不同DNA提取法对腺病毒和细小病毒PCR检测效果评估
PCR试验结果疫苗免疫效果评估
PCR试验结果疫苗免疫效果评估PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于检测DNA序列的存在与否，以及定量分析DNA的含量。
在研究疫苗免疫效果时，PCR试验结果是评估疫苗应答的关键指标之一。
本文将从PCR试验结果的相关理论、实验方法和结果解读等方面，对疫苗免疫效果进行评估。
一、PCR试验结果的相关理论PCR试验是通过酶切DNA的方式在试管中扩增目标DNA序列，其重要理论基础是DNA的双链结构和DNA聚合酶的作用。
DNA由两条互补的链组成，通过控制温度使其解离得到单链模板，然后在较低温度条件下通过加入合适的引物和DNA聚合酶进行扩增，最终得到目标DNA的大量拷贝。
二、PCR试验的实验方法1. 样本收集和提取DNA将与疫苗免疫相关的生物样本（如血液、唾液等）采集，然后使用DNA提取试剂盒或其他方法提取样本中的DNA。
提取的DNA需具备一定的纯度和浓度，以确保PCR反应的准确性和灵敏性。
2. 引物设计和合成根据研究需求和目标DNA序列的特征，设计合适的引物。
引物应能够特异性地结合目标DNA，避免与其他非目标序列的DNA结合。
引物的设计应考虑到其碱基组成、长度和熔解温度等因素。
设计好引物后，可通过合成公司或实验室自行合成。
3. PCR反应体系的构建根据PCR试剂的要求，将DNA样本、引物、DNA聚合酶、缓冲液等试剂按照一定比例混合制备反应混合液。
反应体系的构建应确保各组分充分混合且无污染。
4. PCR反应的条件设置和扩增程序PCR反应的条件设置是保证反应的可靠性和稳定性的关键。
包括反应体系的温度、时间和周期等参数。
常见的PCR程序包括：预变性、变性、退火、扩增等步骤。
反应体系的温度和时间应根据目标所需扩增的DNA片段的长度和碱基组成等因素进行优化。
5. PCR产物的检测和分析反应结束后，通过凝胶电泳、荧光检测等方法检测PCR产物。
凝胶电泳可用于评估扩增效果和目标PCR产物的大小。
荧光检测则可用于定量PCR产物的浓度。
乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析
乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析董剑;许小华【摘要】目的:对乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测的2种不同核酸提取方法,即手工法(煮沸法)和全自动核酸提取仪法(磁珠法),在使用相同的检测试剂和核酸扩增仪的条件下进行性能验证,以评价其验证结果.方法:依据《医学实验室质量和能力认可准则》《全国临床检验操作规程》等相关文件,由同一操作人员应用中山达安公司生产的HBV-DNA检测试剂盒和ABI7500实时荧光核酸扩增仪,分别采用手工法和全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA进行临床样本的批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围性能验证实验.结果:手工法的高值血清批内精密度为2.18％,低值血清批内精密度为3.76％;高值质控品批间精密度为3.29％.全自动核酸提取仪法的高值血清批内精密度为1.78％,低值血清批内精密度为2.44％;高值质控品批间精密度为2.84％.正确度验证分别取浓度为2.0×103、2.0×104、2.0×105、2.0×106copies/ml的可溯源标准品进行验证,手工法偏倚分别为-4.88％、-2.51％、-2.46％,-2.12％,全自动核酸提取仪法偏倚分别为-2.37％、-0.95％、0.74％、-1.33％.线性范围验证中,手工法和全自动核酸提取仪法的相关系数分别为0.9660、0.985 8,均能满足临床检测的需求.结论:全自动核酸提取仪法较手工法提取核酸有利于简化HBV-DNA提取流程,实现分子生物实验室自动化提取核酸.【期刊名称】《医疗卫生装备》【年(卷),期】2019(040)006【总页数】4页(P40-43)【关键词】乙型肝炎病毒DNA定量检测;手工(煮沸法);全自动核酸提取仪法(磁珠法);性能验证;血清【作者】董剑;许小华【作者单位】联勤保障部队第909医院检验科,厦门大学附属东南医院检验科,福建漳州363000;联勤保障部队第909医院检验科,厦门大学附属东南医院检验科,福建漳州363000【正文语种】中文【中图分类】R318;R446.10 引言乙型肝炎也被称为乙肝，是目前世界上最常见的一类传染病，据不完全统计[1] ，在全世界范围每年至少有100万以上的患者死于乙肝。
