食品中拟态弧菌变性高效液相色谱检测技术研究
变性高效液相色谱在微生物基因检测中的应用研究进展
摘
要 3 变性高效液相色谱 : ;-<1=>?2<@ A2@B%C-?D9?01<8- E2F>2G HB?901=9@?1IBJ K ;ACEH L 是一种可以对核酸片
段进行灵敏、 快速的分析， 并检测出单碱基错配及插入缺失的新技术， 在生命科学许多领域有广泛的应用 7 对 基因型分析等领域的应用研究进展进行了综述 7 ;ACEH 在致病微生物基因抗药性突变检测、 关键词 3 变性高效液相色谱 ； 突变检测； 基因型分析 ;ACEH； 中图分类号： M!’( 文献标识码： N 文章编号： &$$!%!+(! : #$$" L O$%$$!"%$(
$9;*2)(*3 ;-<1=>?2<@ A2@B C-?D9?01<8- E2F>2G HB?901=9@?1IBJ
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变性高效液相色谱技术在快速检测食品微生物中的应用研究
变性高效液相色谱技术在快速检测食品微生物中的应用研究作者：杨柳来源：《现代食品》 2019年第10期◎ 杨?柳(昭通市质量技术监督综合检测中心,云南?昭通?657000)Yang?Liu(Zhaotong Quality and Technical Supervision Testing Center, Zhaotong?657000, China)摘?要:食品安全问题一直是社会各界重点关注的热点话题。
为了保证食品质量和安全,有必要对流入市场的食品进行食品中微生物含量的检验。
变性高效液相色谱技术因其自身特点以及检验的精确度相对较高、灵敏度和速度相对较快等特点,在微生物检测方面得到了广泛应用。
本文主要对变性高效液相色谱技术的实际应用进入深入研究,从原理、特点等方面进行详细阐述。
关键词:变性高效液相色谱技术;快速检测;食品微生物Abstract:Food safety has always been a hot topic of social attention, in order to ensure the quality and safety of food to a certain extent. It is necessary to test the microbial content of food that has entered the market. Denaturing high performance liquid chromatography (denaturing high performance liquid chromatography) is characterized by its own characteristics and relatively high accuracy, sensitivity and speed of detection. It has been widely used in the detection of microorganisms. In this paper, denatured high performance liquid chromatography (HDLC) technology has been deeply studied in the practical application process. This paper elaborates its principle and characteristics in detail.Key words:Denatured high performance liquid chromatography; Rapid detection; Food microorganisms中图分类号:O657.72;TS207.4食品中微生物是食品污染涉及范围最大、影响面积最广的一种食品污染。
200809变性高效液相色谱检测沙门氏菌_空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌
O157 ： H7 感 染 性 腹 泻 是 近 年 来 新 发 现 的 危 害 严 重
的 肠 道 传 染 病 ，它 除 引 起 腹 泻 、出 血 性 肠 炎 外 ，还 可 发 生 溶 血 性 尿 毒 综 合 症 （ HUS ）、 血 栓 性 血 小 板 减 少 性 紫 癜 （ TTP ） 等 严 重 的 并 发 症 ， 后 者 病 情 凶 险 ， 死 亡 率 高 ，已 经 逐 渐 成 为 威 胁 人 群 健 康 的 重 要 公 共 卫 生 问 题 。 90% 以 上 的 弯 曲 菌 感 染 是 由 空 肠 弯 曲 菌
