SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂配制SDSPAGE 电泳试剂配制在生物化学和分子生物学的研究领域中，SDSPAGE 电泳是一种常用的技术手段，用于分离和分析蛋白质。
而要成功进行 SDSPAGE 电泳实验，准确配制各种试剂是至关重要的一步。
接下来，让我们详细了解一下 SDSPAGE 电泳试剂的配制方法。
首先，我们来谈谈分离胶缓冲液的配制。
分离胶缓冲液通常使用TrisHCl 缓冲液，其 pH 值一般在 88 左右。
配制时，我们需要称取一定量的 Tris 碱，然后加入适量的浓盐酸进行调节 pH 值。
这个过程需要用到 pH 计来精确测量，以确保 pH 值的准确性。
一般来说，每升分离胶缓冲液中，Tris 的用量约为 1815g，而浓盐酸的用量则需要根据实际测量的 pH 值进行调整。
接下来是浓缩胶缓冲液的配制。
浓缩胶缓冲液的 pH 值通常为 68，同样使用 TrisHCl 缓冲液。
配制方法与分离胶缓冲液类似，但 Tris 的用量和浓盐酸的用量有所不同。
每升浓缩胶缓冲液中，Tris 的用量约为 606g，浓盐酸的用量也需要根据实际 pH 值测量结果进行微调。
然后是 30%丙烯酰胺溶液的配制。
这是 SDSPAGE 电泳中的关键试剂之一。
丙烯酰胺是一种有毒物质，在配制过程中需要特别小心。
我们将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺按照 29:1 的比例混合。
称取 29g 丙烯酰胺和 1g 甲叉双丙烯酰胺，加入适量的去离子水，搅拌溶解后，定容至 100ml。
需要注意的是，丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应戴手套在通风橱中进行。
SDS 溶液的配制也不能马虎。
SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂。
称取 10g SDS，加入适量的去离子水，加热搅拌溶解后，定容至 100ml。
10%过硫酸铵溶液是引发丙烯酰胺聚合的重要试剂。
称取 1g 过硫酸铵，加入 10ml 去离子水，现配现用。
因为过硫酸铵溶液不稳定，容易分解，所以不宜长时间保存。
电泳缓冲液也是必不可少的。
蛋白质电泳操作步骤
SDS-PAGE电泳操作步骤：试剂配制：（实验中采用均为分析纯）（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。
(试剂有毒，操作中注意防护)（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。
（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。
（4）10% SDS（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。
（6）尿素（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：a．固定液20%三氯乙酸b．脱色液250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。
c．染色液称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中样品处理：处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量
SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量一、药剂准备a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml3、10%SDS 5ml4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。
可可5、TEMED 0.5 ml6、1M Tris-HCL,PH6.8 15mlb、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）2ml，1ml/管，共2管c、蛋白质分子量标准（200ul）d、SDS-PAGE电泳液（1L）由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。
（不宜超过两周）e、考马斯亮染色液（250ml）f、考马斯亮染色脱色液（500ml）注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：甲醇或者乙醇乙酸250ml 80ml去离子水补至 1000ml,混匀，备用。
二、器材准备移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子三、SDS-PAGE 分析操作过程：1、配制蛋白质溶液用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。
确保质量分数为3～5g/L。
试管依次标号1、2、3、4、5。
用保鲜膜和皮筋封口保存备用。
最好当天现配。
2、制分离胶（即下胶层）鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。
按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。
依照15%胶，5ml（打勾）一栏。
如图：注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。
a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。
b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。
SDS-PAGE自制胶操作规程
SDS-PAGE自制胶操作规程一：试剂准备SDS-PAGE电泳所用溶液：30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL)丙稀酰胺(Arc)29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺(Bis)0.8g，加入去离子水定容至100mL，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
将商品用的40 %聚丙烯酰胺溶液稀释到浓度为30 %，冰箱4℃保存。
分离胶缓冲液1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：23.23gTirs碱，溶于80mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至8.8，定容至150mL。
浓缩胶缓冲液0.5mol/L Tris·HCl，pH6.8： 6.0gTirs碱，溶于60mL去离子水中，加入盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL。
10％SDS：2gSDS溶于去离子水中，定容至20mL，加热至68℃助溶。
10％过硫酸铵：0.1g过硫酸铵，溶于1mL去离子水中；现配现用或分装冷冻备用。
TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