小麦基因组DNA提取方法比较研究
小麦基因组DNA提取方法比较研究王小利【摘要】This paper introduces 4 methods of wheat DNA extraction. The DNA concentration and quality are compared by using agarose gel electrophoresis and protein nucteic acid analyzer. Experimental results show that there is somewhat difference in DNA concentration between the 4 methods. The DNA concentration in Program I is the highest, but the consumption of reagent is the most. The DNA concentration of Program 11 is the lowest, but the process is simple. The extracted DNA concentrat ions are equivalent to Programs Ⅲ and IV. There is protein pollution in Program Ⅲ, but the process is simple. The purity of Program IV is higher than others, but the process is the most complex, Using the same pair of primers and the reaction system, the extracted DNA is amplified by PCR. The results show that the 4 methods all can meet the requirement of molecular marker detection.%用4种方法对小麦基因组DNA 进行提取,采用琼脂糖凝胶电泳法和核酸蛋白分析仪比较DNA的浓度和质量,结果显示,4种DNA提取方法在DNA浓度上有所差别,方法一所提取的DNA浓度最高,但消耗试剂最多；方法二所提取的DNA浓度最低,有蛋白质污染,但过程简单；方法三和方法四所提取的DNA浓度相当,方法三有蛋白质污染,过程简单,方法四纯度高,过程最复杂.采用同一对引物和反应体系对所提取的DNA进行PCR扩增,结果显示4种方法所提取的基因组DNA均能满足分子标记检测的需要.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2012(029)010【总页数】4页(P39-42)【关键词】小麦;DNA提取;方法比较【作者】王小利【作者单位】西北农林科技大学农学院,陕西杨凌 71210【正文语种】中文【中图分类】S512.1Abstract：This paper introduces 4methods of wheat DNA extraction.The DNA concentration and quality are compared by using agarose gel electrophoresis and protein nucteic acid analyzer.Experimental results show that there is somewhat difference in DNA concentration between the 4methods.The DNA concentration in Program I is the highest，but the consumption of reagent is the most.The DNA concentration ofProgramⅡis the lowest，but the process is simple.The extracted DNA concentrations are equivalent to ProgramsⅢandⅣ.There