浅谈高效液相色谱分析中常见问题及对策

高效液相色谱（ＨＰＬＣ）作为一种分离技术和方法，目前已经发展到一个全新的阶段。

高精度的输液泵，应用广泛的色谱分离柱，低噪音、高灵敏度的各种检测器和功能强大的数据处理软件系统的出现，都推动了液相色谱技术的迅猛发展。

液相色谱仪正以它分辨率高、分析速度快和应用广泛的优点倍受仪器分析工作者的青睐，广泛地应用于医药卫生、环境监测、食品检测等领域。

作者本人从事液相色谱分析分析工作二十多年，应用ＨＰＬＣ技术在血药浓度、生物胺、核苷酸、蛋白质浓度测定等实际工作中，积累了许多的方法和经验，在这里与大家交流，希望能对同行们有所帮助和借鉴，共同促进液相色谱分析技术的发展。

１高效液相色谱仪的基本工作原理高效液相色谱仪如图１所示，是由溶液贮器、高压泵、进样系统、色谱分离柱、检测器和数据处理系统几部分组成。

浅谈高效液相色谱分析中常见问题及对策ＣｏｍｍｏｎＰｒｏｂｌｅｍｓａｎｄＣｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅｆｏｒＯｐｅｒａｔｉｏｎｏｆＨＰＬＣｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ张燕婉，孟宪敏，王来元（中国医学科学院阜外心血管病医院中心实验室，北京１０００３７）〔文章编号〕１６７２－８２７０（２００６）０７－５１－０４〔中图分类号〕ＴＨ８３３〔文献标识码〕Ｃ【摘要】介绍高效液相色谱仪的基本工作原理和仪器组成，列举了输液泵、色谱柱和几种检测器在液相色谱分析工作中常出现的技术问题和仪器故障，并对其进行分析，提出了一些解决的办法和对策，供大家交流。

【关键词】高校液相色谱仪；常见问题；故障；对策Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＰＬＣ）ｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．Ｉｔｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｓｔｈｅｃｏｍｍｏｎｐｒｏｂｌｅｍｓｏｆｐｕｍｐ，ｃｏｌｕｍｎａｎｄｄｅｔｅｃｔｏｒｉｎＨＰＬＣａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄｇｉｖｅｓｔｈｅｒｅｓｏｌｖｅｎｔｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｔｏｅｘｃｈａｎｇｅｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉｔｈｏｔｈｅｒＨＰＬＣａｎａｌｙｓｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＰＬＣｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ；ｐｒｏｂｌｅｍ；ｔｒｏｕｂｌｅ；ｒｅｓｏｌｖｅｎｔ（上接５０页）些改造是符合国情的和优化的。

目前，整个自动单剂量药品分包机系统在我院已正式投入使用，运行状况良好，极大地改善了我院的用药环境，减少了不必要的污染，提高了患者用药的安全性。

５体会单剂量药品分包机的应用优化了药品调剂的流程，也会在一定程度上控制医疗差错，但要从根本上建立医院合理用药体系，减少药物不良反应的发生，还应该从医院全方位进行统一规划与管理。

应该认识到，调剂工作的模式正在由传统的配方发药向全面的药学服务转变，药学服务是一种社会性很强的工作［５］，计算机信息技术的应用及先进网络设备的迅速发展是把这种服务传送给疾病患者的关键，也为调剂工作模式的转变提供了条件。

参考文献［１］医疗机构药事管理暂行规定《医院药事管理暂行条例》［ＥＢ／ＯＬ］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｙｘｘｇ．ｃｏｍ／ｗｏｐ［２］王学敏，林晓兰，实行药房开放式服务的实践《中国医院》２００５，７［３］唐镜波，马金昌，韩丽萍用药差错的非个人因素于防范解放军药学学报第十九卷第二期［４］我国不合理用药每年致死１９万人医学信息网［ＥＢ／ＯＬ］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｔｐ．ｃｏｍ．ｃｎ／［５］陆瑜，余国强，司梁宏数字网络时代传统药房面临的挑战和机遇中国药房，２０００，１１（６）：２８２．【技术交流】作者简介：张燕婉，女，（１９５７－），大学本科，主任技师，副教授，主要从事液相色谱技术、生化和分子生物学分析工作。