1×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)Tris碱 3.03甘氨酸(电泳级) 14.4gSDS 1g2×SDS凝胶还原型加样缓冲液(5mL)0.25 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 1 mLSDS 0.25g甘油0.189gβ-巯基乙醇 2.5ml(DTT（二硫苏糖醇）0.385g溴酚兰0.001g双蒸水定容到5ml考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 1.0g甲醇450 mL冰醋酸100 mLddH2O 450 mL考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）450mL乙醇（甲醇）450mL冰醋酸100mLddH2O 450mLPH7.4PBS（0.01M）1LKH2PO4 1 mLNa2HPO40.25gNaCl 0.189gKCl 2.5ml二：凝胶配置1 2 3 41．将短玻璃板放在带有边条的长玻璃板上，做成玻璃板夹心。
玻璃板应保持干燥洁净。
sdspage电泳试剂配制
SDS-PAGE电泳试剂1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL；3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL；4) 4⨯分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL；5) 4⨯浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL；6) 10⨯电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL；7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；8) 2⨯SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL；9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4⨯分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4⨯浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。
SDS-PAGE电泳相关溶液的配置
电泳相关溶液的配置：1、30%丙稀酰胺混合溶液（100ml）：称取29g丙稀酰胺和1g bis丙稀酰胺，用水溶解定容到100ml，过滤，4摄氏度保存一个月。
2、5×SDS电极缓冲液：称取Tris base15.1g，甘氨酸94.g，SDS 5.g 加dH2O定容至1000ml。
3、2×样品缓冲液（10ml）：甘油2ml，溴酚蓝0.0202g，1MTris·Cl （pH6.8）1ml巯基乙醇0.14ml，10%SDS 4ml。
4、染色液的配制（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸；在电子天平上称取0.125%考马斯亮蓝R250 1.25g，再将其一一加到1000ml锥形瓶中，用蒸馏水加以补足至1000ml。
加入的先后顺序为：考马斯亮蓝R250，甲醇或者乙醇，蒸馏水，乙酸。
充分混匀后进行过滤，收集滤液备用。
当过滤速度变慢时要更换滤纸，快速过滤完，不可隔夜以免影响染色效果。
5、脱色液（1000ml）:用量筒分别量取250ml甲醇或者乙醇、80ml乙酸、670ml蒸馏水加入烧杯中，待溶液混和均匀后加入盛脱色液的广口瓶；备用。
收集液的SDS-PAGE分析：1、取20ul收集液，加入5×样品缓冲液5ul，在80℃水浴锅中煮5min。
分离胶配方Resolving Gel (10ml)6%8%10%12%15%H2O 5.4 4.7 4.1 3.4 2.430% acrylamide mix 2.0 2.7 3.3454x resolving-gel buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.520% SDS0.050.050.050.050.0520% APS0.050.050.050.050.05TEMED0.0080.0060.0040.0040.004浓缩胶配方（10ml）H2O 6.9 ml30% acrylamide mix 1.7 ml8x stacking-gel buffer1.25 ml20% SDS0.05 ml20% APS0.05 mlTEMED0.01 ml2、按照上面配方制SDS-PAGE凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。
SDS-PAGE电泳
SDS-PAGE 测量蛋白分子量所需试剂及仪器：试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg。
仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。
母液：1、2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。
高压灭菌处理。
2、1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。
高压灭菌处理。
3、10%SDS100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。
4、50%（w/v）甘油100ml：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。
5、1%（w/v）溴酚兰10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。
6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml：0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。
7、1M DTT20ml：20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml/份，-20℃保存。
工作液：1、30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml：丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37℃溶解，定容到100ml。
0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存。
pH≤7.0。
2、4×分离胶缓冲液（B液）100ml： 75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)4ml 10%SDS21ml蒸馏水4℃存放。
3、4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml： 50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)4ml 10%SDS46ml蒸馏水4℃存放。
SDS-PAGE凝胶电泳操作