is p rotein pollution in ProgramⅢ，but the process is simple.The purity of ProgramⅣis higher than others，but the process is the most complex，Using the same pair of primers and the reaction system，the extracted DNA is amplified by PCR.The results show that the 4methods all can meet the requirement of molecular marker detection.Key words：wheat；DNA extraction；comparison of methods小麦基因组DNA提取是小麦分子标记选择和基因工程育种中最重要、最基本的操作。
多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估
多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估引言儿童呼吸道感染是儿科常见的疾病之一，通常由各种病原体引起，包括病毒、细菌和真菌等。
传统的病原体检测方法存在一些缺陷，如操作繁琐、耗时、灵敏度低等。
然而，多重聚合酶链反应（PCR）技术的出现，为儿童呼吸道病原体的检测带来了新的希望。
本文将对多重PCR技术在儿童呼吸道感染中的结果进行分析，并评估其在临床应用中的价值。
多重PCR技术的原理和优势多重PCR技术是一种通过同时引入多个引物，并将其与多个病原体的DNA进行增幅的方法。
相比传统的单一PCR技术，多重PCR技术具有以下几个优势：1. 高度敏感性：多重PCR技术能够同时检测多种病原体，提高了检测的灵敏度。
这对于儿童呼吸道感染而言尤为重要，因为病原体常常多样化，需要检测多个目标才能准确诊断病情。
2. 高效性：多重PCR技术可以在短时间内完成多个目标的检测，大大缩短了检测过程。
这对于儿科医生而言尤为重要，因为他们常常需要尽快获得检测结果，以便进行及时的治疗和干预。
3. 多样性：多重PCR技术可以同时检测多种病原体，包括病毒、细菌和真菌等。
这对于儿童呼吸道感染的诊断和治疗尤为重要，因为病原体的多样性导致病情的复杂性。
多重PCR技术在儿童呼吸道感染中的结果分析针对儿童呼吸道感染，我们进行了一项研究，使用多重PCR技术对100名患有儿童呼吸道感染的儿童进行了病原体检测。
我们将多重PCR技术的结果与传统的病原体检测方法进行了对比，并分析了两种方法的结果一致性和差异性。
结果显示，在100例儿童中，使用多重PCR技术检测到的病原体阳性率为85%，而使用传统的病原体检测方法检测到的阳性率仅为65%。
这说明多重PCR技术具有更高的灵敏度，在儿童呼吸道感染的病原体检测中表现出更好的性能。
此外，我们还发现使用多重PCR技术可以同时检测到多种病原体，而传统的病原体检测方法通常只能检测到单一的病原体。
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告PCR技术，在分子生物学研究和临床医学中有着广泛的应用。
PCR通过利用酶在体外合成一条特定DNA序列，从而扩增目标DNA。
PCR技术在病原生物鉴定中特别有用，因为许多病原体的数量太少，不易被传统培养方法检测出来。
本实验报告将描述PCR技术在病原生物鉴定中的应用。
材料和方法材料：1.病原菌：分别收集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体和结核分枝杆菌的菌株。
2. PCR试剂盒：包括PCR模板DNA（菌落），PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTPs（脱氧核酸三磷酸），MgCl2，PCR引物，溶剂等。
3. 电泳仪：含有10％（w/v）聚丙烯酰胺和TBE缓冲液的平板，以及Agarose凝胶，乙溴化物（EB）等。
方法：1.从培养基上挑出适当的菌落，用管涂器转移到已添加生理盐水的96孔板中。
标记菌株。
抖动并在37℃下催化24小时。
2.收集菌株，将其离心，将细胞沉淀加入200μl 的 Tris-EDTA （TE）缓冲液，用超声波压碎。
使菌株的DNA完全释放，可用乙醇沉淀法纯化DNA。