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生物技术通报 Biotechnology
Bulletin
2009 年第 3 期
尔 可 导 致 幼 儿 和 老 年 人 死 亡 [1] 。 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌
在 但 不 可 培 养 ” 的 状 态 [4] ， 这 更 是 传 统 分 离 培 养 检 测 方 法 无 法 克 服 的 难 题 。 因 此 ，在 检 验 检 疫 工 作 中 ， 急需一种灵敏的快速检测方法。 本研究的目的是建立一种简单准确且快速灵 敏 的 多 重 PCR 反 应 ， 结 合 变 性 高 效 液 相 色 谱 技 术 （ DHPLC ） 方 法 ， 鉴 定 沙 门 氏 菌 、 空 肠 弯 曲 菌 和 肠 出 血 性 大 肠 杆 菌 O157 ： H7 ， 克 服 上 述 的 难 题 。 DHPLC 利用样 品分子对固定 相 亲 和 力 的 差 异 ，在 用 流 动 相 洗 脱 时 ，不 同 大 小 或 者 不 同 序 列 的 核 苷 酸 片 段 分 子 在 固 定 相 上 移 动 速 率 不 同 ， 从 而 达 到 分 离 的 目 的 [5] 。 根 据各种食源性致病 微 生 物 的 特 有 基 因 组 序 列 ，设 计 引 物 进 行 PCR 扩 增 ， 利 用 DHPLC 检 测 ， 达 到 快 速检测食品中病原微生物的目的。
应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性
应用变性高效液相色谱法检测幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性吴文冰;蔡鹏威;方超英;沈菁;陈雯【摘要】目的建立DHPLC快速检测Hp对克拉霉素耐药性的新方法.方法抽提56份经纸片琼脂扩散法鉴定为克拉霉素耐药的Hp菌株DNA及其对应的胃粘膜组织标本DNA,通过PCR技术扩增23S rRNA区187 bp基因,运用DHPLC技术对PCR产物进行突变分析,并进行DNA测序.结果 56份克拉霉素耐药的Hp菌株DNA经DHPLC分析,有51份存在异源双链峰,测序证实均存在点突变,5份无异源双链峰,测序证实无点突变,故DHPLC对基因突变耐药菌株的敏感性和特异性为100％,而且56份组织标本DNA检测结果与菌株DNA检测结果一致.结论DHPLC可应用于Hp对克拉霉素耐药性的快速检测,具有广阔的临床应用前景.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)011【总页数】4页(P1050-1053)【关键词】幽门螺杆菌;23S rRNA;克拉霉素耐药;变性高效液相色谱法;基因突变【作者】吴文冰;蔡鹏威;方超英;沈菁;陈雯【作者单位】福建医科大学省立临床医学院福建省立医院检验科,福州 350001;福建医科大学省立临床医学院福建省立金山医院检验科,福州35000;福建医科大学省立临床医学院福建省立医院内镜中心,福州 350001;福建医科大学省立临床医学院福建省立医院检验科,福州 350001;福建医科大学省立临床医学院福建省立医院检验科,福州 350001【正文语种】中文【中图分类】R378Supported by the Youth Scientific Research Fund Project of Fujian Provincial Health and Family Planning Commission (No. 2009-2-3) Correspondingauthor:CaiPeng-wei,Email:***************幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp是一种在人类胃粘膜中发现的革兰氏阴性微需氧菌，它与各种消化性疾病，例如消化性溃疡、胃炎及淋巴相关淋巴组织淋巴瘤等关系密切，是胃癌的高危因素之一。
高效液相色谱-二极管阵列检测器测定食品中米酵菌酸残留
１ ． ２色谱条件
色 谱 柱 ：Ｄ ｉ ａ ｍ ｏ ｎ ｓ ｉ ｌ Ｃ 柱 （ ２ ５ ０ ｍ ｍ ×４ ． ６ ｍ ｍ，５ ｍ）；流 动 相 ： 甲 醇 一 乙 腈 一１ ％乙 酸 溶 液 （ ６ ２ ：１ ０ ：２ ８ ，
