聚合酶链式反应原理
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
q-pcr原理
q-pcr原理
qPCR（定量聚合酶链式反应）是一种基于PCR原理的技术，可以高度灵敏地检测和扩增DNA分子。
qPCR可以量化起始DNA模板的数量，因此也称为实时PCR（RT-PCR）。
qPCR原理基于利用DNA聚合酶酶的活性和荧光探针的高特异性。
在qPCR反应中，DNA聚合酶酶通过PCR扩增DNA的特定序列，在反应过程中荧光探针结合到扩增的DNA序列上，并通过激发荧光产生荧光信号。
qPCR反应过程中荧光信号的增加量与PCR产物（即扩增的DNA序列）的数量成正比。
因此，量化荧光信号可以确定PCR产物的数量，从而对起始DNA模板的数量进行定量分析。
qPCR常用于基因表达分析，DNA测序、病原体检测等领域。
pcr反应的原理及应用
PCR反应的原理及应用1. PCR反应的原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用于扩增DNA片段的分子生物学技术。
它是由美国生物学家基里尔·穆利斯（Kary B. Mullis）于1985年发明的，因其对遗传学研究的重大贡献，穆利斯也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR反应主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
1.1 变性首先，将待扩增的DNA样本加热至95摄氏度，使DNA双链解开成两条单链，即变性。
这一步骤通常在PCR反应仪中进行，通过高温条件打开DNA的双链结构。
1.2 退火之后，将反应温度降至适宜的缩合温度（通常为50-60摄氏度），引入一对特异性引物和DNA聚合酶。
这对引物会在DNA的两个单链的特定位置上结合，并作为DNA复制的起始点。
1.3 延伸在引物的指导下，DNA聚合酶开始沿着DNA模板链合成新的互补链，形成两个新的DNA双链。
该过程称为延伸。
延伸的温度通常在50-70摄氏度之间，取决于DNA聚合酶的活性和反应条件。
PCR反应分别经历变性、退火和延伸的循环，每一个循环都会使DNA扩增一倍。
通过多次循环，可以迅速扩增起始DNA序列，达到数百万倍的增加。
2. PCR反应的应用PCR反应在生命科学研究、医学诊断和法医学等领域有着广泛的应用。
2.1 基因分型PCR反应可以帮助对基因进行分型，即判断基因存在与否及其类型。
例如，通过PCR反应可以检测与特定疾病相关的基因突变，用于遗传病诊断和治疗。
2.2 DNA克隆和定向突变PCR反应能够扩增DNA片段，并将其导入质粒或其他载体中，用于DNA克隆和定向突变等实验研究。
通过PCR反应扩增DNA片段，可以快速获得大量目标DNA。
2.3 重组DNA构建PCR反应可以使用限制性内切酶切割DNA，并在特定位置导入目标基因片段。
随后，通过PCR反应对目标基因进行扩增，并将其导入重组DNA中。
2.4 检测病原体PCR反应在检测病原体方面也有着重要的应用。
聚合酶链式反应PCR(Polymerase Chain Reaction)原理、特点与分类
聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction）目录聚合酶链式反应PCR（Polymerase Chain Reaction） (1)发展简史 (2)技术原理 (2)工作原理 (3)反应特点 (3)特异性强 (3)灵敏度高 (4)简便、快速 (4)对标本的纯度要求低 (4)PCR反应的分类 (4)SOEing-PCR（重叠PCR）： (4)RT-PCR（逆转录PCR）： (5)简称PCR。
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引发展简史人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。
但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。
但是，当时的基因序列分析方法尚未成熟，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段，这种想法似乎没有任何实际意义。
1985年，美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发下，经过两年的努力，发明了PCR 技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。
从此，PCR技术得到了生命科学界的普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。
但是，最初的PCR技术相当不成熟，在当时是一种操作复杂、成本高昂、“中看不中用”的实验室技术。
1988年初，Keohanog通过对所使用的酶的改进，提高了扩增的真实性。
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应的原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种在分子生物学领域中广泛应用的技术，其原理是通过体外扩增DNA片段，从而获得足够数量的特定DNA序列。
PCR技术的发明极大地推动了分子生物学和遗传学研究的发展，它成为了现代生物学研究中不可或缺的工具。
PCR技术的原理非常简单，它主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将待扩增的DNA样本加热至95摄氏度，使双链DNA 变性成两个单链。
接着，将温度降低至50-65摄氏度，引入引物（即PCR反应中的两个端点）与单链DNA互相结合，使引物能够特异性地与待扩增的DNA片段结合。
最后，将温度升高至72摄氏度，加入DNA聚合酶酶解体，开始延伸新的DNA链。
