利用变性高效液相色谱(dHPLC)进行小麦等位基因差异表达分析＊____韩宗福--DNASep柱
第18卷 第11期 2008年11月
利用变性高效液相色谱(dHPLC)进行小麦等位
基因差异表达分析＊
韩宗福 倪中福＊＊王晓娜 逯腊虎 姚颖垠 孙其信＊＊
中国农业大学植物遗传育种系,农业生物技术国家重点实验室,教育部杂种优势研究与利用重点实验室,北京市作物遗传改良重点实验室,农业部作物基因组与遗传改良重点实验室,北京100193
2008-03-19收稿,2008-04-25收修改稿 ＊国家重点基础研究发展计划(批准号:2007CB109000)和国家自然科学基金(批准号:30671297)资助项目 ＊＊通信作者,E-mail:wheat3392@cau.edu.cn;qxsun@cau.edu.cn摘要 等位基因变异是生物体基因组中普遍存在的现象,也是物种进化和育种的重要基础.等
位基因可以通过编码区的改变或者表达来影响基因的功能,因此研究等位基因的表达具有重要的生物学意义.由于小麦基因组的复杂性,造成等位基因的鉴定比较困难,这极大地制约了小麦等
位基因表达研究的开展.利用CAU36和CAU328两个EST-SSR标记,结合变性高效液相色谱(dHPLC)分析技术,在35个小麦基因型中分别检测到4种和3种等位变异类型,并且以抽穗期的穗下节节间为材料,对其在4×6的小麦双列杂交组合杂交F1代中进行了表达分析.结果表明,
这两个EST-SSR引物扩增的等位基因在多个组合中均存在显著的差异表达,且CAU36标记检测
到的等位基因表达变化值与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.
关键词 EST-SSR 等位基因 表达变异 变性高效液相色谱 小麦
等位基因是位于一对同源染色体的相同位置上
而序列有差异的基因,其变异是物种进化和育种的
重要基础.在植物上,对一些重要的农艺性状基因
(水稻的淀粉合成酶基因(Orizasativa)和玉米(Zea
may)的Dwarf8矮秆基因)的等位基因变异分析已
有较多报道,并已鉴定出了多个功能优异的等位基
因[1,2].研究表明,不同等位基因之间的序列差异
主要表现为单核苷酸多态性及较短序列的插入或缺
失[3],而这些变异可能会引起编码蛋白质的改变,
也可能通过影响基因的表达水平而导致基因功能发
生差异[4].
不同等位基因不仅存在序列变异,也存在表达
上的变异[4].全基因组水平上的表达分析结果显
示,等位基因差异表达在人类(Homosapiens)、小
鼠(Musmusculus)、果蝇(Drosophilamelano-
gaster)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)中是广泛存在的[5—9],并且可能与生物的抗病和抗逆性及杂种
优势形成有关.例如,不同等位基因对于非生物逆
境的响应存在明显差异,其在抗旱过程中所起的作
用可能有所不同[4].又如,在授粉早期的玉米杂合
子胚中来自父本的部分等位基因就已经被激活,并
且在授粉后15d的杂合子胚中,来自两个亲本的许
多等位基因存在表达差异,这可能与胚的杂种优势
有关[10,11].
关于小麦的等位基因序列和表达变异研究也有
报道,其中对品质相关基因,如编码麦谷蛋白、醇
溶蛋白、淀粉合成酶和多酚氧化酶基因的研究最为
深入,但主要集中在基因组和蛋白质水平.迄今为
止,在转录水平上对小麦等位基因表达的研究相对
较少,这是因为普通小麦A,B和D三个不同基因
组上的部分同源基因存在很高的序列相似性.例
如,Shitsukava等[12]对小麦MADS-BOX基因1256WSEP的研究发现,其对应的3个部分同源基因具有相似的基因组结构和表达谱,因此对每个位点上
的等位基因表达进行研究具有一定难度.
最近,以大规模的cDNA测序为基础而新开发出了一种新的标记类型,即EST-SSR(Exepressed
SequenceTagSSR).该标记来自表达的基因内部,是对基因组转录区域变异的直接鉴定,该标记已被
广泛应用到植物遗传多样评价和遗传图谱构建中.
对小麦的研究结果表明,许多EST-SSR标记具有非常高的特异性,因此可以利用这些标记进行小麦
等位基因表达分析.变性高效液相色谱(dHPLC)是一种高通量筛选
DNA序列变异的新技术.该方法具有自动化、准确快速、检出率高等特点,现已广泛应用于与人类
疾病相关基因的突变分析上,但应用在植物上的相
关研究比较少.Guo等利用dHPLC方法探讨了玉米F1代杂交种中两个等位基因的相对表达量,在所研究的15个基因中,有11个存在等位基因表达
差异[4].在本研究中我们利用CAU36和CAU328两个EST-SSR标记,结合dHPLC技术,鉴定了
35份不同小麦品种(系)中的等位基因变异类型,并配制了4×6的小麦双列杂交组合,以抽穗期的穗
下节节间为材料,对这两个基因在杂交F1代中的等位基因表达差异进行了分析,发现其中一个基因
的等位表达变异与部分杂交种的株高之间存在显著的相关性.