图 ２ 米酵菌酸 的回收色谱 图 相 应的 常规分 析检 测具 有 重要 的技 术 本 实验 建 立一 种 直接 提 取并 快 速 支持与指导意义。 检 定食 品 中米酵 菌酸 残 留的 方法 ，不 参考文献
米酵 菌酸 由椰 毒 假单 胞 茵酵 米 面 １ ｍ Ｌ甲醇定 容 ，涡旋 后 ，过膜 分析 。 亚种 （ 简称 椰酵 假单 胞菌 ） 产 生 ，为 小 分子 的脂 肪酸 类外 毒 素。米酵 菌酸
２ 结果 与讨论
１ ｍ Ｌ氨 水 ）和 酸 化 甲醇 水 （甲醇 ： 水 ＝ ８ ０ ：２ ０ ，１ ｍ Ｌ盐 酸 ） 为 提 取 剂 时 ，米 酵 菌 酸 回 收 率 很 低 ，分 别 为 １ Ｏ ％和 ｌ ２ ％ ，当 以乙 腈水 （乙腈 ： 水 ＝ ８ ０ ：２ ０） 作 为 提 取 剂 时 ，米 酵 菌 酸 的回 收率 可 以达 到 ６ ０ ％ 。 由于 水 的 极 性 比 乙 腈 大 ，且 降 低 水 的 温 度 可 以 提 高水 的极 性 ，本 实验 通过 提 高 乙腈
水 中水 的 比 例 ，并 在 冰 水 浴 中 超 声 提 取 ，发现 在 冰水 浴 中乙腈 水 （ 乙腈 ：
取 米酵 菌 酸 浓度 为 ２ ． ５ ｇ ／ ｍ Ｌ的 耐 热性 强 ，即使 油炸 、蒸煮 也不 失 去 溶 液 ，利 用 Ｄ Ａ Ｄ检 测 器 对 其 进 行 紫 外 毒性 ，对人和 动 物细胞 有强 烈 毒性作 １ ９ ０～ ４ ０ ０ ｎ ｍ全 波 长 扫描 ，如 图 １所 用 ，是 引起 食物 中毒和 致 死 的主要 毒 示 ，确 定 ２ ６ ８ ｎ ｍ为 测 定 波 长 ，便 于 筛 素 …，其毒 性 由小 鼠经 口的 Ｌ Ｄ （ 半 除 干 扰 物 质 ，初 步 定 性 待 测 组 分 后 进 数 致 死 量 ）为 ３ ． １ ６ ｍ ｇ ／ ｋ ｇ 。 目前 关 于 步定量 ， 从 而 提 高 了检 测 的 灵 敏 度 。
变性高效液相色谱检测霍乱弧菌
霍 乱 弧 菌 感 染 的病 原 学 诊 断 和食 品 安全 检测 主 要 是 以 分 离 培 养 和 临 床 特 点 进 行 确 诊 和鉴 定 ， 由于 这 些 传 统 的 检 但
测 方 法 费 时 费 力 ， 断 血 清 昂 贵 且仅 限 于 Ｏ１ 和 ０１ ９型 血 清 ， 他 非 ０１和非 Ｏ ３ 霍 乱 弧 菌 在 细 菌 学 鉴 定 中 常 常 诊 型 ３ 其 ｌ ９型
对 分 离 株 进 行 了 ｏ Ｗ 基 因 测 序 ． 验 结 果 表 明该 方 法 有 很 好 的 特 异性 ，１ ｍｐ 试 ３ ０份 水 样 中经 Ｐ Ｒ ＤＨＰ Ｃ检 测 出 ５ Ｃ— Ｌ ８株
霍 乱 弧 菌 的分 菌 株 ， 性 率 为 １ ， 阳 ９ 与常 规 分 离 培 养 比较 ， 合 率 为 １ Ｏ ． 离 株 的 ｏ Ｗ 序 列 与 Ｇｅ ｂｎ 中的 存 符 ０ 分 ｍｐ ｎ ａｋ 在 １ ～ ３ 的 差 异 ． 种 检 验 方 法特 异 性 强 ， 便 快 捷 ， 霍 乱 防 治 提 供 了 一 种 有效 的检 测 新手 段 ． 这 简 为
速 检 测 Ｏ１ Ｏ１９ 非 Ｏ１ 非 ０１ ９ 霍 乱 弧 菌 的外 膜 蛋 白基 因 （ ｍｐ ） 根 据 霍 乱 弧 菌 外 膜 蛋 白 基 因 的 特 异 性 引 物 ， 、 ３、 、 ３群 ｏ Ｗ ．
Ｐ Ｒ 扩 增 的产 物 经 ＤＨＰ Ｃ进 行 快 速 检 测 ． ５ Ｃ Ｌ 以 ４株 参 考 菌 株 做 特 异 性 检 测 ． 丹 东 口 岸 国境 外 环 境 水 体 采 集 水 样 在 ３ ０份 ， Ｐ Ｒ— １ 以 Ｃ ＤＨＰ Ｃ和 常 规分 离 培养 进 行 了 比较 ， 丹 东 口岸 国境 外 环 境 水 体 霍 乱 弧 菌 感 染 状 况 进 行 了 检 测 ， Ｌ 对 并
变性高效液相色谱高通量检测动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌
量 成倍 增 加 ． 同时 由 于两者 增 菌 时 间 （ 门氏菌 １ 沙 ８
２ 、 贺 氏菌 ６ ８ｈ 不 相 同 ． 检验 工作 带 来 一定 ４ｈ 志 ～ ） 给 麻 烦 。曾有研究 报道 ． 选择合 适 的可 同时用作 沙 门氏 菌、 志贺 氏菌 增菌 的 通用增 菌液 ． 提高 实验 室 的工 对
沙 门 氏菌 Ｐ Ｒ Ｄ Ｐ Ｃ检测 的引物序列 ： Ｇ Ｇ Ｃ —Ｈ Ｌ ５一 Ｔ
ＡＡＡ ｒｒ ＴＣＧ Ａ ＣＣＡ ＣＧＴ ＴＣＧ ＧＧＣ ＡＡ一３ ５ －ＴＣＡ ． ＂
Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｔ Ｃ Ａ ＡＧ Ａ方 法 ，在此基 础 上采用 Ｐ Ｒ结合 高效 液相 色谱 Ｃ
基 因扩 增仪 ． 国 Ａ Ｉ 司 生产 ： 性 高效 液相 美 Ｂ 公 变 简 Ｈ Ｌ ， ｒｎｇｎ ｍ ｃ 曹际娟 ， 辽宁省 出入境检验检疫局 ， 究员 ， 研 博士 ， １０ ５ 色谱 （ 称 Ｄ Ｐ Ｃ）美 国 Ｔａｓｅｏ ｉ 公 司生产 。 １６ １ ，
本研 究所 用 标 准菌 株 均 购 自美 国典 型菌 种保 藏 中心 （ Ｔ Ｃ 和 中 国医学微 生物 菌种保 藏管 理 中心 ＡＣ （ ＭＣ Ｃ Ｃ ．其它 菌株 为本实 验室和 其它检验 检疫 局实
１１ 培 养 基 和 试 剂 ．２ ．
详 检 验所用 的增 菌液不 同 ． 即使 是对 同一份 标本也 只能 验 室分离鉴 定获得 的分离株 ， 见表 １ 分别 增菌 、 分别划 线分 离 、 别鉴定 ， 分 使实 验室 的工作
Ｇ ｎｍｉＤ ＡＥ ｔ ｃ ０ ｉ 及 Ｅ ａ『 ｅ ｏ ｃ Ｎ ｘｒ ｔ ｎ ｔ ａｉ ｋ ） ｘ Ｃ Ｔ 等试剂 购 自大连
某公司 三乙胺 乙酰盐 （Ｅ Ａ， Ｔ Ａ 色谱 纯 ） 白 Ｔａ ｓｅ 购 ｒｎｇ —
高效液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素研究进展
黄 曲霉 毒素具有极强 毒性和致癌性 ， 世界 上大多 数国家和地 区都规定 其在 食 品中限量要求 ， 要求对 并 黄曲霉毒素进行 有效监管。高效液相色谱法是一种检 测痕量物质 常用方 法， 检测黄 曲霉毒素一般 步骤是采
用 适合溶剂提取 目标物 ， 净化浓缩 ， ，柱 分离后检测 Ｃ８
于 ９ ％ 回收率 ； ８ 该净化法用 于花生、 巴西坚果 、 玉米 、
器检测 。根 据检测器不 同， 可分 为荧光检测 法和质谱
检 测法两类。
１ 取 和 净 化 提
样 品提取 溶剂选 择 取决 于黄 曲霉 毒素 自身物 化 性质 ， 一般 所用 提取 溶剂 为 甲醇、 乙腈 水 溶液 。尽 管 早期 方法 经常使 用氯 仿 ， 考虑 到氯 仿对 环境影 响 ， 但
现 已基本 上被替代 。一些新 的提取 技术， 如超 临界流
体萃取
、Hale Waihona Puke 加压流体 萃取（ 加速流体萃取 ） ｂ 被用于
中图分 类号 ： Ｓ ０ ． Ｔ ２７４
文献 标 识码 ： Ａ
文章 编号 ： ０８ ９ ７ （ ０ ２ Ｏ — ００ — ０ １０ — ５ ８ ２ １ ） ３ ０ １ ４
采用硅胶柱 （ ０ ／ Ｌ） ３ ３ｍ 建立简单 、 ｍｇ 可靠方 法分析检 测来 自不 同植物 油 中黄曲霉 毒素 ， 结果 表明 ， 胶柱 硅
ｐｅ ｔ ｍ ａｎｃ ｉ ｒ ｏｒ ｅ ｌｑｕｉ ｃ ｏｍ ａｔ ｒ ｄ ｎｒ ｏｇ ａｐＩＹ Ｉ
ＢＩ ｉｆ ｎ ， Ｒｕ － ｅ ｇ ＨＥ ｕ ｐ ｎ Ｘｉ － ｉ ｇ
（ ｏｅｅ ｈ ｍｉ ｌ ｎ ｉｅｒ ｇ Ｑｉｇ ａ Ｕ ｉｅｓｙｏ Ｓ ｉ ｃ ａ ｄＴ ｃ ｎ ｌ ｙ Ｓ ａ ｄ ｎ Ｑ ｎ ｄ ｏ ６０ ２ Ｃ ｉａ） Ｃ ｌ ｇ Ｃ ｅ ｃ Ｅ ｇ ｅｉ ， ｎ ｄ ｏ ｎｖｒｉ ｆ ｃ ｎｅ ｎ ｅｈ ｏ ｇ ，ｈ ｎ ｏ ｇ ｉｇ ａ ２ ６ ４ ， ｈｎ ｌ ａ ｎ ｎ ｔ ｅ ｏ
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175※分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 06食品中拟态弧菌变性高效液相色谱检测技术研究郑秋月１，２，曹际娟１，蒋 丹１，刘淑艳１，赵 昕１，傅俊范２（１．辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 １１６００１；２．沈阳农业大学，辽宁 沈阳 １１０１６１）摘 要：应用ＰＣＲ结合变性高效液相色谱（ＤＨＰＬＣ）技术对食品中致病菌——拟态弧菌进行检测，探讨其灵敏度特异性，建立快速高通量检测食品中拟态弧菌的新方法。
利用ＤＨＰＬＣ在非变性温度下进行双链ＤＮＡ分离的原理，应用ＤＨＰＬＣ 技术分析拟态弧菌特异性ＰＣＲ扩增产物。
在优化的分析条件下，对样品洗脱峰排列形成的聚类分析图进行分析，得到拟态弧菌的特征峰型图谱。
结果表明该方法有很好的特异性。
与传统检测方法进行比较该方法准确度为１００％。
本实验建立的食品中拟态弧菌ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ检测技术，特异性灵敏，准确度高，操作快速、简便，在食品安全检测中具有重要应用价值。