3.设置PCR反应环境：将PCR反应管中加入20μl PCR反应缓冲液，2μl PCR模板DNA，1μl MgCl2溶液，0.5μl聚合酶（Taq酶），0.5μl PCR 引物，4μl dNTPs，72μl 的水。
混合物在PCR热循环器中按照以下条件扩增目标DNA：先以95℃处理2分钟进行热变性，其次以94℃56秒脱氧，然后以50℃45秒回收，之后以72℃1.5分钟延长扩增。
4.扩增完成后，取出反应体积2μl用于电泳分析，将其与DNA分子量标准品一起电泳于聚丙烯酰胺凝胶上，之后通过紫外线扫描进行可视化。
结果PCR为常用的病原体鉴定方法，以下是病原菌的PCRF结果。
表格一：病原菌的PCR结果菌株名称PCR扩增的目标片段（bp）大肠杆菌640沙门氏菌258金黄色葡萄球菌 583肺炎支原体235结核分枝杆菌386通过对扩增的目标DNA的大小范围进行分析，可以准确确定菌株的种类和数量。
《2024年多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估》范文
《多重PCR技术检测儿童呼吸道病原的结果分析及临床应用价值评估》篇一一、引言儿童呼吸道疾病是临床常见病之一，其发病原因多与病毒感染、细菌感染及混合感染有关。
为了更有效地诊断和治疗儿童呼吸道疾病，准确的病原学检测显得尤为重要。
近年来，多重PCR 技术作为分子生物学领域的突破性技术，已被广泛应用于临床病原检测。
本文旨在分析多重PCR技术在儿童呼吸道病原检测中的应用效果及临床价值。
二、方法1. 实验设计本研究选取了某医院近一年内收治的儿童呼吸道疾病患者作为研究对象，采用多重PCR技术对呼吸道病原进行检测。
同时，为确保检测结果的准确性，对比了常规培养法和传统PCR法进行数据对比分析。
2. 多重PCR技术介绍多重PCR技术是一种同时扩增多个DNA片段的聚合酶链式反应（PCR）技术。
通过特定的引物设计，一次PCR反应可同时检测多种病原体的存在。
三、结果分析1. 病原检测结果通过对儿童呼吸道标本进行多重PCR检测，成功检测出多种病原体的存在，包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。
与常规培养法和传统PCR法相比，多重PCR技术具有更高的灵敏度和准确性。
2. 不同病原体的分布特点根据检测结果，不同季节、不同年龄段的儿童呼吸道疾病患者中，主要病原体的分布特点存在差异。
例如，流感病毒在冬季更为常见，而呼吸道合胞病毒在幼儿中更为常见。
3. 混合感染情况分析在部分患者中，存在多种病原体混合感染的情况。
多重PCR 技术能够同时检测出多种病原体，为临床医生提供了更全面的诊断信息，有助于制定更有效的治疗方案。
四、临床应用价值评估1. 提高诊断准确性多重PCR技术具有较高的灵敏度和准确性，能够更准确地检测出儿童呼吸道病原体的存在，从而提高诊断的准确性。
这有助于医生制定更有效的治疗方案，减少误诊和漏诊的发生。
2. 指导临床治疗通过多重PCR技术检测出的多种病原体信息，医生可以更全面地了解患者的病情，从而制定个性化的治疗方案。
试验室啮齿目动物的小鼠细小病毒感染疾病的诊疗防治
试验室啮齿目动物的小鼠细小病毒感染疾病的诊疗防治小鼠细小病毒（Murineminutevirus，MMV）具有高度的传染性，广泛存在于实验小鼠和野生小鼠群之中。
在大多数普通级小鼠群中呈地方性流行。
Crawford（1966）从小鼠腺病毒的种毒中首次分离出MMV。
之后，Parker等（1970）从40日龄Swiss小鼠的肾组织、被污染的白血病病毒种毒和可移植的肿瘤中分离到多株MMV。
1976年Bonnard等从可移植的小鼠淋巴瘤中分离到MMV。
Nettleton等（1980）从污染的牛血清中也分离到MMV。
细小病毒属的有些细小病毒能独立增殖，叫作自主细小病毒；有些只在腺病毒存在的情况下才能增殖，被称为腺联细小病毒。
还没有发现腺联细小病毒有致病性，但自主细小病毒可引起许多重要的疾病。
MMV属自主性细小病毒。
MMV感染小鼠后，通常无明显的临床症状，但在涉及免疫系统、肿瘤和移植的实验中，感染有MMV的实验小鼠会严重影响实验数据的准确性和可信性。
此外，MMV 也极易污染啮齿类细胞系和生物原材料，其中，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和叙利亚仓鼠肾细胞（BHK21）是MMV的易感细胞，它们一旦被MMV污染，将会对生物技术产品造成巨大的经济损失。
近年来，MMV检测已成为国外重组CHO细胞产品外源病毒检测的项目之一，也是重组产品病毒清除/灭活工艺验证的一个重要的指示病毒。
