(企业诊断)聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
欢迎共阅聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus 公司的K.Mullis 发明，并和定点突变的发明者M.Smith 一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。
一、PCR 反应原理和反应过程DNA 的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation ）:94 ?C ~95 ?C退火（延伸（ 3二、PCR （一）参与PCR 1 模板cDNA ，再以 cDNA 2、引 12）长度为18 ~ 25个核苷酸3）二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T ）+（C+G ）6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核苷三磷酸（dNTP ）是dATP 、dCTP 、dGTP 和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。
反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。
4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。
Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。
最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）Taq DNA，耐热的具有5DNA及当dNTP6pH基质：（二）PCR反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94 ~ 97 ℃退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右。
温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。
延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性。
2、时间第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟）。
聚合酶链式反应技术在病毒感染诊断中的应用
聚合酶链式反应技术在病毒感染诊断中的应用病毒感染是现代医学所面临的一大挑战，身体对于病毒的反应时间过长，从而导致病毒在人体内迅速繁殖，而造成的疾病也越来越多。
然而，聚合酶链式反应技术却是一项能够检测病毒感染的先进技术。
它能够识别小样本量中的病毒DNA，从而提供更快、更准确的诊断结果。
一、简介首先，聚合酶链式反应技术（PCR）是一种利用DNA的特性进行扩增分析的技术。
PCR可以扩增微小的DNA样本，通常只需要微小的血量或组织量就可以进行病毒DNA的检测。
因此，PCR技术的出现可以大大的提高病毒感染的检测准确率和速度。
二、PCR技术在病毒感染的检测中的应用PCR技术在临床诊断中的应用是毋庸置疑的，随着技术的不断发展，可以用它来检测各种各样的病原体，包括病毒、细菌等等。
在病毒感染的诊断中，PCR技术的应用也非常广泛。
（一）常见的病毒感染的检测1.流感病毒流感是一种常见的病毒感染。
聚合酶链式反应技术能够快速、准确的检测流感病毒的DNA，从而帮助医生更快、更准确的诊断疾病。
2.单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒感染通常表现出口腔疱疹、性器疱疹等不同的症状。
聚合酶链式反应技术的应用可以快速、准确的检测出单纯疱疹病毒的DNA，从而提供有效的治疗方案。
3.丙肝病毒丙肝是一种常见的病毒性肝炎病毒。
使用PCR技术可以检测丙肝病毒的DNA，从而提供快速、准确的诊断结果，为治疗丙肝病毒感染提供有效的帮助。
（二）PCR技术的优势PCR技术在病毒感染的诊断中，具有很多的优势。
1.高灵敏度PCR技术可以检测出微弱的病毒DNA，甚至是在传统的方法中无法检测的病毒。
2.高特异性PCR技术具有非常高的特异性，可以在不同种类的病毒中判别出病原体，避免了误诊的问题。
3.快速性PCR技术可以在非常短的时间内完成检测，从而避免了传统诊断方法的患者等待时间。
（三）PCR技术在病毒研究中的应用PCR技术并不仅仅是用于病毒感染的临床诊断。
它还可以在病毒研究中发挥重要的作用，用于病毒与宿主之间的相互作用等。
聚合酶链反应及其在PCR扩增中的应用
聚合酶链反应及其在PCR扩增中的应用摘要：聚合酶链反应（PCR）是一种以DNA为模板、酶为催化剂、高温为反应条件，通过PCR扩增反应将少量的DNA片段扩增成为大量的DNA片段的技术。
PCR扩增技术的应用领域广泛，不仅可以应用于生物学领域，还可以应用于医学、食品工业等领域。