组分在固定相中的量组分在流动相中的量Ｋ＝＝ｔｋ－ｔｏｔｏ图１高压泵从溶液贮器中抽走流动相，流经整个仪器系统，形成密闭的液体流路。

样品通过进样系统注入色谱分离柱，在柱内进行分离。

柱流出液进入检测器，使已被分离的组分逐一被检测器收集，并将响应值转变为电信号后经放大被数据处理系统记录色谱峰，通过数据处理系统对记录的峰值进行存储和计算［１］，从而完成整个分析过程。

液相色谱仪的色谱分离是依靠色谱柱进行的。

研究证明：物质的色谱过程是指物质分子在相对运动的两相（液相和固相）中分配“平衡”的过程。

液相色谱是以具有吸附性质的硅胶颗粒为固定相，各种洗脱液为流动相。

当液体样品在载体流动相的推动下，在液－固两相间作相对运动时，由于各组分在两相中的分配系数（Ｋ）不同，则使各自的移动速度不同，即产生差速迁移。

各组分在两相间经过多次分配，从而达到使混合物分离的目的。

上式反映了物质在两相中进行吸附、解吸、再吸附、再解吸…过程中，由于在两相中浓度的不同，而存在分配系数上的差异。

既然分配系数及其差异是引起组分在液相色谱柱分离的根本原因，那么，必然地也会同色谱理论中可测宏观量之间存在着某种定量关系，事实上，色谱理论中通常用容量因子ｋ’的概念来反映物质在两相中的分配关系：ｋ’值可以非常方便地表达组分在两相的分配，又很容易从色谱实验数据中直接测得，是色谱理论中重要的基本参数之一［２］。

２输液泵的常见故障及对策输液泵／高压泵是保证ＨＰＬＣ系统流路畅通、流量精确和压力稳定的重要仪器部件，目前多用往复式恒流柱塞泵，主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成，用马达带动凸轮驱动柱塞杆作吸液和排液的往复运动。

常分为单柱塞泵、并联柱塞泵、串联柱塞泵和柱塞隔膜泵等类型。

流动相混合方式分为低压混合和高压混合。

常见泵的故障主要有以下几种，并提供解决的办法。

２．１单向阀故障由于球与阀座密封不严，液体倒流，造成压力不稳，甚至球与阀座粘在一起阻死。

密封不严主要是污染或气泡引起，球与阀座粘连也是由于污染和磨损造成。

为避免单向阀中的宝石球和阀座被污染，流动相应使用ＨＰＬＣ级的溶剂，并且配好的流动相一定要用０．４５ｕ滤膜过滤和脱气。

如果泵被微粒污染，可分别用水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷依次冲洗。

冲洗时应打开泄液阀，最后再用所用的溶液冲洗整个系统。

气泡进入阀中会紧贴在阀体的一侧，使宝石球难返回到阀座，引起倒流，泵的压力和流速会明显改变。

此时，应立即打开泄液阀，大流量（２ｍｌ／ｍｉｎ）冲洗泵，直至排除液为直线型。

因为甲醇可润湿泵内壁，挤出气泡，故也可使用脱过气的甲醇冲洗泵。

长期不用的泵或新装的泵头应该用甲醇赶气泡。

泵进气泡也可在泵头上排气泡，即用扳手固定住进气泡的泵头，拧开输出管道的压帽，手动泵送液，可见到气泡从孔中挤压出来，直至无气泡排出将压帽拧紧［３］。

采取上述办法仍不能使压力稳定，应考虑是否密封垫坏了？或单向阀磨损、球不光滑等，需更换部件。

２．２泵垫圈故障泵垫圈常见的故障是渗漏和垫圈受损污染系统。

液相色谱系统一般情况下不要使用强酸强碱溶液，因为这会损坏密封垫和柱塞杆。

密封垫圈与运动着的柱塞杆紧密接触，可使柱塞在泵头自由运动而流动相不漏出来，它是液相色谱系统中最易磨损的部件。

有条件的实验室可三个月更换一次垫圈，防止泵系统污染。

如果用缓冲盐作流动相则更会加速垫圈的磨损，应及时冲洗。

当垫圈损坏时，表现为：泵压力不稳、泵头漏液。

一旦出现这个现象，应尽快更换新垫圈。

为避免上述故障的发生，我们在分析工作中应注意以下几点：①使用超纯水（１８ＭΩ．ｃｍ）、纯度级别较高的试剂和色谱级溶剂配制流动相；②配好的流动相一定要抽滤脱气，即便仪器有在线脱气装置，也最好在上机前进行抽滤。