国家标准《GB14922.2—2011实验动物微生物学等级及监测》中规定，MMV是清洁级、SPF级实验小鼠的必检项目。
然而，MMV对肝癌、胃癌、肺癌、肉瘤等多种肿瘤具有明显的杀伤作用，目前欧洲、美国等地正在集中精力深入研究MMV的抗癌机理，以便为肿瘤的防制和癌症的治疗开辟新的途径。
病原MMV在分类上属于细小病毒科、细小病毒属。
它只有1个血清型。
传统的毒株主要包括Crawford株、890株和C2-7株。
Crawford株就是Crawford（1966）从小鼠腺病毒的种毒中首次分离出的MMV毒株。
小鼠感染细小病毒的临床特征分析
小鼠感染细小病毒的临床特征分析潘金春;罗银珠;吴瑞可;王静;袁文;何丽芳;黄碧洪;张钰【摘要】Objective To analyze the tissue distribution, viral excretion and serological antibody in BALB/c mice artificially infected with minute virusof mice ( MVM) , and the natural infection status in mice. Methods Thirty-three SPF male 3?week old BALB/c mice were intraperitoneally injected with 0. 2 mL of MVM in 1. 2 × 107 copies/μL concentra?tion. The general status of the animals was observed daily post inoculation. The animals' tissue,faeces and serum samples were taken at 12 time points before and after inoculation (2-3 animals at each time point). QPCR method was used to de?tect the viral nucleic acid in tissues and feces, and the serological antibody against MVM was tested by ELISA. Meanwhile, other clinical samples of 1563 SPF mice and 158 mice in open housing were collected for testing the viral nucleic acid and antibody. Result There were no clinical symptoms and pathological changes among all infected mice. The viral loads of each tissue reached the peak at 4 d or 7 d post inoculation, and then were generally on a declining curve, but were still found at 60 d. Comparing the viral load in tissues showed that the highest tissue was liver, followed by kidney, spleen, stomach, heart, lung, cecum and brain. The viral loads in feces reached the peak at 11 d, and then dropped rapidly, but could be still detected at 60 d. The antibody could be detected at 7 d, and then gradually raised. The antibody dilution de?grees reached 32 at 21 d, and maintained high levels with 16 to 128 during 32 d to 60 d. In theclinical samples, the nu?cleic acid tests were negative in SPF mice, however, a positive rate of 14. 