这样，经过多个循环，就可以在短时间内扩增出大量目标DNA。
PCR技术之所以能够高效地扩增DNA片段，是因为它利用了DNA 聚合酶的特殊性质。
DNA聚合酶是一种具有高度稳定性和高度特异性的酶，它能够在适宜的温度下，通过模板引导合成新的DNA链。
在PCR反应中，DNA聚合酶扮演着关键的角色，它能够识别引物与单链DNA的结合部位，并在引物的引导下合成新的DNA链。
通过不断循环变性、退火和延伸的步骤，PCR技术可以在短时间内扩增出数百万数量级的目标DNA片段。
PCR技术的应用非常广泛，尤其在基因检测、疾病诊断和法医学鉴定等领域具有重要意义。
例如，在基因检测中，PCR技术可以用于检测某些基因的突变，从而帮助科学家了解某种遗传疾病的发病机制。
在疾病诊断中，PCR技术可以通过检测特定病原体的DNA片段，快速确定病情，提高诊断的准确性。
在法医学鉴定中，PCR技术可以通过检测受害者和嫌疑人的DNA，快速确定是否存在亲缘关系，为司法鉴定提供科学依据。
除了在实验室中的应用，PCR技术还有许多其他的衍生技术。
例如，实时荧光PCR技术可以实时监测PCR反应的进程，通过荧光信号的强度变化来定量检测目标DNA的含量。
PCR扩增的原理和步骤
PCR扩增的原理和步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的方法，通过PCR可以快速、高效地扩增DNA的特定片段。
PCR的原理和步骤可以总结为以下几点：1.PCR的原理：PCR的核心原理是通过一系列的温度循环，在DNA的两个末端反复合成新的DNA链。
PCR反应需要引物、DNA模板、聚合酶和适当的反应缓冲液。
2.PCR的步骤：(1) Denaturation（变性）：PCR反应开始时，将反应管中的温度升至94-96摄氏度，使DNA的两个链分离。
这一步称为变性，需要高温来使DNA的双链解开。
(2) Annealing（退火）：将反应管中的温度降至50-65摄氏度，并加入引物和核苷酸。
引物是一小段特异性的DNA片段，通过与DNA模板的互补序列结合，使引物与DNA模板的末端碱基对齐。
引物的选择非常重要，因为它们决定了所扩增的DNA片段的大小和特异性。
(3) Extension（延伸）：将反应管中的温度升至72摄氏度，加入聚合酶和足够的核苷酸，聚合酶会在模板DNA上从引物上启动，向模板的末端合成新的DNA链。
这个步骤的持续时间取决于所扩增DNA片段的长度，通常是1-2分钟。
上述的三个步骤组成了一个完整的PCR循环。
在进行PCR反应时，需要重复进行多个PCR循环，每个循环可以产生2倍于上个循环的DNA分子。
3.PCR的优点：PCR具有以下几个优点：(1)高度特异性：PCR使用引物的互补序列对目标DNA进行扩增，因此可以高度特异性地扩增目标DNA片段。
(2)高度敏感性：PCR可以在很少的DNA模板下扩增目标DNA片段，从而实现对微量DNA的检测。
(3)高效性：PCR可以在短时间内扩增目标DNA的数量，大大提高了DNA扩增的效率。
(4)灵活性：PCR可以扩增任何类型的DNA序列，包括基因组DNA、cDNA、RNA等。
4.PCR的应用：PCR在许多领域都有广泛的应用，包括：(1)分子生物学研究中的DNA克隆和测序。
dna聚合酶链式反应的原理
dna聚合酶链式反应的原理DNA聚合酶链式反应：从原理到应用DNA聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种用来扩增DNA分子的技术。
PCR技术的出现，让繁琐的DNA扩增工作变得简单快捷，从而推动了分子生物学、医学等领域的迅速发展。
PCR原理简介PCR技术的基础是DNA的双链结构，以及DNA聚合酶的作用。
PCR分为三步：变性、退火和延伸。
变性：将待扩增的DNA样品加热至90-95℃，使其双链分离成两条单链，即变性。
退火：降温至50-60℃，加入PCR引物，使其与待扩增DNA序列互相补合，即退火。
延伸：加入DNA聚合酶和四种dNTP，使引物沿着单链DNA模板向3'端延伸，形成一条新的DNA链，即延伸。
如此反复进行三步操作，可使DNA分子不断扩增，形成指数级增长。
PCR的应用PCR技术已广泛应用于基础研究、临床诊断、法医学鉴定等领域。
基础研究：PCR技术可以扩增极小的DNA样品，如单个细胞或少量组织，从而对某些难以获取的DNA序列进行研究。
此外，PCR技术还可以用于构建DNA库、进行基因克隆、检测基因突变等。
临床诊断：PCR技术可以用于检测某些疾病相关的基因突变、病原体的存在等。
例如，PCR技术已经成为病毒性疾病、细菌感染等的诊断主要手段之一。
法医学鉴定：PCR技术可以对DNA进行扩增，从而获得足够的DNA 量进行鉴定。
例如，警方可以从犯罪现场收集到微量的DNA样品，通过PCR技术进行扩增，并与嫌疑人的DNA样品进行比对，以确定是否为犯罪嫌疑人。
PCR技术的改进与发展PCR技术自问世以来，经历了多次改进和发展。
其中最重要的一项改进是荧光定量PCR技术（Real-time PCR）。
荧光定量PCR技术可以在PCR反应过程中实时检测PCR产物的数量，从而能够对扩增结果进行准确的定量。
此外，还有多聚酶链式反应（Multiplex PCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等技术的出现，极大地拓宽了PCR技术的应用范围。
聚合酶链式反应
反应的控制
变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有 效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性 逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后 在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Hale Waihona Puke 物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时 间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