真空抽滤既过滤颗粒也脱了气泡，非常有效。

③泵在起动前一定要通过泄液阀抽净泵里的空气。

④用缓冲盐洗脱时，分析结束后一定要用水冲洗泵和整个流路系统，不要让腐蚀性溶液滞留泵中，最后用有机溶剂充满系统。

溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度Ｋ＝３色谱分离柱的使用与维护作为ＨＰＬＣ分离过程的核心，稳定高效的色谱柱和固定相是建立适应范围广、重现性好的分析方法的基本保证。

色谱柱在使用过程中常出现的问题主要涉及到：色谱柱的寿命、保留时间与分离度的重现性，色谱峰脱尾等。

３．１色谱柱的寿命色谱柱使用过程中，会由于各种原因导致分离失败或色谱柱失效，主要表现有：色谱柱反压增高、峰脱尾、塔板数下降、保留值降低等。

造成这些问题的原因主要有柱滤板问题、强保留组份影响和化学影响等，下面将分别讨论：３．１．１色谱柱滤板问题及对策色谱柱入口筛板堵塞是色谱柱最常见的问题之一，筛板堵塞会导致柱压升高，色谱峰脱尾、塔板数降低。

注射样品中含有微粒杂质，最有可能堵塞色谱柱入口，降低柱寿命，故要在注样前，将样品过滤或离心；进样器与泵密封垫的磨损也会带来微粒，故可在进样阀与色谱柱之间用在线过滤器，常可避免色谱柱滤板堵塞问题。

当筛板部分堵塞或进口处填料塌陷形成异常峰形时，可用强溶剂反冲色谱柱（低速）。

如不见效，则需更换筛板，或重新填补填料后更换筛板。

３．１．２强保留样品组份影响及控制强吸附性的样品组分吸附在柱头填料上，能严重地缩短色谱柱寿命，在分析生物体液（如血液、尿液）时尤为突出。

这时，可在色谱柱加一保护柱，能够有效减少强吸附组分的污染。

保护柱（预柱）是根内装填料与分离柱性质相近的短柱，接在分离柱之前，可代替流路过滤器。

保护柱的作用是吸附强保留组分，收集和阻塞化学垃圾进入分离柱，这些垃圾如果直接进入分离柱会逐渐堆积在柱头，最终降低柱效能。

保护柱是消耗品，如分析血浆样品，一般分析５０个样品后需更换新柱芯。

另外，每次分析结束后可用强溶剂冲洗分离柱（应卸下保护柱），以除去可能吸附在分离柱柱头的污物，有效延长色谱柱的使用寿命。

３．１．３压力的影响色谱柱使用过程中。

目前色谱分析中使用的色谱柱都能承受得起高压，但骤然压力波动，机械撞击和温度变化都会对色谱柱床产生影响，改变柱床体积，降低柱效。

引起压力波动的原因主要有：进样器的样品阀的缓慢转动、泵启动太快、柱切换等操作。

用手动进样阀时的压力变化不大，自动进样阀由于切换较慢，可能会造成压力冲击。

在低压下操作，可大大减少由于压力波动造成的分离度的损失。

３．１．４化学影响在分离过程中色谱柱固定相的流失会显著降低柱的使用寿命，应避免使用对固定相浸蚀性强的固定／流动相组合。

短链硅烷基基团反相柱稳定性最差，在低ＰＨ条件下可很快流失有机相，而长链烷基反相柱（Ｃ１８、Ｃ８）较稳定。

我们应合理选择分离柱。

选择色谱分离柱主要根据两点，一是根据待测组分的分子量的大小，二是根据流动相条件，包括ＰＨ值、离子强度和溶剂极性等。

完全羟化的硅胶基质的键合相柱，其表面的硅羟基分布均匀单一，稳定性好，通常要求流动相ＰＨ值在３－７之间，极端ＰＨ值（＜２或＞８）的流动相会溶解硅胶，使键合相流失。

而目前利用先进的杂化颗粒技术研制的高纯硅胶颗粒填料（如Ｗａｔｅｒｓ公司的ＸＴｅｒｒａ色谱柱），集硅胶和多孔聚合物填料的优点为一体，使有机硅烷单元取代了相当一部分占据颗粒内部和表面位置的硅羟基，使这种新型填料具有分辨率高、稳定性强、ＰＨ范围宽（１－１２）的优势，其性能突破了传统高效液相色谱柱的极限。