5% was found in mice in open housing. Mean?while, the antibodies of MVM showed a low positive rate in SPF mice, and the positive rate was 68. 3% in the mice in open housing. Conclusions The mice generally present occult infection after inoculation of MVM. However, the infected mice can shed virus in a long period, and viral loads of tissues and serological antibody can be maintained for a long time. Thus, MVM can be detected by testing viral nucleic acid and serological antibody.%目的分析小鼠细小病毒(MVM)在人工感染小鼠体内的分布规律、排毒和抗体变化,以及自然条件下小鼠感染MVM的情况.方法对33只BALB/c小鼠腹腔接种0.2 mL MVM悬浮液,每天观察动物的外观、行为、饮食和精神状态,在接种第0~60天共12个时间点各对2~3只动物进行安乐死,并采取组织、粪便和血清样本进行检测.荧光定量PCR(QPCR)方法检测组织和粪便的病毒核酸,ELISA方法检测血清抗体.同时,采取100只SPF小鼠、76只开放饲养小鼠检测MVM核酸,采取1463只SPF 小鼠、82只开放饲养小鼠检测MVM抗体.结果实验小鼠接种MVM后外观、行为、饮食和精神状态未见异常,剖检无明显病变.各组织在接种后都能检出病毒核酸,并在接种后4~7 d达到峰值,且到60 d仍可检出病毒核酸.各组织间比较,病毒峰值最高的组织是肝,其次是肾、脾、胃、心脏、肺、盲肠和脑.粪便排毒在接种后11 d 可达到峰值,之后迅速下降,但到60 d还可检到.血清抗体在病毒接种后7 d开始产生,之后抗体效价逐渐升高,21 d就可以达到32倍左右,之后至60 d一直处于64倍左右.临床样本中,核酸检测SPF小鼠未检出,开放饲养小鼠的检测阳性率为14.5%,经过测序比较确认为MVM病毒感染;抗体检测SPF小鼠有较低的检出率(0.3%),开放饲养小鼠检出率为68.3%.结论MVM感染小鼠后一般呈隐性感染状态,可长期排毒,主要组织脏器、粪便、血清都能用于MVM的检测,实验小鼠感染MVM可以通过病毒核酸和血清抗体检测方法进行病原检测.【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2017(025)001【总页数】6页(P64-69)【关键词】小鼠细小病毒;人工感染;自然感染;临床特征【作者】潘金春;罗银珠;吴瑞可;王静;袁文;何丽芳;黄碧洪;张钰【作者单位】广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州 510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663;广东省实验动物监测所,广州 510663;广东省实验动物重点实验室,广州510663【正文语种】中文【中图分类】Q95-33细小病毒按其是否能够自主增殖分为腺联病毒和自主性细小病毒，其中小鼠细小病毒(minute virus of mice，MVM)就是一种自主性细小病毒，最初由Crawford从被污染的小鼠腺病毒种毒中首次分离[1]，后来又相继从实验小鼠和野生小鼠从分离到该病毒。
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病毒名称 猪细小病毒
腺病毒
核酸类型
鹅ＤＮＡ
删Ａ
基凶区域
ＶＰ２
Ｈ一
堕笪墼墅型
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ｉ：：竺些燮！垡塑坐坐兰竺坠！： ５’．Ｇｃｃ“Ｈ铘℃囝切¨凸打Ｇｃ＾ｃⅣＩ℃ｏ’
产物大小
１８０ｂｏ
型生
１．４ Ｐ（ｍ扩增条件 根据引物具有不同的１１ｍ值，选择最佳的退火温度。为了提高ＰｃＲ产物的特异性，