PCR原理
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚 合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合 酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不 需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临 床。
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5’ 3’ 5’ 3’
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3’
循环3 X3个拷贝
-学术活动-
PCR反应模式
普通PCR结果分析
-学术活动-
荧光定量PCR
-学术活动-
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退火
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Taq
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Taq 5’
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聚合酶链式反应技术
Polymerase Chain Reaction
常立功 2014-09-29
-学术活动-
• PCR的起源与发展 • PCR基本原理 • 普通PCR过程与分析 • 荧光定量PCR过程与分析
-学术活动-
• PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无 论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶 杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一 丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是 “微量证据”的威力之所在。
延伸 检测激发的荧光
Q 5’
Q 5’
Q 5’
Taq
5’Taq5’源自RRTaq
R
Taq
R
l
R
3’
退火
1. 链取代
3’
5’
2. 水 解
3’
5’
3. 聚 合
3’
5’
4. 检测荧光
3’
• 标准曲线分析法
-学术活动-
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
• 1.Oligo(dT)18 ： 能与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异 性结合，适合真核生物mRNA的转录,尤其是新鲜的组织或 细胞，当所提取的RNA片段长度小于2kb,无复杂三级结构
• 随机六聚体引物：适用于mRNA内含抑制反转录酶活性的 终止序列，适合提取无Poly(A)尾巴的RNA、石蜡和破碎 组织内提取的RNA，特别是当提取片段超过2kb，内部有 复杂的三级结构的，
• 特异性引物：用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更 为特异的PCR扩增。
普通PCR反应体系
-学术活动-
3’ 5’
3’
Taq
5’
退
火
3’
5’
Taq
延
伸
3’
重复
3’ 3’ 3’ 3’
3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
5’ 3’
3’
循环2 X2个拷贝
5’ 3’ 5’ 3’
• DNA在复制时，其中两条以氢键结合的互补链必须先行 分开，才能各自作为复制的模板；而打开双螺旋的最简单 方法就是加热。在高温下，双股DNA链会分离成单股，等 温度降低后，互补的两条DNA链又可以恢复成双股。虽然 DNA分子能耐高温，但进行DNA复制所需的聚合酶是蛋白 质，在高温下会失去活性。这也是之前的研究人员不认为 这种方法可行的原因之一。再有，要在千万条DNA当中， 以一小段已知序列制成的引物，“钓”出所需的片段，进 行复制，也跟大海捞针差不多，这是另一个让人却步的理 由。
• 标准曲线分析法
-学术活动-
unknown
104 103
相对定量分析
-学术活动-
无需制备标准品(2 -ΔΔc(t) 法)，但需要内参照基因， 且要求内参与目的基因扩增效率相近。
内参Ct值=15-14=1，21=2； 基因A: delta CT=20-18=2，22=4。 但是由于加样量是2倍，所以4/2=2，最后的相对 量是2倍
-学术活动-
• 现代实验室大多使用RT-PCR技术检测某个 基因的表达。
• 逆转录（Reverse Transcription RT）是将 RNA转录成cDNA的过程。
• 为什么要进行逆转录？ • 为什么要提取RNA而非DNA？
逆转录示意图
-学术活动-
逆转录体系
-学术活动-
逆转录引物区别
-学术活动-
-学术活动-
• 1953年，DNA被发现是细胞里携带遗传信息的分 子。
• 1956年，第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合 酶（此时的基因扩增仅在实验室，小规模的扩增， 操作繁复，成本高）。
• 1973年，台湾人钱嘉韵在黄石公园里热泉中发现 的嗜热菌中并分离出耐热的Taq聚合酶。
• 1984年，美国人K. Mullis (穆里斯 )和日本人才木 共同奠定了现代PCR技术的基础，使PCR技术进 入普通实验室，前者在1993年获得诺贝尔化学奖