1 材料和方法
1.1 实验材料
供试的35个小麦材料包括来自我国北方的30份普通小麦品种(系),1份斯卑尔脱小麦以及4份
穗分枝小麦(表1).同时,以6份普通小麦(5027,5097,5084,3472,3197和3159)品种(系)为母
本,4份穗分枝小麦为父本配制4×6的不完全双列杂交组合.亲本及杂交F1代播种于中国农业大学
昌平试验站,抽穗期各取20株穗下节节间混样,进行EST-SSR标记及其等位基因的表达分析.
选用以农大3338为母本,以Altgold为父本所构建的重组近交系群体F2:8后代175个株系为材料,
对EST-SSR标记进行染色体定位分析.表1 35个小麦基因型的名称及来源编号名称来源编号名称来源13338中国农业大学19270中国农业大学
22463中国农业大学203159中国农业大学
36554北京农林科学院213197中国农业大学
43214中国农业大学223218中国农业大学
53235中国农业大学233251中国农业大学6227中国农业大学243458中国农业大学
7101中国农业大学253472中国农业大学
8390北京农学院263672中国农业大学
9411北京市种子公司273741中国农业大学
10皖38安徽省涡阳县农业科学研究所285019中国农业大学
11晋72山西农业科学院295021中国农业大学
12豫66河南省豫东农作物品种展览中心305029中国农业大学
136036中国农业大学315084中国农业大学
145027中国农业大学325097中国农业大学
15分841山西农业科学院33224中国农业大学
16普分3山西农业科学院344185河北石家庄市农业科学研究所17圆81山西农业科学院35中农4中国农业科学院18柱1山西农业科学院
1.2 DNA和RNA提取
取供试小麦材料的穗下节节间,采用CTAB法
进行DNA提取.RNA提取选用TRNzol 总RNA
提取试剂(DP405-01,Tiangen).提取的RNA用
RQ1RNase-FreeDNase(M6101,Promega)进行纯
化,所有操作按照产品说明书进行.
1.3 cDNA合成
cDNA合成反应总体系为20
μL(含2μg总
RNA,50mmol/LTris-HCl(pH8.3),75mmol/L
KCl,3mmol/LMgCl2,10mmol/LDTT,50μmol/L
dNTPs,锚定引物50pmol,RNase抑制剂20U,
MMLV反转录酶200U),37℃温育2h,取1μL用
于PCR反应.
1.4 利用EST-SSR标记进行等位基因变异筛选
实验所用的两个EST-SSR标记CAU36和
CAU328,为本实验室根据GenBank中的小麦EST
获得,并在中国春缺体-四体系或3338/Altgold重1257 第18卷 第11期 2008年11月组近交系上进行了染色体定位(结果未发表).微卫
星引物序列如下:
CAU36-L:5′CGTTCGTCATGGTTACCTCC3′,CAU36-R:5′CCCTCATTGATTTATTTGT-
TCG3′;
CAU328-L:5′GATATGGAGTGGAGGCAAGC3′,CAU328-R:5′AAGTCGATGGTGACTGAC-
CC3′.
PCR扩增反应体积为20μL,内含PCR缓冲
液,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTPs,50ng微卫星引物和50—100ng模板DNA,1UTaqDNA
聚合酶.反应程序:94℃变性3min;94℃30s,60℃30s,72℃30s,共28个循环;72℃延伸
7min.取2.5μL扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳约1h后硝酸银染色.
1.5 EST-SSR标记等位基因的克隆和鉴定
以CAU36和CAU328为引物各检测到4种和
3种等位变异类型,按序列由小到大的顺序,分别命名为CAU36-A,CAU36-B,CAU36-C,CAU36-D
和CAU328-A,CAU328-B及CAU328-D.对于每
种等位变异类型,选择一个品种(系)的扩增条带进行回收测序.测序结果用CLUSTALW程序进行
序列比对.
以CAU36和CAU328标记对应的cDNA序列为种子序列,利用BLASTN在GenBank的EST库
中搜索与之高度同源的小麦EST序列,再利用
DNAMAN软件把这些EST拼接在一起,根据这些序列设计引物进行RT-PCR.引物序列如下
CAU36-P1:5′-ATGGAGGAGAGTGGGAGC-
GTG-3′,
CAU36-P2:5′-CCCCTCATTGATTTATTT-GTTCGTT-3′;
CAU328-P1:5′-CACCACCAACAACAATCT-
GAA-3′,CAU328-P2:5′-AAGTCGATGGTGACTGA-
CCC-3′.
