RT-PCR百度百科
标准终点RTPCR
标准终点RTPCR实时荧光定量PCR（real-time PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、遗传疾病诊断等领域。
在实时荧光定量PCR技术中，终点PCR是一种常用的PCR方法，它可以通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
本文将介绍标准终点RTPCR的原理、方法和应用。
1. 原理。
标准终点RTPCR是一种半定量PCR技术，其原理是利用DNA或RNA模板，在PCR反应体系中进行多轮扩增，通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
在PCR反应中，每一轮循环都会产生指数级增加的DNA或RNA产物，同时伴随着荧光信号的累积。
当PCR反应达到饱和时，荧光信号会呈指数级增加，最终趋于平稳。
通过检测PCR反应终点的荧光信号强度，可以确定起始模板的含量，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。
2. 方法。
标准终点RTPCR的方法包括PCR反应体系的准备、PCR程序的设置、荧光信号的检测和数据分析等步骤。
首先，需要准备PCR反应体系，包括模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶等。
然后，设置PCR程序，包括预变性、PCR扩增和荧光信号采集等步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的累积而增加，直至达到饱和。
最后，通过荧光检测仪器采集PCR反应终点的荧光信号，并进行数据分析，得出目标DNA或RNA的定量结果。
3. 应用。
标准终点RTPCR技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。
在基因表达分析中，可以利用标准终点RTPCR技术对特定基因的表达水平进行定量分析，从而揭示基因调控网络和信号转导通路。
在病原微生物检测中，可以利用标准终点RTPCR技术对病原微生物的核酸进行定量检测，实现对病原微生物的快速、准确的诊断。
在遗传疾病诊断中，可以利用标准终点RTPCR技术对患者的遗传物质进行定量分析，为临床诊断和治疗提供依据。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR全称为逆转录聚合酶链式反应，是一种用于检测RNA的技术。
它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以将RNA转录成cDNA，然后进行扩增和检测。
这种技术在分子生物学和医学诊断中得到了广泛的应用，尤其在病毒检测和基因表达分析方面有着重要的作用。
RT-PCR的原理主要分为三个步骤，逆转录、PCR扩增和检测。
首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。
这一步骤需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够将RNA模板转录成cDNA，引物则是用来引导逆转录酶的合成。
在逆转录的过程中，引物将与RNA模板结合，逆转录酶将在引物的引导下合成cDNA链。
这样就得到了cDNA模板，为后续的PCR扩增提供了基础。
接下来是PCR扩增，即利用聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。
在PCR反应中，需要两种引物，分别是前向引物和反向引物。
这两种引物将在PCR反应中与cDNA模板配对，聚合酶将在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮的PCR反应，可以将目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR扩增是RT-PCR技术的关键步骤，它能够快速、高效地扩增目标DNA序列，为后续的检测提供了充分的材料。
最后是检测，即对扩增后的DNA进行检测分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、实时荧光定量PCR和测序等。
凝胶电泳是一种常规的检测方法，通过电泳将扩增后的DNA分离并观察。
实时荧光定量PCR则是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而定量分析目标DNA的含量。
而测序则是一种直接测定DNA序列的方法，可以准确地确定目标DNA的碱基序列。
这些检测方法可以根据实际需求进行选择，以满足不同的研究和临床应用。
总的来说，RT-PCR技术通过逆转录、PCR扩增和检测三个步骤，实现了对RNA的检测和分析。
它具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，可以广泛应用于基因表达分析、病毒检测、肿瘤诊断等领域。
随着生物技术的不断发展，RT-PCR技术也在不断完善和改进，为科研和临床诊断提供了强大的工具和支持。
RT-PCR
RT-PCR原理：
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的 mRNA作为模板，采用OligodT或随机引物 利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目 的基因或检测基因表达。
RT-PCR实验步骤
1，RNA提取；
2，RT；RNA-DNA
3，PCR
1．RNA的提取
RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎 细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提 RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。
逆转录-聚合酶链反应
Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR
RT-PCR简介
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶 链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA 为模板，扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是 总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
RT-PCR用途
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，
检测细胞中基因表达水平； 直接克隆特定基因的cDNA序列； 分析基因的转录产物； 获取目的基因； 合成cDNA探针。
真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从 DNA PCR得到我们需要的基因呢？
因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为 内含子 （intron），真正编码蛋白的区段是被这些内含子隔开的， 这些编码区叫做外显子（exon）。 真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接， 去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再 翻译成蛋白质。
Figure. DNA Contamination in RNA.