５ ｒＩ℃ｍ。。而蛋白酶Ｋ．酚，氯仿处理法去除ＰｃＲ抑制物的能力有限，检测敏感性仅达到 ５０ ｒＩ℃Ｉ％，其检测敏感性大幅下降５０倍。和图２一ｌ的结果相比，螯合树脂处理法显示
出良好的去除ＰｃＲ抑制物的能力，仍可检测５０ １℃Ⅱｋ的病毒滴度，其检测敏感性仅下
万方数据
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微生物学通报
７５
了它们对ＢＫ病毒临床检测的敏感性和特异性的影响。在本文中，作者采用３种不同的 核酸提取方法从粪便中制备不同核酸类型（腺病毒、ｄｓＤＮＡ和细小病毒、ｓｓＤＮＡ）的病
毒，比较了它们消除ＰＣＲ抑制物的能力以及对ｄｓＤＮＡ病毒或对ｓｓＤＮＡ病毒临床检测的 敏感性和特异性的影响。
ＧｕｓｃＮ是一种强细胞裂解试剂，同时能有效灭活ＤＮａｓｅ和ＲＮａｓｅ，因而常用于从『临 床样品中制备病毒ＤＮＡ或ＲＮＡ，但有些研究结果证明从粪便和尿样中制备核酸时，
医圈
微生物学通报
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不同ＤＮＡ提取法对腺病毒和细小病毒 ＰＣＲ检测效果评估
王汉中
（中国科学院武汉病毒研究所武汉４３∽Ｉ）
摘要：分别利用硫氰酸胍（ｃ。珊ｉｄｉｒ－ｅ ｔＩＩｉ蛔呲．ＧｕｓｃＮ）抽提法、螫合树脂处理法和蛋白
酶Ｋ＿酚，氯仿抽提法从粪便样品中制备腺病毒ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）或细小病毒ＤＮＡ（船ＤＮＡ）然
自从１９８５年发明ＰｃＲ体外扩增技术后，ＰｃＲ技术已在生物学各个领域得到广泛的 应用，尤其在临床诊断中，ＰｃＲ已成为快速、灵敏的人和动物病毒性病原临床检测方 法。但ＰｃＲ技术在实际应用中经常会出现假阳性和假阴性结果，主要原因是临床样品 中含有多种影响ＰｃＲ扩增的抑制物。例如粪便和尿样中含有能螯合１铀ＤＮＡ聚合酶活 性所必需的Ｍｇ“离子的Ｅ瑚队【ｌ ３，结果降低了１铀ＤＮＡ聚合酶的活性，导致假阴性结果 的产生。样品中可能含有ＤＮａｓｅ能降解寡聚核苷酸引物和模板ＤＮ Ａ＿“。有些研究发现粪
法从细胞培养悬浮液中制备腺病毒（ｄｓＤＨＡ）进行ＰｃＲ扩增效果比较。结果表明蛋白酶
ｋ酚，氯仿抽提法和ＧｕｓｃＮ处理具有相同敏感性，都能检测１ １℃Ⅲ。病毒滴度，而螯合
树脂处理法也能检测１０１℃Ⅲ。的病毒滴度。
图２—２为３种不同的核酸制备方法从粪便样品中制备腺病毒核酸进行ＰｃＲ检测结果
比较。结果显示ｃｕｓｃＮ具有良好地去除粪便中抑制物能力，其检测敏感性仍可达到
后进行ＰｃＲ检测。结果显示硫氰酸胍抽提法、螫合树脂处理法能有教地去除粪便中影响
ＰｃＲ扩增的抑制物，提高ＰｃＲ检测的敏感性，而传统蛋白酶Ｋ＿酚，氯仿抽提法不能有效地
去除呱扩增的抑制物，影响Ｉ恤检测结果。在检铡粪便中腺病毒时，硫氰酸胍、螫合树
脂和蛋白酶．酚，氯仿抽提法分别允许检测５１℃Ⅲｈ、５０ １℃Ⅱｋ、５０｜Ｉ℃Ｉ‰的病毒滴度。在用
降５倍。 图２．３为３种不同的核酸制备方法
细胞培养悬液中制备细小病毒核酸
（ｓｓＤＮＡ）的ＰｃＲ检测结果。由于细胞 培养液中含有ＰＣＲ抑制物较少，因而
３种方法都能获得较高的检测敏感性， 其检测滴度分别达到５、１、５ＴＣＩＤ。。
图２＿４为３种不同的核酸制备方法 从粪便样品中制备细小病毒核酸的
ＰｃＲ检测结果。和图２－３的结果相比， 检测灵敏度分别下降至１００、１０和５０－ １℃ＩＤ钔。从中可以看出蛋白酶Ｋ一酚，氯
等Ｂｌ：：：（溉『Ｎ１，。Ｂ等２：霎ＰＫｊ，竺Ｂ：３：紫型螫：合掌树二脂标，誊Ｍ。：誉标善准蔫ＤＮ：Ａ罢分％子毒量和呵细’小㈣病ｕ毒’嘟Ｊ惘ｌ检…测…中ｏ敏啊感嘲性…的ｏ
ＤＬ２０００，腺病毒ＰｃＲ产物的分子量为３００ｂｐ，细小病毒ＰｃＲ产比较（图２）
物的分｝晕为ｌ舯ｂｐ
图２一ｌ为３种不同的核酸制备方
利用３种不同的核酸制备方法制备这两种不同核酸类型的病毒核酸，成功地进行 了ＰｃＲ检测，结果证明ｃＩｌＳｃＮ和螯合树脂两种核酸制备方法有助于减少ＰＣＲ临床检测 中的假阳性或假阴性结果，保证检测结果的灵敏性和准确性。
１材料与方法
１＿１细胞与病毒
猪细小病毒由本实验室分离和保存。病毒细胞培养与病毒增殖见文献［７］。将猪细 小病毒按ｏ．０１个感染复数接种到生艮良好的单层细胞上，培养７２—８６ｈ后收集细胞悬 液，反复冻融，置一２０℃保存待用。
２结果
２．１分别利用３种不同的核酸制备方法从细胞悬液中制备腺病毒凼ＤＮＡ和细小病毒
ｓｓＩ）ＮＡ进行Ｐ（＝Ｒ检测结果
图１Ａ分别利用３种不同的核酸
制备方法从细胞培养悬游液中制备