将扩增产物连接到PGEM-T载体(Promega)上
进行测序.通过BLASTX在GenBank中进行氨基酸同源比对,推测EST序列可能代表的基因功能.1.6 等位基因差异表达分析以4×6组合亲本及其杂交F1代穗下节间的
DNA和cDNA为模板,按前述条件对小麦β-Actin(引物序列β-Actin-L:5′-GGAATCCATGAGAC-CACCTAC-3′,β-Actin-R:5′-GACCCAGACAAC-
TCGCAAC-3′),CAU36和CAU328进行PCR扩
增,每个反应做3次重复.
dHPLC检测系统的流动相由A液(0.1mol/LTEAA,0.025%乙腈)和B液(0.1mol/LTEAA,
25%乙腈)按设定梯度自动混合而成.进样器自动
吸取5μLPCR产物注入DNASep柱(TRANS-
GENOMIC),柱温为50℃.运行梯度:时间(min)/A缓冲液浓度/B缓冲液浓度,分别为0/65%/
35%,1/60%/40%,17/28%/72%,每个程序运
行时间为19.5min,溶液流速为0.9mL/min,并根据目的基因与β-Actin基因扩增产物峰高值计算其
比值.利用两尾等方差t测验的方法进行显著性检
验.
1.7 等位基因差异表达与株高的相关分析
以等位基因表达的变化值(H比值-P比值)为
变量,与2004—2005和2005—2006两年度杂交F1代的株高进行相关性分析(用MicrosoftExcel软件
的CORREL函数).
2 结果与分析
2.1 小麦等位基因变异的鉴定和序列分析
变性高效液相色谱法检测鸡HSP70基因单核苷酸多态性
变性高效液相色谱法检测鸡HSP70基因单核苷酸多态性
罗庆斌;郑凤珊;杜红丽;张细权;杨关福;邱祥聘;曾凡同
【期刊名称】《四川农业大学学报》
【年(卷),期】2005(023)001
【摘 要】选取我国20个地方鸡种共591个个体作为实验材料,采用变性高效液相色谱(DHPLC)技术,在鸡HSP70基因的全序列内进行未知SNPs的筛选,对有变异的色谱峰型分别选取2个个体测序,再将同一对引物的所有测序样本的测序结果进行序列的同源性比较,从而识别和确认鸡HSP70基因的未知SNPs.结果分别在4对引物扩增的PCR产物中检出并确认了10个SNPs:A258G、C276G、C507T、C1040A、G1044A、C1431A、T1476C、G1500A、A1529G、C1722T.
【总页数】5页(P90-94)
【作 者】罗庆斌;郑凤珊;杜红丽;张细权;杨关福;邱祥聘;曾凡同
【作者单位】华南农业大学,动物科学学院,广州,510642;华南农业大学,动物科学学院,广州,510642;华南农业大学,动物科学学院,广州,510642;华南农业大学,动物科学学院,广州,510642;华南农业大学,动物科学学院,广州,510642;四川农业大学,动物科技学院,四川,雅安,625014;四川农业大学,动物科技学院,四川,雅安,625014
【正文语种】中 文
【中图分类】S831.2
【相关文献】 1.变性高效液相色谱法筛选胶质瘤易感基因ERCC2的单核苷酸多态性 [J], 杨冬;李庆国;朴明学;张亚卓;王红云;罗毅男;蒋传路;柯杨;戴钦舜
2.应用限制性酶切片段长度多态性及变性高效液相色谱法筛选胶质瘤易感基因ERCC2的单核苷酸多态性比较 [J], 杨冬;李庆国;张亚卓;王红云;罗亦男;蒋传路;柯杨;戴钦舜
3.变性高效液相色谱法检测单核苷酸多态性的研究进展 [J], 胡俊;史树贵;李露斯
4.变性高效液相色谱法筛选鼻咽癌相关基因单核苷酸多态性 [J], 黄华;周宇凤;江培洲;沈新明;姚开泰
３１份小麦材料中抗旱基因的ＫＡＳＰ检测
麦类作物学报 ２０２３，４３（１０）：１２４１－１２４７ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９１０４１．２０２３．１０．０３网络出版时间：２０２３０７１３网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ２／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３５９．Ｓ．２０２３０７１２．１９２８．０２３．ｈｔｍｌ
３１份小麦材料中抗旱基因的犓犃犛犘检测
收稿日期：２０２２０６２３ 修回日期：２０２２０７１４基金项目：山东省农业科学院农业科技创新工程项目（ＣＸＧＣ２０２２Ａ０１）；山东省良种工程项目（２０２１ＬＺＧＣ００９）第一作者Ｅｍａｉｌ：ｄａｖｉｄｌｅｅ５＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：李玮（Ｅｍａｉｌ：ｄａｖｉｄｌｅｅ５＠１６３．ｃｏｍ）；李根英（Ｅｍａｉｌ：ｌｇｙ１１１＠１２６．ｃｏｍ）李玮１，孔淑鑫２，宋国琦１，李玉莲１，张淑娟１，张荣志１，高洁１，李吉虎１，樊庆琦１，李根英１（１．山东省农业科学院作物研究所／小麦玉米国家工程研究中心／农业农村部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室／山东省小麦技术创新中心，山东济南２５０１００；２．山东农业工程学院农业科技学院，山东德州２５１１００）摘 要：为明确小麦材料中抗旱相关基因的组成，利用已报道的２９个标记（１１个新转化的ＫＡＳＰ标记以及已报道的１８个ＫＡＳＰ标记），对１６份抗旱小麦品种和１５份高产小麦品种进行ＫＡＳＰ检测。结果表明，多数基因位点在抗旱小麦品种和高产小麦品种间的优异等位基因数目无明显差别；ＴａＰＹＬ１１Ｂ、Ｗｃｏｒ１４２Ｂ、ＴａＳＲＬ１４Ａ、ＴａＳｎＲＫ２．３１Ａ、ＱＴＤＷ．ｃａａｓ６ＢＬ位点的优异等位基因在旱地品种中占比较高，而ＴａＷＲＫＹ５１２Ｂ和ＴａＳｎＲＫ２．４３Ａ位点的优异等位基因仅存在于抗旱品种中，前者的供体材料为晋麦４７、晋麦９２和晋麦１０１，后者的供体材料为济麦３７９。关键词：小麦；抗旱；分子标记；育种亲本中图分类号：Ｓ５１２．１；Ｓ３３０ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９１０４１（２０２３）１０１２４１０７