本文主要介绍PCR的原理及其在扩增中的应用。
一、PCR基本原理：PCR技术是由伯基和穆勒（Kary Mullis and Frederick C. Mullis）发明的一种DNA扩增方法。
PCR技术基于DNA的模板酶式扩增，通过在高温下启动酶催化的DNA合成反应，使DNA模板序列被持续扩增为大量的DNA产物。
PCR基本步骤包括：变性、回退、延伸。
PCR反应通常在数小时内完成，扩增产物的数量可达到上百万条DNA分子。
PCR技术的研究、开发和应用广泛，是现代分子生物学领域中一种重要的实验技术。
二、PCR扩增技术的应用：PCR扩增技术的应用主要包括基因诊断、基因克隆、物种检测等。
其中，基因诊断是指通过PCR扩增技术检测一定的基因序列，以判断某个疾病的遗传性质。
基因克隆是指通过PCR扩增技术将一段DNA片段扩增出来，然后将其插入到某个质粒中，并使其表达特定的蛋白质。
物种检测是指通过PCR扩增技术检测一定的DNA序列，以鉴别不同的生物物种。
三、PCR扩增技术的优点：PCR扩增技术的优点主要体现在其高效、简便、快速、灵敏和可靠等方面。
首先，PCR技术能够快速扩增DNA片段，从而大大缩短了实验时间。
其次，PCR技术具有灵敏度高、特异性强等特点，能够扩增出特定的DNA序列。
最后，PCR技术能够在少量样品中扩增DNA，从而避免了繁琐的纯化和扩增步骤，提高了实验效率。
四、PCR扩增技术存在的问题：虽然PCR扩增技术在生物医学、农业、环境保护等领域具有广泛的应用前景，但是在实际应用中，PCR技术仍然存在一些问题。
首先，PCR技术容易被环境中的DNA污染而影响扩增结果。
聚合酶链式反应（PCR）及其应用
聚合酶链式反应（PCR）及其应用
何玉凯
【期刊名称】《国外医学：遗传学分册》
【年(卷),期】1989(012)001
【摘要】聚合酶链式反应(简称PCR),又称体外基因放大技术,是用DNA聚合酶在
体外系统中诱发一对引物间的DNA双链的合成过程。
经过20～30次循环后,可使目的基因片段成百万倍地扩增,使得对该基因片段的分析研究更为便利。
PCR技术
自1985年创立以来,经过不断改进,目前已成为分子生物学研究的重要手段。
PCR
技术已经应用于遗传病的基因诊断和产前诊断,病原体的鉴定,癌基因的分析研究等。
最突出的是经PCR放大后的DNA片段可以直接进行顺序分析。
【总页数】4页(P1-4)
【作者】何玉凯
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
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聚合酶链反应技术在基因诊断中的应用
聚合酶链反应技术在基因诊断中的应用近年来，聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）已经成为基因诊断领域中非常重要的一种技术手段，其应用范围涉及基因检测、药物筛选、肿瘤诊断等众多领域，其应用也越来越广泛，为临床医学提供了更加精准、便捷、快速的基因诊断手段。
本文将从PCR技术发展历程、PCR技术在基因诊断中的应用、PCR技术在病毒性疾病检测中的应用等方面进行阐述。
一、PCR技术发展历程PCR技术是由美国生物学家凯瑟琳·穆利斯（Kary Banks Mullis）于1983年发明的，其获得了1993年的诺贝尔化学奖。
该技术是基于DNA分子的复制原理，通过利用酶类反应体系在较短的时间内扩增一段特定的DNA序列，其产物是以指数级别增长。
PCR技术的成功，使得遗传基因检测和分析研究取得了突破性进展。
在创新之初，PCR技术的应用范围受到了一定的限制，主要是由于PCR反应体系中存在一系列的实验条件。
这些条件的不稳定性，如条件限制、长度限制、重复性限制以及装置限制等，使得PCR反应技术无法进行精确、复杂的定量和数组分析等多年应用。
随着技术手段的不断完善，PCR技术的应用范围逐渐扩大，同时也具备了更强的稳定性和准确性。
二、PCR技术在基因诊断中的应用PCR技术作为一种重要的基因检测技术，发挥了巨大的作用，其对人类基因和遗传学研究的进展产生了深远的影响。
为了进一步了解PCR技术在基因诊断中的应用，以下将分别从常见基因突变的检测、慢病基因的诊断、肿瘤基因的定量、基因表达水平的分析等方面进行详细介绍。
1.常见基因突变的检测PCR技术已经成为常见基因突变检测技术中不可或缺的一种方法，如检测与罕见疾病相关的基因突变、检测遗传性疾病基因突变等。
PCR技术不仅可以检测基因突变，还可以基于多种不同的PCR技术体系进行SNP（单核苷酸多态性）、CpG 位点甲基化和基因打靶等高通量分子标记分析。
聚合酶链式反应简介及应用
聚合酶链式反应简介及应用
裴青生;王爱萍
【期刊名称】《青海畜牧兽医杂志》
【年(卷),期】1994(024)001
【摘要】聚合酶链式反应简介及应用裴青生，王爱萍（青海省畜牧兽医科学院，西宁，８１０００３）聚合酶链式反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）是一种用于基因放大的分子生物学技术，是１９８５年美国Ｃｅｔｕｓ公司Ｍｕｌｌｉｓ等人开发的一项专利...