适用于具有PolyA尾巴的mRNA。（原核生物的RNA、 真核生物的 rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于 Oligo dT Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的 质量要求较高。
rt pcr原理
rt pcr原理RT-PCR原理RT-PCR是一种广泛应用于分子生物学和医学诊断领域的实验技术，其全称为反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）。
本文将详细介绍RT-PCR的原理。
一、反转录（Reverse Transcription）1. 反转录的概念反转录是指将RNA模板上的信息逆向转录成为DNA序列。
在RT-PCR中，反转录是制备cDNA（complementary DNA）模板的关键步骤。
cDNA是由RNA模板逆向合成的双链DNA，它可以作为PCR 扩增的模板。
2. 反转录过程反转录过程由三个主要部分组成：RNA逆向转录、RNA降解、cDNA 合成。
首先，需要使用反转录酶将RNA模板逆向转录为单链cDNA；然后通过碱基切除和填充，将单链cDNA变为双链cDNA；最后使用RNase H或其他酶降解RNA模板，得到纯净的cDNA。
二、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）1. PCR的概念聚合酶链式反应是一种体外扩增核酸序列的技术。
它可以在短时间内从微量样品中扩增出大量特定的DNA序列。
2. PCR过程PCR过程由三个主要步骤组成：变性、退火、延伸。
首先，将DNA 双链分离为两条单链，即变性；然后引入引物（primers），使其与目标序列的两端互相补合，形成一个模板-引物复合体；最后，使用DNA聚合酶在引物的作用下延伸新链。
三、RT-PCR原理1. RT-PCR的概念RT-PCR是一种结合反转录和聚合酶链式反应技术的方法，用于从RNA模板中扩增特定的DNA序列。
它可以将RNA转录为cDNA，并通过PCR扩增cDNA。
2. RT-PCR过程RT-PCR过程由四个主要步骤组成：反转录、初步扩增、二次扩增、检测。
首先进行反转录反应，将RNA逆向转录为cDNA；然后进行初步扩增，使用特定引物扩增目标序列；接着进行二次扩增，使用内部引物对初步扩增产物进行进一步扩增；最后进行检测，确定是否存在目标序列。
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
real-time pcr名词解释
real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
·
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
RT-PCR技术(ZYR)
3、确认RNA的质量
检测RNA溶液的吸光度： OD260/OD280=1.8－2.0 RNA的电泳图谱： 28S和18S条带明亮、清晰、指条带 边缘清晰，并且28S的亮度在18S条 带的两倍以上。
二、反转录
单管一步法
反转录和PCR反应在一个管子中完成 ， 得到的全部cDNA产物都一起经PCR扩 增 ，灵敏度更高，但是容易相互干扰 。
一、抽提RNA
1、防止RNA酶污染
180℃的高温下干烤6hr以上； 0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗； 去污剂洗涤，双蒸水冲洗； 溶液皆用0.1% DEPC水配置，试剂 应为新开封或RNA专用； 操作人员戴手套； 器械专用。
2、材料的准备
组织及细胞最好为新鲜的，或者在 －RT-PCR技术
简介
RT- PCR即逆转录PCR，是将RNA的 逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式 扩增反应（PCR）相结合的技术。首 先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成 目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用 途广泛，可用于检测细胞中基因表达 水平，细胞中RNA病毒的含量和直接 克隆 特定基因的cDNA序列。
两步法
反转录和P CR分开做，PCR取反转录 反应产物的1/10进行，更为灵活而且 严谨，但是灵敏度不如前者高。
三、PCR
1、参照基因 PCR
参照基因一般选择看家基因（长表达、高表 达量 的基因），常用18S、β－actin、 bubulin、GAPDH，其中ACTIN最为普遍； 参照基因与目的基因在同一个管子内进行 PCR反应的情况下，称之为内参； 参照基因与目的基因在不同管子内反应成为 外参； 由于内参可能与目的基因竞争模板及酶，或 造成其它干扰，外参的应用较为普遍。
rt-pcr 探针原理
rt-pcr 探针原理
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）探针原理是一种基于实时荧光检测的核酸扩增技术，用于定量分析目标RNA分子。
其原理如下：
1. 首先，从目标组织或细胞中提取总RNA，然后通过逆转录酶将RNA 转化为cDNA。
2. 采用特定引物和探针进行PCR扩增。
探针是一种荧光标记的DNA 分子，能够与目标cDNA序列特异性地结合。
3. 在PCR反应过程中，荧光探针与目标cDNA结合，随着扩增产物的形成，探针的荧光强度逐渐增强。
4. 通过实时监测扩增过程中荧光信号的变化，可以计算出目标分子的拷贝数。
荧光信号的强度与目标RNA分子的数量成正比，从而实现对RNA分子的定量分析。
5. 利用特定的软件和数据分析，可以得到目标RNA分子的相对表达量，从而分析不同样本之间基因表达的差异。
RT-PCR探针原理具有高度敏感性和特异性，广泛应用于基因表达研
究、病毒载量检测、突变检测等领域。
需要注意的是，RT-PCR实验过程中需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。
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概念
RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）
RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”
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PCR技术相关试剂
A液：变性液
B液：醋酸钠溶液
C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）
D液：异丙醇
E液：75％乙醇
F液：DEPC处理的灭菌去离子水
G液：RNA酶抑制剂
H液：反转录反应液
I液：反转录酶
J液：PCR反应液
K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)
L液：矿物油
M液：50倍TAE电泳缓冲液
N液：溴化乙锭溶液
0液：上样缓冲液
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PCR各步骤的目的
（一）预变性：
破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的D NA模板，最好不要吝啬这个步骤。
此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。
（二）变性--退火--延伸循环：
①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5 5℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP
为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板D NA 链互补的半保留复制链。
（三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：
1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。
（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。
2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。
通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。
3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。
扩展阅读：
1./question/52500058.html?si=3
2./blog/bio/guohui/1061.htm
3./blog/bio/pinus/1136.htm
4./wiki/%E3%83%AA%E3%82%A2%E3%83%AB%E3%8 2%BF%E3%82%A4%E3%83%A0PCR。