小麦TabHLH112-2B_基因克隆及每穗小穗数相关功能标记开发
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2024, 50(2): 403413 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail:***************
本研究由国家重点研发计划项目(2022YFD1200201)和财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设专项(小麦, CARS-03-5)资助。 This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2022YFD1200201) and the China Agriculture Research System of MOF and MARA (Wheat, CARS-03-5). * 通信作者(Corresponding authors): 孙黛珍,E-mail:*************;李超男,E-mail:*****************第一作者联系方式:E-mail:*******************Received (收稿日期): 2023-02-27; Accepted (接受日期): 2023-05-24; Published online (网络出版日期): 2023-06-20. URL: https:///kcms2/detail/11.1809.S.20230619.1741.002.html
This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (/licenses/by-nc-nd/4.0/). DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.31016
利用单克隆免疫亲和柱——高效液相色谱法检测小麦中DON毒素的研究
利用单克隆免疫亲和柱——高效液相色谱法检测小麦中DON毒素的研究
吴杰;陈万权;朱宝成
【期刊名称】《畜牧与饲料科学》
【年(卷),期】2009(030)004
【摘 要】研究了单克隆免疫亲和柱--高效液相色谱法测定小麦中DON毒素的方法.样品通过聚乙二醇-水提取,提取液用DON毒素单克隆免疫亲和柱净化,SymmetryC18色谱柱分离,紫外检测器检测和外标法定量.该方法对添加不同含量DON毒素的平均回收率为86.11%-95.24%,变异系数(CV)为0.88%-2.59%,最低检出限为0.1 ms/kg,可用于小麦样品中DON毒素的检测.
【总页数】3页(P10-12)
【作 者】吴杰;陈万权;朱宝成
【作者单位】河北大学生命科学学院,河北,保定,071002;中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100193;河北大学生命科学学院,河北,保定,071002
【正文语种】中 文
【中图分类】R994.4
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1.单克隆免疫亲和柱-高效液相色谱法测定玉米中伏马毒素B1、B2 [J], 林维宣;田苗;王玫;赵彤彤;曹东梅 2.免疫亲和柱-高效液相色谱法同时检测谷物中T-2毒素和HT-2毒素含量 [J], 李惠婧;刘秋;于一芒;李军
3.单克隆免疫亲和柱-高效液相色谱法测定小麦中致呕毒素 [J], 林维宣;李继业;田苗;张华一
4.免疫亲和柱净化、高效液相色谱法结合荧光检测器检测进出口芝麻中的黄曲霉毒素B1 [J], 王伟;葛宝坤;苏毅;刘旸;王志英
5.酶联免疫吸附结合免疫亲和柱－高效液相色谱法检测大米中黄曲霉毒素B1的研究 [J], 陈旭明;李婷
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高效液相色谱法测定小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇
110 食品安全导刊 2021年7月分析检测高效液相色谱法测定小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇吴基杰，闫 超*（安徽省产品质量监督检验研究院，安徽合肥 230000）摘 要：本文建立了小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的高效液相色谱分析方法。用水提取样品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇，经免疫亲和柱净化后，用高效液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。该方法操作简便、准确，可满足小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测。