【总页数】3页(P43-45)
【作者】裴青生;王爱萍
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S854.4
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第8章 聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用(1)
反应体系
5、镁离子的浓度
▲游离Mg2+浓度过低：酶活力↓ ▲游离Mg2+浓度过高：非特异扩增↑ ▲ 标 准 PCR 反 应 中 : 当 dNTP 为 200umol/L 时,MgCl2浓度为1.5mmol/L较宜. ▲影响Mg2+作用的因素 （1）dNTP引物和模板DNA等中的磷酸基因 （2）反应体系中螯合剂的存在。
一、逆转录PCR (RT)
是以细胞内 RNA 或 mRNA 为材料进行体外扩 增技术。
第一步:提取mRNA； 第二步:以mRNA为模板逆转录出第一链cDNA；
●酶:逆转录酶 ●引物：与RNA 3/端互补 如：oligo dT、随机引物或特异下游引物。
第三步:是以cDNA为模板进行PCR扩增。
二、定量PCR
●报告基因R：可发出荧光 ●荧光淬灭基团Q：使R不发出荧光
TaqDNA聚合酶5’→3’外切酶活性所切开。 ⑶杂交探针：荧光共振能量转移技术 ●探针A：标以荧光素 ●探针B：荧光染料受体。 原理： 两者相距一个碱基时，荧光共振能量转 移，探针A(一种波长)激发探针B(另一种波长)
原理： 探针完整时 R 基因 Q 基团连在一起，可被
本节课总结
一、PCR的原理和反应过程： 二、PCR的反应体系:
①模板 ②引物 ③dNTP④TaqDNA聚合酶 ⑤缓冲液
三、反应条件: 温度、时间、循环次数 四、PCR技术的质量控制： ◆实验室的规范: 四个区 ◆PCR基因扩增检验过程:
①标本采集处理②核酸提取③扩增和产物分析④结果报告
◆PCR实验系统中的主要污染: 五、以PCR为基础的相关技术：
2、引物
引物设计的原则（2）：
（5）退火温度根据引物Tm值决定。 二条引物的Tm值不能差别太大。 Tm值计算公式： º CTm=2(A+T)+4(C+G) (6)引物5’可以加修饰成分 ◆标记：酶切位类、生物素、荧光素、地高辛等 ◆引入突变位点； ◆引入启动序列； ◆引入蛋白质结合DNA序列等。 ◆引物浓度：一般控制在1~0.2μmol/L
聚合酶链式反应技术在生物医学中的应用
聚合酶链式反应技术在生物医学中的应用聚合酶链式反应(PCR)是一种基于酶切的DNA增殖技术，极大地加速了DNA的检测和探索。
自从PCR技术的发明之后，它已经成为了生物医学领域中最重要的工具之一。
本文将探讨PCR技术在生物医学中的应用，以及未来的发展。
1. DNA检测PCR最主要的应用是在DNA检测中。
比如在生物学研究中，分子物种分析、基因测序和基因突变检测等都需要PCR技术的帮助。
此外，PCR技术还被广泛应用于医学诊断，涵盖了人类疾病的许多方面，如感染、癌症、资深等。
PCR技术的优势是可以快速、准确、灵敏地检测到微量的DNA，为治疗和预防疾病提供了强有力的支持。
2. 肿瘤检测PCR技术已被广泛应用于肿瘤检测。
基于PCR技术的肿瘤检测可以检测到患者血液、尿液、组织样本等，诊断肿瘤的存在，并观察肿瘤的发展状况。
这种技术与传统的肿瘤检测方法相比，有更高的准确性和敏感性，可以早期诊断肿瘤，提高治疗效果，延长患者的生命。
3. 遗传疾病预测PCR技术也被用于遗传疾病预测。
如在遗传性耳聋的诊断中，PCR技术可以通过扩增基因片段，在幼儿出生之前诊断出耳聋的风险，让家长们做出相应的决策和安排。
此外，在婴儿出生之后，通过PCR技术也可以对新生儿遗传病的早期诊断提供重要支持。
4. 病毒检测PCR技术也是病毒检测中最常用的技术之一。
通过PCR技术可以快速检测出病毒的存在。
这种检测技术非常重要，因为病毒往往比细菌更难检测。
PCR技术具有高灵敏度和高准确性，意味着可以在病毒感染的早期进行检测，为治疗和预防病毒性疾病提供了有力支持。
5. 基因克隆PCR技术还可以用于基因克隆中。
通过PCR技术可以选择性扩增目标DNA片段，为基因克隆和遗传研究提供充分的材料和支持。
通过PCR技术对基因的抽提和扩增，可以有效地提高基因的可见性、可操作性和分析效率。
6. 技术改进尽管PCR技术已经应用于多个领域，但依然存在一些挑战和不足。
这就需要继续改进PCR技术，使其更加准确、更快、更节约、更具有实用性。
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聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的K.Mullis发明，并和定点突变的发明者M.Smith一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。
一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94 ︒C ~95 ︒C退火（annealing）:40 ︒C ~70 ︒C延伸（extension）:72 ︒C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。
二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。
1 模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。
RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。
模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng⋯2、引物（Primers）引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。
引物的合成可以采用化学方法。
引物设计时必须遵循一些原则。
设计引物的原则：1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补2）长度为18 ~ 25个核苷酸3）二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。
反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。
4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。
Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。
最适酶量：1-2.5U （酶量过多，导致非特异性扩增）Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。
Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。
耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。
5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。
虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。
当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为1.5mmol/L较宜。
