200809变性高效液相色谱检测沙门氏菌_空肠弯曲菌和肠出血性大肠杆菌
动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法
动物结核病原菌检测方法变性高效液相色谱法1范围本标准规定了结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌多重PCR联合变性高效液相色谱（mPCR-DHPLC）检测方法的技术要求和操作规范。
本标准适用于快速检测细菌培养物、动物组织、血样、痰液等临床样品中结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求3 缩略语下列缩略语适用于本标准。
3.1 DHPLC：Denaturing high-performance liquid chromatography，变性高效液相色谱。
3.2 dNTP：deoxyribonuclesosde triphosphate，脱氧核苷三磷酸。
3.3 PBS：phosphate buffer solution，磷酸盐缓冲液。
3.4 mPCR：multiplex-polymerase chain reaction，多重聚合酶链式反应。
3.5 TEAA：三乙基铵醋酸盐4 概述人与动物结核病涉及多种病原菌或病原菌复合群。
结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTC）是感染人与哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌。
其中，主要感染人与家畜并致病的是结核分枝杆菌和牛分枝杆菌。
与MTC相对应的是种类繁多的各种非结核分枝杆菌（NTM）。
NTM感染患者的临床症状及病理变化与MTC引起的结核病极为相似，但多数NTM对抗结核药物有天然耐药性。
此外，NTM感染可造成结核菌素皮内变态反应或血清学检测假阳性。
采用多重PCR联合变性高效液相色谱检测的方法可同步区分结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌复核群，并鉴别结核分枝杆菌与牛分枝杆菌多重PCR反应的原理、操作过程与普通PCR相同。
变性高效液相色谱法检测鲍曼不动杆菌喹诺酮耐药基因突变
变性高效液相色谱法检测鲍曼不动杆菌喹诺酮耐药基因突变吴旋;伍严安【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2011(032)004【摘要】目的通过运用变性高效液相色谱(DHPLC),研究鲍曼不动杆菌耐药表型与其染色体上gyrA和parC基因突变的关系.方法采用微量肉汤稀释法测定左氧氟沙星和加替沙星对90株临床分离鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度(MIC);采用基因外序列进行同源性分析,PCR扩增鲍曼不动杆菌的gyrA和parC基因,对PCR产物进行DHPLC检测及DNA测序.结果 90株鲍曼不动杆菌中,对左氧氟沙星和加替沙星耐药率分别为63.3%和60.0%;同源性分析可分成9种基因型,90株扩增出了343 bp的gyrA基因和327bp的parC基因产物.9种基因型中,3种表型耐药的基因型PCR产物经DHPLC检测均出现异常双峰或者多峰.测序证实gyrA基因存在83位Ser→Leu突变,parC基因在80位同样出现Ser →Leu突变,同时parC基因还存在多个位点的同义突变;敏感株运用DHPLC检测只出现单峰,测序未发现突变.结论运用DHPLC检测可以快速发现细菌耐药基因的突变,鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药与gyrA和parC基因的高频突变相关.【总页数】3页(P448-450)【作者】吴旋;伍严安【作者单位】福建医科大学省立临床医学院,福州,350001;福建省立医院,福州,350001【正文语种】中文【相关文献】1.宁波地区耐多药结核分枝杆菌喹诺酮耐药gyr基因突变研究 [J], 车洋;杨天池;平国华;林律2.非靶位基因突变及外膜通透性的改变对大肠杆菌喹诺酮耐药和多重耐药的影响[J], 赵瑞华;舒明星;陈淑贞3.淋病奈瑟菌的耐药性与喹诺酮耐药基因突变的相关性分析 [J], 张怡;吴颖;孙爱华4.鲍曼不动杆菌质粒介导喹诺酮耐药机制研究 [J], 姜晓冰;徐雅梦;于涛;王海磊;石磊5.喹诺酮耐药鲍曼不动杆菌52株的基因分型 [J], 马艳;张伟铮;杜任生;余欢度;鄂顺梅;屈平华;陈茶因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
致病菌检验方法
沙门氏菌
依据： GB 4789.4-2010
食品安全国家标准
食品卫生微生物学检验 沙门氏菌检验
第三十五页，编辑于星期三：五点 三十三分。
第三十六页，编辑于星期三：五点 三十三分。
基本操作步骤
1、前增菌： BPW( 缓冲蛋白胨水）
2、增菌： TTB（四硫磺酸钠煌绿增菌液）
SC （亚硒酸盐胱氨酸增菌液）
依据： GB7918.5-87 化妆品微生物标准检验方法 金黄色葡萄球菌
第二十四页，编辑于星期三：五点 三十三分。
检验程序
增菌 37℃ 18 ~24h
分离
37℃ 24 ~48h
染色镜检
甘露醇发酵试验
血浆凝固酶试验
报告
第二十五页，编辑于星期三：五点 三十三分。
1、增菌：
取样液按 1：10比例接
种到 SCDLP 液体培养基 中，或者可用 7.5 % 氯
3、分离：① BS（亚硫酸铋琼脂） XLD（木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂）
② HE琼脂
沙门氏菌显色培养基
第三十七页，编辑于星期三：五点 三十三分。
基本操作步骤
4、生化试验： TSI（三糖铁） 赖氨酸
靛基质 尿素琼脂
氰化钾（ KCN）培养基 蛋白胨水
或直接用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统
5、血清学鉴定： O抗原、 H抗原、 Vi抗原、菌型鉴定
有绿脓菌素存在。
第十九页，编辑于星期三：五点 三十三分。
6、硝酸盐还原产气试验
接种被检纯培养物于
硝酸盐胨水培养基中，
37℃培养 24h。小倒 管中有气体者，为阳 性，表明该菌能还原
硝酸盐，产生氮气。
第二十页，编辑于星期三：五点 三十三分。
进出口SN标准微生物检测方法之大肠杆菌和大肠菌群计数方法
大肠杆菌和大肠菌群计数方法Enumeration of Escherichia coli and the coliform章节内容：·传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法·LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌（除双壳类软体动物制品外）·瓶装水检测方法·贝类和贝类肉制品检测方法·柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法·大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法·参考文件大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。
虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。
某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。
由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。