关键词：小麦；脱氧雪腐镰刀菌烯醇；高效液相色谱法小麦是全球三大谷物之一，易受到真菌毒素的污染。脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）又名呕吐毒素，属单端孢霉烯族化合物，由YOSSHIZAWA等于20世纪70年代在被镰刀菌污染的小麦等禾谷类食物中发现并鉴定，是小麦中最常见的一类污染性霉菌毒素，严重影响小麦的品质和安全[1-2]。研究表明，DON具有较强的毒性，易对人体健康造成较大的威胁，已被联合国粮农组织和世界卫生组织定为最危险的自然发生的食品污染物，也已被国际癌症研究机构公布为三类致癌物之一[3-5]。因此，本文以脱氧雪腐镰刀菌烯醇为检测对象，采用高效液相色谱法进行检测，探究其检测限、灵敏度和准确度，为食品监管体系中脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛查工作提供相关技术支撑。1 材料与方法1.1 仪器与试剂高效液相色谱仪（配有紫外检测器，安捷伦1290），电子天平（精密度0.01 mg），高速粉碎机，超声波（KS-5200DE），氮吹仪，高速离心机，移液器，脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫亲和柱，水相微孔滤膜（0.45 μm）。甲醇和乙腈（色谱纯），聚乙二醇（相对分子质量为 8 000），脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品（纯度≥99%）。标准溶液（100 μg/mL）：称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇1 mg（准确至0.01 mg），用乙腈溶解并定容至10 mL，将溶液转移至试剂瓶中，-20 ℃下避光保存。1.2 样品前处理取小麦样品充分粉碎，置于100 mL三角瓶中，4 ℃保存。1.3 实验步骤称取25 g粉碎的小麦试样和5 g聚乙二醇，加水至100 mL，混匀后置于超声波中超声20 min。然后6 000 r/min转速下离心10 min，收集滤液A于干净的容器中。移取上述滤液A 2.0 mL，以1滴/s的流速通过免疫亲和柱，并用 10 mL水淋洗免疫亲和柱，流速约为1～2滴/s，弃去全部流出液，抽干小柱。最后加入2 mL甲醇洗脱亲和柱，控制1滴/s的下滴速度，收集全部洗脱液至试管中，在50 ℃下用氮气缓慢地将洗脱液吹至近干，加入1.0 mL初始流动相，涡旋30 s溶解残留物，0.45 μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中以备上机检测。1.4 仪器条件液相色谱柱：C18柱（柱长150 mm，柱内径4.6 mm，填料粒径5 μm）；流动相：甲醇和水按比例1︰4混溶；流速： 0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；检测波长：218 nm。2 结果与分析2.1 线性方程和检出限准确移取脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准溶液用初始流动相稀释，配制成0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL和5.0 μg/mL的标准系列工作液，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准工作液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，将系列标准溶液由低到高浓度依次进样检测，线性范围为0.1～5.0 μg/mL，r2 = 0.999 5，脱氧雪腐镰刀菌烯醇的色谱图见图1，标准曲线见图2。以加标样本中待测化合物色谱峰的信噪比对应的3倍浓度为方法检出限，确定小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检出限为26.0 μg/kg。
小麦花发育MADS-box基因的表达模式分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 10671073 / ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@
本研究由国家自然科学基金项目(31571657), 中央高校基本科研业务费项目(2014ZZ009)和新疆农业职业技术学院科研项目(XJNZYKJ201501)资助。 This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31571657), the Fundamental Research Foundation for the Central Universities (2014ZZ009), and the Foundation of Xinjiang Agriculture Vocational Technology College (XJNZYKJ201501). * 通讯作者(Corresponding authors): 李海峰, E-mail: lhf@; 孙其信, E-mail: qxsun@ Received(收稿日期): 2015-11-24; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-05-09.