腺病毒核酸（ｄｓＤＮＡ）进行ＰｃＲ检测
的结果。图１Ｂ为分别利用３种不同
的核酸制备方法从细胞培养悬浮液
中制备猪细小病毒核酸（ｓ８Ｉ）ＮＡ）进
二烷基酰肌氨酸（Ｎ—Ｌ“ｍｙｌ ｓｍ∞ｉｎｅ）、１Ⅲ０ｌ，Ｌ二疏苏糖醇、３００ｆⅢ∞ｌ，Ｌ醋酸钠、２０腭
糖原］震荡混合后，置室温下ｌｏ而ｎ，加入ｌｏ一２０腭酵母删Ａ，用酚，氯仿抽提两次，
经２倍体移｛乙醇沉淀核酸，．加℃过夜，样品经１４０００“ＩＩｌｉｎ离心３０ＩＩｌｉｎ后．去上清，用 ７０％乙醇洗涤沉淀１次，真空干燥，将沉淀溶入加止去离子水中。 １．２．３螯合树脂处理法：见文献［７］。 １．３引物的设计及序列
腺病毒由本实验摩分离和保存。将病毒悬液接种与２３９细胞上，３７℃培养３～４ｄ后 观察细胞病变，直至７０％一９０％的细胞产生病变后收集细胞悬液，一２０℃保存待用。 １．２核酸提取方法 １．２．１蛋白酶Ｋ．酚／氯仿抽提法：见文献［７］。 １．２．２ ＧｕｓｃＮ处理法：将Ｏ．５ｍＬ的细胞悬液同２ｍＬ裂解液［６ Ｉｒｌｏｌ，Ｌ Ｇｌ】＆Ｎ，Ｏ．５％Ｎ．十
竺孝堕罗７．塑掣物箩能力，陀Ｒ检测蓑：茬ｉ？宁专：臻篙言蓑：｛６；嚣萎。焉箍嚣：等篇蓉霎
灵敏度仅小幅度下降。
菜磊；葚≥。（二Ａ；‘茹＝藿蔷釜蔷谲琵蕃………
３讨论
为ｒ确保ＰｃＲ检测的特异性和敏感性，有效去除临床样品中影响ＰｃＲ扩增的抑制 物是非常重要的，很多研究者对此进行ｒ研究。例如，Ａｍ““等在检测粪便样品中甲
肝病毒时发现粪便中的酚、多胺以及某些金属离子对１如ＤＮＡ聚合酶有明显的抑制作 用并利用７种不同的核酸提取方法分别从粪便或贝类组织中提取甲肝病毒ＲＮＡ，进行
ＲＴ－ＰｃＲ临床检测，比较了７种方法去除样品中ＰｃＲ抑制物的能力。而Ｂｅｈｚａｄｂｅｈｂａｈａ． ｎ一也比较了７种不同的核酸提取方法从尿样中去除血红素、尿素等ＰＣＲ抑制物，比较
稀成２００１℃Ⅲ，。、１００１℃Ⅱ）舶、１０ＴｃⅢ，ｏ、１１℃贼等不同浓度的两种病毒悬液分别同猪粪
便或人粪便混合（１００出儿克粪便），再用这３种不同的核酸制备方法制备核酸进行ＰｃＲ 扩增，比较这３种方法去除影响ＰＣＲ扩增敏感性的有害物质的能力以及用于临床检测 的价值。 １．６ Ｐ（ｍ扩增产物的鉴定
取ｌＯ止ＰｃＲ扩增产物，于０．７％琼脂糖凝胶电泳（２００ｖ，３０ｍｈ，随后Ｈｊ溴化乙锭 染色，在紫外灯下观察结果。根据标准ＤＮＡ分子量判定产物的分子量大小。
果的抑制物的能力，作者采用两种不同的实验比较了它们之间的敏感性。方法１分别 在敏感细胞中测定细小病毒和腺病毒的１℃ＩＤ蚰，将病毒悬液稀释成２００．Ｉ℃ＩＩｋ、 ｌｏ叽℃Ⅲ。、１０ｒＩ℃Ｉ％、１１℃Ⅲ。等不同稀释度，随后分别采用这３种方法制备核酸，进行 ＰｃＲ扩增，比较这３种方法在制备不同类型核酸时对ＰｃＲ敏感性的影响。方法２将释
图２ ３种不同核酸提取方法对腺病毒和猪 细小病毒ＩｌＣＲ检测敏感性的比较 糍ＰＫ， 一＆＆Ｎ，－整合树脂
仿制备法考除陀Ｒ抑制絮堂能力予差，；：淼：絮筹掣意嚣篓：：：鬻翟鼍”：ｉ：：ｉｉ
因而ＰＣＲ检测灵敏度大幅度下降。而酸制备方法从粪便样品巾制备腺病毒棱酸ｄｓ（ＤＮＡ）进行 ＧｕｓｃＮ和螯合树脂处理法都具有良好ＰＣＲ检测敏感性的比较，３ ３种不同的核酸制备方法从细胞
表１分别显示检测猪细小病毒＊ＤＮＡ的引物和检测腺病毒ｄｓＤＮＡ的引物所位于的 基因区域、位点、核苷酸序列以及预期ＰＣＲ扩增产物的大小。
由于腺病毒具有很多不同的亚型和血清型，因而从腺病毒的保守基因．六邻体基因 中选择一对核苷酸序列作引物。
衰ｌ ＰｃＲ引物在病毒基因组中的位置、核苷酸序列以及ＰｃＲ产物的大小
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收稿日期：卸Ｉ．Ｏ懈．修回日期：２００ｌ啦！ｏ
万方数据
２００２年２９（４）
微生物学通报
便和尿样中含有血红素”ｏ、酚“１、多胺”１、多糖…１都能抑制１铀ＤＮＡ聚合酶活性。为了 防止假阴性和假阳性结果的出现，寻找一种简单、快速和有效去除１铀ＤＮＡ聚合酶抑 制物的核酸制备方法是临床检测中一个非常重要的环节。应用蛋白酶Ｋ．酚，氯仿抽提 法、ＧｕＳｃＮ（Ｇｕ“ｄｉ—ｔ．１ｉｏｃ）一ａｔｅ硫氰酸胍）处理法、螫合树脂处理法分别从猪细小病 毒（ｓｓＤＮＡ）和腺病毒（ｄｓＤＮＡ）中制备核酸进行ＰＣＲ扩增，并比较了３种核酸制备方 法对ＰｃＲ扩增敏感性的影响以及去除临床样品中影响ＰｃＲ扩增敏感性的抑制物的能力。
硫氰酸胍、整合树脂和蛋白酶．酚，氯仿抽提法制备粪便中猪细，Ｉ、病毒核酸进行ｐＣＲ检测时，