再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。
与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。
肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂 。
于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。
1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。
于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。
沙门氏菌的检验
沙门氏菌的检验食品学院14食品质量与安全1班文敏柳基炜卫杰恒温紫君5 6 1 2摘要：本实验采用GB/T4789.4-2010的检测方法测定鸡场中的沙门氏菌。
通过本实验学习沙门氏菌的检测方法和技术，了解沙门氏菌的一些生化特性；本实验先用显色培养基找出可疑菌落，再做生化试验找出可疑的典型性的沙门氏菌，再通过血清学试验最终确定是否为沙门氏菌属。
关键词：沙门氏菌接种生化试验血清学鉴定前言沙门氏菌病是公共卫生学中具有重要意义的人畜共患病种之一，其病原沙门氏菌属于肠道细菌科。
沙门氏菌是一个统称，泛指 2000 多种有紧密连系的细菌，包括引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。
虽然只有少数人因沙门氏菌而患病，但是，在世界围的细菌性食物中毒事件中，由沙门氏菌引起的占大多数。
因此，采用科学、合理的方法检验食品中沙门氏菌，已经成为了人们最关心的问题之一[1]。
国标法(GB4789.4-2010)是目前中国规定的食品中沙门氏菌的标准检测方法,也是基层实验室普遍采用的检测方法,它根据沙门氏菌的生长特点和生化特性,采取前增菌、增菌、分离、生化试验和血清学鉴定5个步骤进行[2]。
1材料与方法1.1实验材料1.1.1仪器设备均质器、三角烧瓶、平皿、玻璃棒、接种棒恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃吸管：1 mL（具 0.01 mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度或微量移液器及吸头电子天平PL602-S，梅特勒-托利多仪器（）；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅SYQ-DSX-280B，申安医疗器械厂1.1.2试剂药品鸡肠、靛基质试剂、沙门氏菌O和H诊断血清、API20E生化试剂盒或VITEKGNI 生化鉴定卡1.1.3培养基蛋白胨水（BPW)、四硫磺酸钠煌绿（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE琼脂、三糖铁琼脂、蛋白胨水、尿素琼脂、氰化钾、氰化钾对照、赖氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶对照、甘露醇、山梨醇、β-D半乳糖苷（ONPG）培养基1.2 实验方法1.2.1培养基的制备1.2.1.1培养基的配制步骤蛋白胨水（BPW）：称取蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钠1.5g、蒸馏水1000ml，将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约 10 min，煮沸溶解，调节 pH，高压灭菌 121 ℃，15 min。
反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量
反相高效液相色谱法测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的含量作者：廖晓慧孙海燕刘冬彭光华张声华【摘要】目的建立反相高效液相色谱（RP HPLC）测定重组大肠杆菌发酵液中降血压肽的方法，为其深入研究提供方法学基础。
方法采用Aydac C18反相柱（4.6 mm×250 mm,5 μm），Aydac保护柱，柱温30℃，以乙腈∶水(22∶78) ，0.05%TFA为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长215 nm，参考波长350 nm，进样量20 μl。
结果该方法使降血压肽与其它相似产物得到较好分离，在5～250 μg/ml 内线性关系良好，r=0.999 8，最低检测限达8 ng，低、中、高浓度下的加样回收率、日内、日间精密度均符合方法学要求。
结论该方法稳定、灵敏度高、操作简便、适用于重组降血压肽的含量测定。
【关键词】重组大肠杆菌；降血压肽；反相高效液相色谱Abstract：ObjectiveA simple and rapid reversed-phase high performance liquid chromatographic method was developed for the AHP in Recombinant E.coli fermentation broth.MethodsThe separation conditions were: Aydac C18 reversed phase column, Aydac guard column. Mobile phase was acetonitrile∶water(22∶78),0.05%TFA,flow rate 1ml/min.The detection wavelength was 215nm,reference wavelength was 350 nm.Column temperature was 30℃.Injection volume：20 μl. ResultsAHP has good separation from other components in fermentation broth. And there was perfect linear correlation between 5～250 μg/ml, r=0.999 8. The limit of detection was 8ng. The intra-and inter-assay precisions, recovery met the methodology requirements.ConclusionThis method had high precision,high accuracy and was easy-manipulated. This method proved to be suitable for AHP.Key words：Recombinant E.coli; Antihypertensive peptide; RP-HPLC降血压肽（antihypertensive peptide，AHP）是一类能够降低人体血压的小分子多肽。
高效液相色谱法测定刺糖多胞菌发酵液多杀菌素含量
82
湖南师范大学自然科学学报 第 31卷
素 A 和 D 得到有效的分离 ,保留时间分别为 7. 01 m in和 8. 33 m in (图 1 a、b). 多杀菌素 A , B , C, D , E, F
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
第 4期 易 勇等 :高效液相色谱法测定刺糖多胞菌发酵液多杀菌素含量
83
混合标样色谱图峰形良好 ,具有良好的分辨率 ,多杀菌素 B , C, E, F相对应的保留时间为 3. 59、3. 21、5172、 4181 m in (图 1c).