URL: /kcms/detail/11.1809.S.20160509.0957.006.html DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01067
小麦花发育MADS-box基因的表达模式分析
李海峰1,2,* 韩 英1 刘梦佳1 王冰华1 苏亚丽1 孙其信1,*
小麦ＳＰＬ_家族基因在非生物胁迫下的表达分析
麦类作物学报 ２０２３，４３（１０）：１３３５－１３４３ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｉｔｉｃｅａｅＣｒｏｐｓｄｏｉ：１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９１０４１．２０２３．１０．１５
网络出版时间：２０２３０８２５网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／６１．１３５９．ｓ．２０２３０８２３．１７４６．０１０
小麦犛犘犔家族基因在非生物胁迫下的表达分析
收稿日期：２０２２０８１１ 修回日期：２０２２１１２２基金项目：国家自然科学基金项目（３１８０１３６３）；河南省科技研发计划联合基金项目（２２２１０３８１０００４）；河南省高等学校重点科研项目（２３Ａ２１００２０）第一作者Ｅｍａｉｌ：ｈｅｊｉｎｑｉｕ１０１５＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：赵月（Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｏｙｕｅ＠ｈｅｎａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）贺金秋，苗敬南，马超，樊紫薇，王超丽，李欢欢，赵月，刘文轩
（河南农业大学生命科学学院，河南郑州４５０００２）
摘 要：ＳＱＵＡＭＯＳＡｐｒｏｍｏｔｅｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｌｉｋｅ（ＳＰＬ）是一类在植物中广泛存在的转录因子家族，在
调控植物生长发育、响应逆境胁迫等方面发挥着重要作用。为解析小麦中ＳＰＬ家族基因响应非生物胁迫的
机理，本研究采用生物信息学的方法在全基因组范围内对小麦ＳＰＬ基因家族成员进行鉴定，并对鉴定到的
ＳＰＬ基因进行表达模式分析。结果表明，在全基因组范围内共鉴定到５６个小麦ＳＰＬ基因，其中２７个是
ｍｉＲ１５６的靶基因；系统进化分析发现，５６个小麦ＳＰＬ基因聚类为７个亚家族。基于转录组数据对表达模式
进行分析，发现３６个小麦ＳＰＬ基因与非生物胁迫响应相关，响应缺氮、缺磷、高盐、低温、干旱、高温胁迫以及
热旱共胁迫的基因分别有１２、１６、２２、６、１３、１４和２１个，其中ＴｒａｅｓＣＳ３Ｄ０２Ｇ４２５８００同时响应７种非生物胁
迫。ｑＲＴＰＣＲ验证结果与转录组数据基本一致。
高效液相色谱的应用研究进展
高效液相色谱的应用研究进展
【摘要】从1903年，色谱的开始使用，各种色谱技术应运而生，其中高效液相色谱由于其分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，作为物质分离的重要工具，在各个方面都取得了很大的发展，并且出现了许多的新型色谱。本文综述了变性高效液相色谱在生物遗传方面的应用，及高效液相色谱在医学方面的应用。
【关键字】HPLC（高效液相色谱） DHPLC（变性高效液相色谱）
1. 高效液相色谱概要
色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。根据流动相的状态可分为气相色谱法和液相色谱法。在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效固定相并采用高压泵输送流动相，全部工作通过仪器来完成。这种色谱称为高效液相色谱(1iighperformance liquid chromatography，HPLC)。
由于高效液相色谱法有分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广等优点，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物学与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛。另外，在高效液相色谱法的基础上不断发展，变性高效液相色谱法(DHPLC)随之兴起，广泛用于生物学、遗传学等领域。
2.高效液相色谱在生物学的应用