SDS-PAGE凝胶电泳操作一、常规试剂的配制1. 30% 聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺 150g，甲叉双丙烯酰胺4g，双蒸水500ml，滤纸过滤后，棕色瓶避光4℃保存；2.1.5mol/L，pH 8.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：18.15g Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4℃保存；3. 1.0mol/L，pH 6.8 Tris-HCl分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4℃保存；4. 10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存；5. 10% AP溶液：0.1g AP（过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制；6. 1×SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris（3.0285g/L），192mM甘氨酸（14.41g/L），0.1%SDS （1g/L），pH 8.30；7. 染色液：0.25g 考马斯亮蓝R-250溶解于45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸，过滤除去杂质；8. 脱色液：45ml甲醇，45ml水，10ml冰醋酸；9. 固定液：50ml甲醇，40ml水，10ml冰醋酸；10. 2×SDS-PAGE上样缓冲液：10% SDS 0.4ml，0.375M Tris-HCl（pH 6.8）0.333ml，甘油0.2ml，1% 溴酚兰10μL，β-疏基乙醇100μL，加水定容至1ml，分装后-20℃保存。
二、样品的处理1. 蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解1h（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。
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SDS-PAGE电泳试剂
1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；
2) 1.5M Tris-HCl(pH ：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100mL；
3) 1M Tris-HCl(pH ：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100 mL；
4) 4?分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HCl(pH ，定容至100mL；
5) 4?浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HCl(pH ，定容至100mL；
6) 10?电泳缓冲液(pH ：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O溶解,定容至100mL；
7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL；
8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH ，?-巯基乙醇，SDS 0.6g，甘油mL，%溴酚兰mL，ddH2O ；
9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL；
10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成；
11) 分离胶%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps (现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL；
12) 浓缩胶（5％）：ddH2O ，30%储备胶，4?浓缩胶缓冲液，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。
Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳
1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备
1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。
2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。
3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M HCl
滴定至pH8. 45 ,再加水稀释至500mL。
2 丙烯酰胺储存液配制
1）3C-丙烯酰胺储存液(3C-stock)
将48g 丙烯酰胺和1. 5g 甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中配成100mL 49. 5 %的储存液。
2）5C-丙烯酰胺储存液(5C-stock)
用重蒸水溶解47g 丙烯酰胺和2. 5g 甲叉双丙烯酰胺成100mL 49. 5 %的储存液。
3 Tricine-SDS-PA GE 的凝胶制作
1）小孔胶3mL : 1mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 4 g 甘油、1mL“6 C 凝胶储存液”、用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
2）夹层胶3 mL: 1 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 61 mL“3C凝胶储存液”, 用去离子水稀释至3 mL , 临用时加入10ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
3）浓缩胶2 mL : 0. 5 mL 凝胶缓冲液(3x)、0. 16 mL“3C 凝胶储存液”, 用去离子水稀释至2 mL , 临用时加入10 ｕL 的10% 过硫酸氨溶液和1 ｕL 的TEMED。
用垂直小电泳槽制胶电泳。
先铺小孔胶, 接着均匀注入夹层胶, 凝胶聚合后再铺浓缩胶。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)分析
1）准备：
电泳玻璃板用双蒸水洗净，戴上手套再用无水乙醇擦拭玻璃板、梳子等并晾干，按说明安装好电泳装置。
2）%分离胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O 4mL
30%储备胶5mL
4?分离胶缓冲液3mL
10% Aps(现配)
100%TEMED
轻轻旋转混匀溶液，用5mL移液器灌入玻璃板间，以水封顶，使液面平整。
3）5％浓缩胶灌制
取一洁净的20mL烧杯，分别加入：
ddH2O
30%储备胶
4?浓缩胶缓冲液
10% Aps 50 μL
100%TEMED 5 μL
待分离胶凝聚后，再配制5%的积层胶，将分离胶上的水倒去，灌入积层胶，立即将梳子插入玻璃板间，待积层胶聚合后，拔出梳子，用蒸馏水洗尽凝胶顶部。
4）上样与电泳
将凝胶玻板置于电泳槽中，加入事先准备好的电泳缓冲液，加样完毕后，使样品端与阴极连通，另一端与阳极相连，根据本试验蛋白质大小等各项特性，分离胶选用120V固定直流电压，积层胶选用60V固定直流电压，当样品中溴芬兰色带快接近凝胶顶部时结束电泳，约3小时。
5）染色及脱色
电泳结束后，用考马斯亮蓝染液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转2小时，回收染液，用脱色液浸泡凝胶，放摇床上室温缓慢摇动脱色，每两小时换一次脱色液，直至脱色完全后用数码像机拍照保存。