PCR聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
01
在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
01
02
03
04
PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
02
03
Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
pcr反应的基本原理
pcr反应的基本原理PCR反应的基本原理PCR（聚合酶链式反应）是一种高效、快速、敏感的分子生物学技术，被广泛应用于基因组学、医学诊断、法医学等领域。
PCR反应的基本原理是通过体外复制DNA的方法，将少量的DNA模板扩增为大量的DNA产物。
PCR反应的基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
PCR反应的变性步骤。
在PCR反应开始时，将反应体系中的DNA 模板暴露在高温条件下，通常为94-98摄氏度。
高温的作用是分离DNA双链，使其变为两个单链DNA。
这一步骤是通过破坏氢键来实现的，使DNA双链变为两个单链，使得DNA模板可以用作后续的扩增。
接下来是PCR反应的退火步骤。
在退火步骤中，温度降低至50-65摄氏度。
在这个温度范围内，引物（即PCR反应中的两个短DNA 片段）与DNA模板的互补序列结合。
引物是设计用来与DNA模板的特定区域互补配对的DNA片段。
在每个PCR循环中，引物与DNA模板结合，并指导DNA聚合酶酶链反应的进行。
最后是PCR反应的延伸步骤。
延伸步骤是在退火步骤的温度下进行的，在延伸步骤中，DNA聚合酶使用单链DNA模板作为模板，合成新的DNA链。
延伸的方向是从引物的3'端到5'端。
DNA聚合酶酶链反应需要四种核苷酸（即dATP、dCTP、dGTP和dTTP）作为构建新DNA链的原料。
在每个PCR循环中，引物结合到DNA模板上，DNA聚合酶在引物的指导下合成新的DNA链，从而扩增目标序列。
通过这样的变性、退火和延伸步骤的循环，PCR反应可以在短时间内扩增出大量的目标DNA序列。
每个PCR循环会产生2倍的DNA产物，因此PCR反应经过多个循环后，目标DNA序列的数量会呈指数级增加。
通常，在25-40个PCR循环后，可以获得足够数量的DNA产物进行进一步的分析和应用。
PCR反应的基本原理使其成为分子生物学研究中的重要工具。
通过PCR反应，可以从极少量的DNA样本中扩增出足够的DNA产物，以进行基因测序、基因突变检测、基因表达分析等。
聚合酶链式反应(PCR)实验方法
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μldNTP mix （2mM） 4 μl引物1（10pM） 2 μl引物2（10pM） 2 μlTaq酶（2U/μl） 1 μlDNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl加ddH2O至50 μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
pcr的原理和步骤
pcr的原理和步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种基因扩增技术，可以通过复制DNA片段来产生大量的特定DNA序列。
PCR的原理和步骤
如下：
原理：
PCR基于DNA的体外扩增，使用DNA聚合酶来合成新的
DNA链。
其过程可以概括为三个主要步骤：变性、退火和延伸。
这些步骤在不同温度下进行，使用特定的引物来定向扩增目标DNA序列。
步骤：
1. 变性（Denaturation）：将含有所需DNA片段的DNA模板
加热至94-98℃的高温，使双链DNA解链成两条单链。
在此
过程中，氢键断裂，使两条链分离。
2. 退火（Annealing）：将温度降低至50-65℃，使引物与单链DNA模板的互补序列结合。
引物是DNA的短片段，其中一段序列与目标DNA序列的两端相互衔接。
3. 延伸（Extension）：将温度升高至72℃，加入DNA聚合酶
和足够的核苷酸（dNTPs），使DNA聚合酶沿着引物的互补
序列合成新的DNA链。
DNA聚合酶能够识别引物上的碱基对，并在其基础上合成新的DNA链。
此过程会在每一个DNA模
板两端的引物上进行。
以上步骤组成了PCR的一个循环。
通常，PCR会进行多个循
环，每个循环使DNA的数量翻倍，从而快速扩增目标DNA 序列。
PCR的结果是产生大量特定的DNA片段，可以用于分析、测序、克隆等应用。
PCR(聚合酶链式反应)技术与应用
PCR（聚合酶链式反应）技术与应用一．PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，是极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。
其反应原理与细胞内DNA复制相似，但PCR反应体系要简单得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶及适合的缓冲体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。
PCR包括下列三步反应：（1）变性（denaturation）：将反应体系混合物加热到94℃维持较短时间（大约15~30s），是目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
（2）退火（annealing）：将反应体系冷却至特定温度（引物的T m值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板-引物复合物。
必须精确的计算退火的温度以保证引物只与相对应的序列结合。
由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
（3）延伸（elongation）：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，合成新的DNA链。
因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。
以上三步作为一个循环重复进行，每一个循环的产物作为下一循环的模板。
因此，在第二轮循环中进行变性、退火、延伸这三步反应。
如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。
而所有上述过程将在1~2h内完成。
经过扩增后的DNA产物为大多介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进行稀释至可以忽略的程度。
聚合酶链式反应PCR
PCR - 1.生物学的聚合酶链式反应定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction），具体内容点击：聚合酶链式反应，简称PCR。
聚合酶链式反应，其英文Polymease Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCRPCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应PCR - 技术原理DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在聚合酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA 聚合酶、dNTP(dNTPdNTP，deoxy-ribonucleoside triphosphate（脱氧核糖核苷三磷酸）的缩写。
是包括dATP, dGTP, dTTP,dCTP,dUTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。