关键词：拟态弧菌；聚合酶链式反应；变性高效液相色谱法Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ ｂｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ＤｅｎａｔｕｒｉｎｇＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ （ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ）ＺＨＥＮＧ Ｑｉｕ－ｙｕｅ１，２，ＣＡＯ Ｊｉ－ｊｕａｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｄａｎ１，ＬＩＵ Ｓｈｕ－ｙａｎ１，ＺＨＡＯ Ｘｉｎ１，ＦＵ Ｊｕｎ－ｆａｎ２（１． Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｅｎｔｒｙ－Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｄａｌｉａｎ １１６００１， Ｃｈｉｎａ；２． Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ａｓ ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ， ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｆｌｕｘ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｏｄ－ｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ， Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ． ＤＨＰＬＣ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｕｎｄｅｒ ｎｏｎ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆｅｌｕｔｉｏｎ ｐｅａｋｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｗｉｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｐｅａｋ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ ｈａｓ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｃｙ ｏｆ １００％ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｉｔ ｈａｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｆｏｏｄ ｓａｆｅｔｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ；ＰＣＲ；ＤＨＰＬＣ中图分类号：ＴＳ２０１．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００９）０６－０１７５－０３收稿日期：２００８－０４－１７基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目（２００６ＢＡＫ０２Ａ１３）作者简介：郑秋月（１９７２－），女，工程师，硕士，研究方向为食品微生物检验。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｅｎｇｑｙｃｉｑ＠１６３．ｃｏｍ变性高效液相色谱法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑ－ｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＤＨＰＬＣ）是在高效液相色谱法的基础上发展起来的、在分子ＤＮＡ水平上进行微生物检测的一种新方法［１］。
ＤＨＰＬＣ技术可以稳定、准确地从种属和菌株水平识别微生物，弥补传统表型识别方法的缺陷［２］。
是检测混合微生物样本的全自动化操作分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的、苛刻的、厌氧的细菌。