a:多杀菌素 A 和 D 混合标样色谱图 ; b:多杀菌素试样色谱图 ; c:多杀菌素 A , B , C, D , E, F混合标样色谱图 图 1 多杀菌素标准品与试样高效液相色谱图
2008年 第 31卷
12月 第 4期Biblioteka Jou rna lof
湖南师范大学自然科学学报 Natural Science of Hunan Normal
U n ive rsity
Vol. 31 No. 4 Dec. , 2008
高效液相色谱法测定刺糖多胞菌发酵液多杀菌素含量3
易 勇 ,夏立秋 3 ,丁学知 ,杨 尉 ,王海龙 ,罗玉双
(湖南师范大学生命科学学院 ,微生物分子生物学湖南省重点实验室 ,中国 长沙 410081)
摘 要 为了建立刺糖多胞菌 (S accharopolyspora spinosa)发酵液中多杀菌素不同组分的分离与定量分析的高 效液相色谱检测方法. 以 AQ12S0521546W T (150 ×4. 6 mmL. D. S - 5 μm , 12 nm )为分析柱 ,以甲醇 - 乙腈 - 2%醋 酸铵溶液 (45∶45∶10, v/ v / v)为流动相 ,流速 1. 5 mL /m in,检测波长 250 nm. 结果表明多杀菌素在 25～1 000 mg/L 范围内线性关系良好 ,本方法标准偏差为 1. 486 9,变异系数为 0. 79% ,相关系数为 0. 999 2,平均回收率为 99. 58%. 多杀菌素化合物 A , B, C, D , E, F的保留时间分别为 7. 01, 3. 59, 3. 21, 8. 33, 5. 72, 4. 81 m in. 本方法能准 确测定刺糖多胞菌发酵液中多杀菌素含量 ,有效分离多杀菌素不同组分.
食品检验工_三级_鉴定所设置技术要求
《食品检验工》 （三级）鉴定所设置技术要求
《食品检验工》 三级） （ 鉴 定 所设置技术要求
职业（工种）名称 职业代码 考位 编号 考位 名称 设备/工具 名称 生物安全柜 规格/型号 数量 1 食品检验工 等级 考题编 号 三级 备注
《食品卫生微生物学检 GB/T 4789.5-2003 1 验 志贺氏菌检验》 标准 《食品卫生微生物学检 GB/T 验 乳与乳制品检验》 标 4789.18-2003 准 无菌工作衣帽、口罩 乳粉 高压灭菌器 恒温培养箱 天平 光学显微镜 无菌均质瓶 灭菌不锈钢镊子 灭菌剪刀 灭菌不锈钢勺子 1 乳粉志贺氏 试管架 菌检验 无菌锥形瓶 无菌广口瓶 玻璃珠 无菌培养皿 无菌试管 无菌毛细管 不锈钢吸管筒 吸管 消毒棉球 镊子 打火机 橡皮乳头 洗耳球 记号笔 酒精灯 接种环 直径 3mm
第1页 共 26 页
1 1
大于 50g 立式或卧式 36℃±1℃ 感量0.1g 10×～100× 容量 250mL 1 1 1 1 1 1 1 1 用于 18×180mm 试 1 管 500mL、250 mL 250 mL 90mm 10mm×75mm 放置 10mL 吸管 10mL 75%乙醇 各2 5 10 5 10 2 1 2 1 1 1 1mL 30mL 1 1 1 1 1 1.1.1
光学显微镜 铜丝筐 塑料盆 无菌锥形瓶 无菌广口瓶 玻璃珠 无菌刻度吸管 不锈钢吸管筒 无菌培养皿 无菌小试管 无菌试管 无菌毛细管 试管架 橡胶滴头 试剂滴瓶 酒精灯 打火机 接种环 接种针 无菌镊子 无菌手术剪 无菌不锈钢药勺 搅拌棒 带盖搪瓷盒 香柏油 二甲苯 棉签或擦镜纸 载玻片 洗瓶 洗耳球 酒精棉球 卷筒纸 特种玻璃笔 水笔 无菌生理盐水 革兰氏染色液 染色缸