变性高效液相色谱法(DHPLC)是在高效液相色谱法的基础上发展起来的一种新方法。DHPLC采用高压闭合液相流路，将DNA样品自动注入并在缓冲液携带下流过DNA分离柱，通过缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度条件下，由荧光检测被分离的DNA样品，从而实现对DNA不同的分析它因使用的温度不同而有不同的应用价值：① 在非变性温度(40℃ ～5O℃ )条件下对不同长度的双链DNA进行分离，用于定量反相PCR、长度多态性分析以及杂合性缺失(LOH)分析等；② 在部分变性温度(51℃ ～75℃)条件下进行基因突变，单核苷酸多态性和CpG甲基化的检测；③ 在完全变性温度(70℃ ～8O℃)条件下对寡核苷酸进行质量控制和纯化，RNA分离及已知位点基因型的分析等。[1] 曹际娟等利用DHPLC能够吸收检测DNA片段并具有高度敏感性的特点，根据O1、O139、非01、非O139群霍乱弧菌外膜蛋白ompW 基因的特有基因组序列，进行PCR扩增，然后利用DHPLC检测，一次可同时自动化分析数百个样本，达到快速检测的目的．PCR-DHPLC技术与实时PCR技术检测致病菌相比，同样具备快速的优势，但在测试成本上却远远低于实时PCR技术，因而具有更广阔的应用前景。[2] 曲直等对高效液相色谱法分析放线菌渊G+C冤mol%含量的方法进行了摸索，找到了分离分析的较佳条件，用此方法对分离的8 株红树林放线菌进行了G+Cmol%含量的测定，实验结果表明，DNA 碱基分离效果好，无杂峰干扰，通过分析验证所测得的G+Cmol%含量与预期值相符，且检测速度快，因此高效液相色谱法为直接测定渊G+C冤mol%含量提供了一种快速简洁而精确的方法。[3]
中科院研究团队领衔完成小麦A基因组测序
？ 国－家食品药 品监督 － 。 ｜｜｜蟹理总。局挂ｌ辫 ≥≯ｕ－｜ ２０１３—０３—２２，国家食品药品监督管 理总局正式挂牌，国务院食品安全委员 会办公室主任张勇任局长、党组书记。 根据十二届全国人大一次会议通过的国 务院机构改革和职能转变方案，原国家 食品药品监督管理局的职责已经全部整 合到新组建的国家食品药品监督管理 总局。 （摘自ＺＧＳＰＡＱＢ。２０１３－０３－２３） ０鹤濠釜－茵诵辩 蠢 ■ 套建壤 誉建曩 ０＊ 。。尊 一Ｂ 。。 咆 。 ＾ ’寰一 ～矗 一 春节长假刚过，全国３Ｏ强饲料企业 大北农集团上半年的生产计划就已经排 满了。在辽宁建厂的大北农集团去年收 购了辽宁省两家饲料企业，通过改造升 级，今年计划将产量提高到２Ｏ万ｔ，实现 产量产值双翻番，至此，全国３Ｏ强饲料 企业中已有新希望六和、山东中慧等１３ 家在辽宁省投资建厂，推进了全省饲料 产业优化升级。 近两年，辽宁省饲料产业不仅培育 出辽宁禾丰、辽宁大成等一批在全国有 影响力的大型饲料企业集团，而且还吸 引了一批大型饲料企业在辽投资建厂。 目前，全省饲料产量超过１Ｏ万ｔ的企业 已达４２家，其中排名全国前３Ｏ位的企 业饲料产量达到５１５．６万ｔ，占全省饲料 产量的３８．２ 。规模企业在辽宁省发 展不仅扩大了全省饲料产业规模，强企 之间的技术创新和新产品开发“你追我 赶”也提升了全省饲料工业的科技水平， 非粮饲料和绿色生态饲料的开发稳步推 进，高效生态、安全无污染饲料添加剂的 研发进一步加强，优质环保型饲料、专用 饲料和安全饲料科学配方技术得到 推广。 （摘自ＮＭＲＢ。２０１３—０３—０５） ≯一硪！ 彖懿 哦超蒿。吾 ＿ 液相色谱 串联质谱法 ： ｜ ｌ快速烩溅兽 瓷飒 。 据ｔａｎｄｆｏｎｌｉｎｅ数据库消息，２０１３年 ２月《食品添加剂与污染物》杂志刊登一 项采用超高效液相色谱一串联质谱法 （ＵＨＰＩ Ｃ—ＭＳ／ＭＳ）快速检测动物源食 品中兽药的文章。 ＵＨＰＬＣ—ＭＳ／ＭＳ可用于１６Ｏ余种 不同种类的受管制类或禁用化合物的分 析，其中包括苯并咪唑、阿凡曼菌素等在 内的驱肠虫剂，酰胺醇类、Ｂ～内酰胺类、 大环内酯类、嘧啶类、喹诺酮类、磺胺类 和四环素类等抗生素类，８一兴奋剂，皮质 类固醇，离子载体，硝基咪唑类，非甾体 类抗炎药，类固醇和镇静剂。对样品进 行检测时，先用乙腈萃取，不经过其他纯 化，采用ＵＨＰＩ Ｃ—ＭＳ／ＭＳ法对样品进 行分析。根据欧盟委员会２０ｏ２／６５７／ＥＣ 决议中提供的指南验证定性检测方法。 经证明，上述检测方法适用于鸡蛋、蜂 蜜、牛奶和瘦肉样品中农残的常规检测， 其中样品目标浓度设置为欧盟规定的每 种药品浓度的一半。 （摘自ＳＰＨＢＷ。２０１３－０３－１３ Ｊ 碳水化合物长期摄取不 足 人群面临更高 死亡危险≥ 据日本读卖新闻网站报道，日本国 立国际医疗研究中心的最新研究结果表 明，米饭、面包等碳水化合物长期摄取不 足的人群将面临更高的死亡危险。 主持这项研究的是该中心糖尿病代 谢内分泌科主任医师的能登洋。能登洋 医生带领他的团队，在美国和欧洲等地 一共对年龄在３０４７０岁的２Ｏ万人进行 了５～２６年的追踪调查。通过对调查结 果的一系列分析论证，他们发现碳水化 合物的摄入量在卡路里摄入总量中所占 比例不足４成的人群的死亡率是碳水化 合物摄入量超过６成人群的１．３倍。 此前，有分析认为，在饮食中控制碳 水化合物的摄人量可以在短时间内控制 血糖水平、降低血液中的胆固醇含量，从 而降低心脏疾患的患病风险等。但是， 本次研究表明，如果长期少吃或不吃主 食，非但不能降低患心脏病的风险，带来 的恐怕是更严重的健康隐患。 （摘自ｚＧＳＰＢ，２０１３－０３－０５） ２０１３－Ｎｏ．４搏ＣＥＲＥ ＡＬ＆Ｆ饲ＥＥＤ料ＩＮＤｌＵＳＴ．