ＤＨＰＬＣ根据特定样本中各种微生物的峰形对目标菌进行鉴定，样本的峰形谱可用于定性和定量监测样本中各种微生物的动态变化。
本实验拟建立ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ［７１］技术在非变性条件下对食品中致病菌——拟态弧菌进行快速检测的方法。
样品仅需快速增菌培养几小时，即可直接取样品增菌液检测拟态弧菌。
与传统检测方法进行比较，结果表明ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ方法准确度为１００％，说明该ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ方法具有广泛而良好的适用性。
１材料与方法１．１菌株、试剂与引物拟态弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｉｍｉｃｕｓ，ＢＪ０５０；ＡＴＣＣ３３６５３、３３６５４、３３６５５、７００３２６）及分离株，霍乱弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ，ＶＣ３３）、副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ2009, Vol. 30, No. 06食品科学※分析检测176ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，ＣＭＣＣ１７８０２，ＢＪ０５４）、溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ，ＢＪ０３５）、创伤弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ，ＣＣ０１３）、霍利斯弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｈｏｌｌｉｓａｅ）、弗尼斯弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ）、河流弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、梅氏弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｅｖｉｉ）、美人鱼弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｍｅｒｍａｉｄ）、鲨鱼弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃａｒｃｈａｒｉａｅ）等由辽宁出入境检验检疫局生物实验室分离和保存。
细菌基因组ＤＮＡ小量纯化试剂盒、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 ｄＮＴＰｓ ＴａＫａＲａ公司；ＴＥＡＡ （醋酸三乙胺）缓冲液 Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司；ＤＨＰＬＣ缓冲液：缓冲溶液Ａ为５０ｍｌ ＴＥＡＡ，２５０μｌ乙腈，定容至１０００ｍｌ；缓冲溶液 Ｂ为５０ｍｌ ＴＥＡＡ，２５０ｍｌ乙腈，定容至１０００ｍｌ；缓冲溶液Ｄ为７５％乙腈。
ＰＣＲ引物 ：正向引物：５＇－ ＡＡＧ ＧＧＡ ＡＡＧ ＴＧＡ ＡＴＣＡＧＣ ＡＧＣ ＣＧＡ ＧＴＡ－３＇，反向引物 ５＇－ ＣＧＡ ＣＣＡ ＴＴＴ ＧＴＴＧＡＣ ＧＣＣ ＣＡＴ ＣＴ－３＇（片段长度为２４３ｂｐ） 宝生物工程（大连）有限公司。
１．２仪器ＰＥ２４００ＰＣＲ仪；ＤＨＰＬＣ Ｗａｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＳｙｓｔｅｍＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ公司。
１．３样品ＤＮＡ的提取食品中拟态弧菌等各实验菌株样品的制备、增菌培养和分离步骤参照ＮＭＫＬ Ｎｏ．１５６方法［３］和《伯杰氏细菌鉴定手册》［４］进行。
取培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液）１ｍｌ，用细菌ＤＮＡ提取试剂盒提取细菌ＤＮＡ，保存于－２０℃备用，以待检测。