6、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =7.2左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性）（二）PCR的反应条件反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94 ~ 97 ℃退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右。
温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。
延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性。
2、时间第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟）。
每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~ 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。
平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。
平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等。
三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区PCR技术的质量保证：基因扩增检验的全过程的质量保证室内质量控制和室间质量评价防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量（二）PCR技术的质量保证分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）分析后因素：报告形式、反馈的信息等三、常见问题与解决策略1、扩增失败的原因（1）试剂错加或漏加实验中发现阳性对照扩增失败，可用原试剂重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。
（2）试剂失效若以上方法仍不出阳性结果，可新启封一套试剂，有阳性标本，可用此标本与阳性模板同时再检一次加以确认。
试剂中，阳性模板失效较常见，仅阳性模板失效，更换模板或用阳性标本代替即可。
当怀疑试剂有质量问题时，用保存的阳性标本作为阳性对照检测一次，即可得到明确结论。
（阳性标本保存时间不宜过长，一般不要超过3周，并经常更换。
）（3）扩增仪温度偏差扩增仪温度的偏差是PCR失败最常见因素。
退火、延伸，上下偏差2℃通常不影响实验结果。
但变性高于96℃或低于92℃，对某些检测带来不良结果，甚至导致实验失败。
2、拖尾现象（1）裂解所用沉淀物过多标本裂解后未经充分离心，上清较混浊。
组织标本虽经规范化处理，会有拖尾产生，标本是否新鲜相关。
（2）裂解液、反应液变质标本中DNA含量过高或杂质过多。
降低加样量拖尾可明显改善（3）Taq酶加量过大或扩增循环数太多3、非特异条带（1）试剂因素（引物特异性不佳， Taq酶质量问题）（2）个别标本引起，无法避免（3）酶量过大，循环次数太多（4）裂解时沉淀物太多4、引物二聚体（1）试剂因素PCR试剂均会或多或少产生一些引物二聚体。
二聚体形成的原因：引物之间的互补和瞬时错配。
引物二聚体过强，则会降低PCR 效率，导致检测敏感性下降。
（2）操作不当当一个反应体系建立后，在室温放置时间过长，会引起扩增后的二聚体加重。
因此，PCR操作时，一旦管内所有试剂均加好后，应立即上机扩增。
一旦由于某种原因不能扩增，则将反应管置4℃暂存。
5、假阳性污染不一定导致所有标本均出阳性结果，有些标本中存在一定的抑制剂，虽受轻微污染但不足以出阳性结果。
但会引起阴性对照出现阳性结果。
由污染引起的阳性条带一般较弱，标本出现的条带强度基本一致或差异不明显。
6、非特异引起某一病原体通常不出现非特异带，但个别标本偶有一条与阳性对照不一致的带且强度也较好，则多半为阳性，是由野生突变株引起。
有时可看到某一标本可出现2-3条带，若与阳性对照位置在同一水平上的带最强，其余带则较弱，则仍可判阳性结果，否则应判阴性。
二温法扩增可有效降低非特异扩增。
对有非特异条带的标本，必要时可用94℃变性30秒、64℃延伸60秒，35次循环的条件，再检一次，往往可以得到满意结果。
7、假阴性（1）试剂失效当阳性对照出阴性结果，并用以往保存的阳性标本也不出阳性结果时，排除了仪器因素，便可认定试剂中反应液或Taq酶失效。
（2）裂解液失效裂解液室温放置过久或多次反复冻融，导致裂解液效果明显下降，引起阳性率下降和假阴性的常见原因。
由于反应体系正常，仅裂解液失效，因此，阳性对照不受影响。
（3）试剂贮存过久试剂贮存过久（接近或超过有效期，其间已反复冻融数次），导致检测敏感性下降，而出现假阴性。
（4）标本处理不当（见标本处理）（5）变性温度偏低不同病原体DNA由于所含G、C碱基对的百分比不同，Tm也不一样。
有些DNA所含G、C碱基对丰富，当变性温度低于92℃时，双链DNA不能完全解链，扩增往往失败，产生假阴性结果。
以PCR为基础的相关技术以PCR为基础的相关技术逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )多重PCR (multiplex PCR)免疫PCR差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR (in situ PCR)一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。
主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物， mRNA3`末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增二、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。
主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等。
在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。
内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是 -肌球蛋白基因荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法。
FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进荧光信号的检测方法：DNA结合染料技术、水解探针技术（TaqMan probe）技术、杂交探针技术三、多重PCR在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。
四、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。
DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。
五、免疫PCR将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。
在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。
若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3’端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。