在生物DNA、RNA合成中，以及各种PCR（RT-PCR（reverse transcription PCR）、Real-time PCR）中起原料作用。
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
03
在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
06
PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
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➢PCR的改进与完善：Mullis最初使用的DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片 段，有许多缺点。
➢1988年Saiki 等使用Taq DNA聚合酶，它具 有较强的耐热性，使PCR能广泛的应用。
大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片断
Klenow片段：用枯草杆菌蛋白酶裂解完整 的大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，以去除其5′→3′ 外切酶的活性所得到的片段。分子量76kD。主 要应用于DNA测序、合成cDNA第二链，及双链 DNA3′端标记。
Klenow片段在PCR反应中的缺点： 1、DNA变性时酶酶不耐热而失活。 2、反应温度低，形成DNA二级结构。 3、引物非特异性退火。 4、反应效率低，易出现非特异性产物。
复制叉移动方向 解旋酶
DNA聚合酶
DNA旋转酶 ATP
ADP+Pi DNA结合蛋白 引物RNA 引物酶
DNA聚合酶
DNA聚合酶
RNA引物
3， 5，
DNA连 接 酶
3， 5，
5
3
AG T G A T C A G A
3
T C A 5
5
TCT
G
O H
P
P
P
HO
P-PP
dTTP dATP dCTP
3'
5' 领头链
5'
5'
解链方向
3'
随从链
3' 5'
用复制方向与解链方向不一致以理解 不连续复制的成因
5'
5' RNA酶
5'
5'
OH
P
Pol I
5'
5'
连接酶
AБайду номын сангаасP P
ADP
5'
5'
图11-20 引物的取代和连接酶的接合作用 ~~代表引物
聚合酶链反应简介
➢PCR是80年建立的体外核酸扩增技术。 ➢具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复
OH
5 3
复制过程的脱氧核苷酸聚合 带斜线的小方框代表引物
DNApol I
外切活性 聚合活性
A dCTP
5
3
G
DNA-pol I无活性
5
C
3
G
DNApol I的校读功能
上：DNApol I的外切酶活性切除错配碱基，
并用其聚合酶活性参入正确配对的底物
下： 碱基配对正确，DNA-pol I不表现活性
Taq DNA聚合酶
该酶的特点： 1、95℃不易失活。 2、引物退火与延伸可在较高温度进行。 3、3’末端加A。 4、反转录活性。 5、改造的Taq酶，长链合成，>20kb。
PCR技术的基本原理
1、类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
2、PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤 构成： ➢ 变性：93℃左右，双链DNA解离成为单链； ➢ 退火(复性)：55℃左右，引物与模板DNA单 链的互补序列配对结合；
分装， -20℃冰冻保存。 ➢多次冻融会使dNTP降解。4种dNTP的浓度要
相等，其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏 高或偏低)，就会引起错配。 ➢浓度过低又会降低PCR产物的产量。 ➢dNTP能与Mg2+结合，使游离Mg2+浓度降低。
其它序列无明显同源性（70%）。 8、进行计算机辅助设计。
引物量
➢每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol （每100ul反应），以最低引物量产生所需要 的结果为好。
➢原因：引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩 增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度
➢75℃时TaqDNA聚合酶的比活性： 150bp/s/酶分子。
性好、易自动化等优点。 ➢能在一个试管内将所要研究的目的基因于数小时
内扩增至百万倍。 ➢可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出
足量的DNA供分析研究。 ➢PCR技术是生物医学领域中的里程碑。
技术简史
➢PCR的最早设想 ：Korana于1971年最早 提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变 性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延 伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA 基因”。
聚合酶链式反应
体内DNA复制过程
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
A
T
G
C
A
T
A
T
C
G
T
A
T
A
A
T
G
C
通过半保留复制，子代DNA和亲代的 DNA是一致的
参与体内DNA复制的酶
DNA聚合酶 解链酶 拓扑酶 SSB 引物酶 连接酶
5， 3，
DNA复制过程模式图
➢延伸：TaqDNA酶以dNTP为反应原料，靶序 列为模板，按碱基配对合成一条新的与模板 互补的DNA 链。
3、重复循环：变性--退火--延伸，获得更多的 DNA模板。
4、一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩 目的基因扩增放大几百万倍。
DNA天然复制的基本要素
1、DNA聚合酶 2、DNA连接酶 3、DNA模板 4、由引发酶合成的RNA引物 5、核苷酸原料 6、无机离子 7、合适的pH 8、蛋白质因子 9、解开DNA的超螺旋及双螺旋酶
2、引物扩增跨度：200-500bp，特定条件下可 扩增长至10kb的片段。
3、引物碱基：G+C含量为40-60%，G+C太少扩 增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
4、避免引物内部出现二级结构；避免引物间互 补尤其是3`端的互补。
5、引物3`端的碱基，特别是最末两个碱基，严 格配对。
6、引物5’端可加上合适的酶切位点。 7、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
➢ 10×扩增缓冲液 10ul
➢ 4种dNTP混合物 各200umol/L
➢ 引物
各10～100pmol
➢ 模板DNA
0.1～2ug
➢ Taq DNA聚合酶 2.5u
➢ Mg2+
1.5mmol/L
➢ 加双或三蒸水至 100ul
引物设计原则
1、引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 （416=4.29 X109 >3X109) 。
➢通常，每次循环的中产生的移码突变率约为 1/30000，碱基突变率约为1/8000。
➢酶催化合成的忠实性：低浓度dNTP和 1.5mmol/L Mg2+, >55℃复性可提高忠实性。
➢催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U/100ul， 浓度过高可引起非特异性扩增。
dNTP的质量与浓度
➢dNTP质量与PCR扩增效率有密切关系。 ➢dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量