进 行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理 由。