１．４ＰＣＲ反应体系和条件以拟态弧菌浓度相同的ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ反应，微调引物量，选出反应效果最佳的引物浓度。
同时进行Ｔａｑ酶、Ｍｇ２＋、引物用量和循环条件优化，直至得出最佳反应体系。
反应体系体积２５μｌ：１０×ＰＣＲ缓冲液２μｌ、引物对（１０μｍｏｌ／ｌ）各１μｌ、ｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／ｌ） ２μｌ、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μｌ）０．２μｌ、模板ＤＮＡ ２μｌ、加灭菌超纯水使总体积为２５μｌ。
反应条件：９４℃ 预变性 ３ｍｉｎ；９４℃ 变性 ６０ｓ，６０℃退火６０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，进行３５个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ，４℃保存反应产物。
１．５ＤＨＰＬＣ分析条件检测温度：５０℃；洗脱的ＤＮＡ双链在波长２６０ｎｍ处进行紫外吸收检测；流动相：缓冲溶液Ａ浓度为５０．２％，缓冲溶液Ｂ浓度为４９．８％；流速：０．９ｍｌ／ｍｉｎ；上样量：ＰＣＲ产物５μｌ；质量控制：验证实验和实际检测过程中，分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子ＤＮＡ，阴性对照为非目标致病菌ＤＮＡ，空白对照为无菌水。
１．６特异性实验提取拟态弧菌和１．１中的各种弧菌培养物的ＤＮＡ，用拟态弧菌特异性引物进行ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ特异性实验。
１．７灵敏度实验拟态弧菌标准菌株液体培养物做倍数梯度稀释，分别进行平板计数。
每个梯度菌液制备模板ＤＮＡ，进行ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ检测。
将检测结果与平板计数结果比较，确定反应体系的灵敏度。
１．８实际样品检测为验证本实验建立的检测方法的可靠性，在实际检验工作中加以应用，并与现有检测方法进行检出率的比较。
２结果与分析２．１ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ检测琼脂凝胶电泳检测拟态弧菌ＰＣＲ反应结果，扩增出２４３ｂｐ特异性条带。
对拟态弧菌特异性ＰＣＲ产物进行ＤＨＰＬＣ检测，检测图谱如图１所示。
本实验共检测了３０株拟态弧菌，其特异性ＰＣＲ产物在５０℃非变性条件下，在目标产物处均出现一个单一的洗脱峰，基线平整，滞留时间一致，具有高度同一性。
图１ 拟态弧菌PCR-DHPLC聚类分析图Fig.1 PCR-DHPLC clustering analysis diagram of Vibriomimicus ３６３２２８２４２０１６１２８４０－４ｍＶ时间（ｍｉｎ）０１２３４５６７８２．２特异性实验拟态弧菌特异性检测结果的ＤＨＰＬＣ检测图谱如图２所示，拟态弧菌出现特异性样品吸收峰，结果为阳性。
而霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、霍图２ 拟态弧菌PCR-DHPLC特异性检测结果Fig.2 Specificity of PCR-DHPLC determination to Vibriomimicus ４０３２２４１６８０－８ｍＶ时间（ｍｉｎ）１．拟态弧菌；２～１２．霍乱弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、霍利斯弧菌、弗尼斯弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、美人鱼弧菌、鲨鱼弧菌、水。
177※分析检测食品科学2009, Vol. 30, No. 06利斯弧菌、弗尼斯弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌、美人鱼弧菌、鲨鱼弧菌等非拟态弧菌菌株以及空白水对照均未出现样品吸收峰，检测结果均为阴性。
上述结果表明、本实验建立的ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ技术可以特异性检测食品中拟态弧菌。
２．３灵敏度实验取拟态弧菌标准菌株进行灵敏度实验，提取制备模板ＤＮＡ进行ＰＣＲ－ＤＨＰＬＣ检测。
实验结果表明，本实验所建立的方法可检出５６ＣＦＵ／ｍｌ拟态弧菌。
结果见表１。