‘｝ＲＹＣＥＲＥＡＬ ＦＥＥＤ ＮＤＵＳＴＲＹ 、 ｊ ｌｌ 中科ｊ院研竞自＿队领 街 －－完成 小麦Ａ 基目组 谢序 中国科学院２０１３—０３－２５发布消息 说，该院遗传与发育生物学研究所一个 科研团队首次完成了小麦Ａ基因组的 测序和草图绘制，比较全面地揭示出Ａ 基因组的结构和表达特征。这一成果已 获最新一期国际著名学术刊物《自然》在 线发表。 专家称，小麦Ａ基因组测序和基因 组图谱绘制的完成，将为研究小麦驯化 史提供一个全新的视角，并为多倍体小 麦基因组的测序分析提供二倍体基因组 参照序列。其注释出的基因信息和分子 标记有助于加速小麦的遗传改良，对保 障粮食安全和农业可持续发展具有重要 作用。 这项研究由中科院遗传与发育生物 学研究所植物细胞与染色体工程国家重 点实验室小麦研究团队领衔发起，通过 与深圳华大基因研究院和美国加州大学 戴维斯分校合作顺利完成。研究团队利 用新一代测序技术，对二倍体乌拉尔图 小麦Ｇ１８１２系的基因组进行测序、组 装、注释及相关分析，鉴定出３４ ８７９个 编码蛋白基因，其基因数量与已知禾本 科植物基因组的基因数相似。 基因组比较研究发现，在进化过程 中由于大量反转座子重复序列在基因间 的插入，导致小麦Ａ基因组的剧烈扩 增。通过同源基因的比对和关联分析， 鉴定出一批控制重要农艺性状的基因。 该研究还筛选出大量的遗传分子标记， 将促进小麦的分子育种。 （摘自ＺＧＸＷＷ，２０１３－０３－２５） ０回 ｆ钢蝌蒿产量首恢＿ 馥 Ｉｌｊ ｌｌｔｊ大奏ｌｌｌ
小麦T、 K、 V型胞质不育系和杂种mtDNA的RAPD分析及育性相关片段的克隆
第27卷第2期作 物 学 报Vol.27,No.22001年3月ACTAAGRONOMICASINICAMar.,2001
小麦T、K、V型胞质不育系和杂种mtDNA的RAPD分析及
育性相关片段的克隆Ξ
孙兰珍 姚方印ΞΞ 李传友 李利斌 刘保申 高庆荣
(山东农业大学农学系,山东泰安271018)
提 要 用RAPD技术对细胞质分别来源于粘果山羊草(Ae.kotschyi)、偏凸山羊草(Ae.ventricosa)、提莫菲维小麦(T.timopheevii)的三种普通小麦雄性不育系22K型、V型、T型及相应的保持系、恢复系以及杂种F1代的线粒体DNA(mtDNA)进行了比较分析。结果如下:(1)发现在mtDNA组织结构上K型、V型、T型不育系之间以及与保持系之间均呈现差异,这从DNA水平上提供了三类不育系胞质来源不同的证据;(2)利用23个引物的扩增结果进行了聚类分析,绘制出了T型、K型、V型三种不育系、保持系和K、V型共同的恢复系及杂种F1代树式遗传关系图;(3)对两个特异的多态性DNA片段进行了回收,克隆、并制备探针,Southern杂交结果显示不育系与保持系间存在多态性,有两个片段可能与育性有一定的联系。
关键词 普通小麦(T.aestivum);细胞质雄性不育;线粒体DNA;RAPD分析
RAPDAnalysingofCMS-T,K,VmtDNAsandCloningofmtDNA
FragmentsAssociatedwithCMS-KinWheat
SUNLan2Zhen YAOFang2Yin LIChuan2You LILi2Bin LIUBao2Shen
GAOQing2Rong
(DepartmentofAgronomy,ShandongAgriculturalUniversity,Taian,Shandong271018,China)
Abstract MitochondrialDNAs(mtDNAs)fromthreetypesofcytoplasmicmalesterilitylines(CMS2K,2Vand2T)inwheat,ofwhichthecytoplasmderivedfromAe.kotschyi,Ae.ventricosaandT.timopheevii,respectively,werecomparedamongCMSsandtheirmaintainer,restorerandhybridsofCMS2Kand2V.Theresultsindicatedthat:(1)themtDNAsfromCMS2K,2Vand2Tweredifferentfromeachotherandfromtheirmaintainer,thisprovidedsomeevidenceatmolecularlevelforthreekindsofCMSlineswithdifferentcytoplasms;(2)thegeneticdendrogramwasmadeandtherelativegeneticdistanceamong7differentwheatmaterialswascalculatedbyclusteranalysiswithamplificationproductsfrom23primers;(3)twospecificfragmentsofmtDNAwerethenclonedintoplasmidvectorandconvertedintoRFLPprobes.Southernhybridizationpatternsrevealedpolymorphismbetweensterilelineandmaintainerline.