骨髓间充质干细胞修复肺损伤研究进展

·综述·骨髓间充质干细胞修复肺损伤研究进展张红珊方建培中山大学孙逸仙纪念医院儿科（广东广州510120）基金项目：广东省科技计划资助项目（编号：2010B060900027）通讯作者：张红珊，E-mail ：zhhosh@126．com 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ，BMSCs ）也称骨髓基质来源干细胞，是一种具有多向分化潜能的干细胞，在体外较易分离、纯化和扩增，具有多能性。

近来报道BMSCs 对肺组织损伤修复也具有一定的作用。

以下就近年来BMSCs 在肺损伤治疗方面的研究作一综述。

一、MSCs 的生物学特性1．MSCs 的表面标记：BMSCs 起源于中胚层，是存在于骨髓基质内的非造血细胞来源的细胞亚群，为贴壁生长细胞，可以聚集成均匀的细胞集落，形成成纤维样的细胞克隆。

目前MSCs 并没有找到理想的特异性标志，它具有间质细胞、上皮细胞和内皮细胞表面抗原的特征。

一般而言，MSCs 表达一系列细胞表面标志：SH2、SH3、Sca1、CD29、CD44、CD71、CD90、CD120a 、CD124等，不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达MHC Ⅱ类抗原及MHC 抗原相关的共刺激分子CD80、CD86及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子如HLA-DR 抗原等，具有低免疫原性［1，2］。

骨髓中MSCs 含量很少，约占骨髓内单核细胞总数的1/104 1/105，并随年龄的增加而减少［3］。

因此培养、扩增MSCs 就成为了各项研究的基础。

2．MSCs 分离纯化与培养：MSCs 在体外分离与培养，主要通过MSCs 在体外培养时的粘附特性，呈成纤维细胞样的形态，细胞表面的免疫标志及多向分化功能等进行鉴别［4］。

常用的MSCs 分离纯化方法有：①密度梯度离心法：利用骨髓在分离液中经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化，目前较常用的分离液有Percoll 液和淋巴细胞分离液。

②贴壁筛选法：根据MSCs 具有在塑料或玻璃培养皿中贴壁生长的特性对其进行分离。

③流式细胞仪分选法：根据MSCs 表面抗原标志利用流式细胞仪进行分离纯化。

④免疫磁珠分离法：基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记于细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的。

免疫磁珠分离法是目前获得原代MSCs 纯度最高的方法，但对细胞活性有一定的影响。

贴壁法和密度梯度离心法是目前使用最多的两种方法，但分离出的MSCs 中都不同程度混杂有其他细胞。

要想得到更纯化的MSCs 用于临床研究，还需要更多特异性MSCs 表面标志的发现。

3．MSCs 的多向分化潜能：MSCs 不仅含有编码间质组织成分的基因，还含有编码内皮及上皮组织的基因，为其具有多向分化潜能提供了理论依据。

MSCs 具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，在不同的微环境下可向不同的谱系分化，不但可以向中胚层细胞分化，甚至可以跨越胚层，向外胚层及内胚层来源的组织细胞分化，可以分化为间充质组织，如骨、软骨、肌肉组织，以及非间充质组织如内皮细胞、肝细胞、心肌细胞、角膜上皮样细胞、神经细胞，而且免疫原性弱，从而为组织修复提供细胞来源［5，6］。

研究证实，20 25代的MSCs 仍然保持着分化为成骨细胞、脂肪细胞和肌成纤维细胞的能力［7］。

MSCs 的多潜能性决定了它的分化调控机制的复杂性。

有研究认为MSCs 的分化由特殊转录因子决定，不同的诱导条件可以决定其分化方向，可能是这些诱导条件启动了决定分化方向的转录因子。

4．MSCs 免疫调节作用：大量的实验证明MSCs 具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性，可抑制移植物抗宿主病（GVHD ）的发生［5，8，9］。

体外混合淋巴细胞反应等实验已证实，扩增后的MSC 能明显抑制T 细胞增殖，并抑制炎症细胞因子的产生，诱导T 细胞对外来抗原的反应无能性。

MSCs 可抑制单核细胞分化为树枝状的细胞（dendritic cells ，DCs ），阻碍树突状细胞成熟［10］。

MSCs 还能抑制B 细胞的增殖及功能，抑制B 细胞转化为成熟的浆细胞，从而减少抗体的产生［11，12］。

此外，MSCs 还能降低NK 细胞的细胞毒性作用，减弱DC 细胞的抗原提呈作用等［12，13］。

MSCs 免疫抑制作用的机制目前尚未有统一的说法，可能与MSCs自身分泌的一些可溶因子有关，其中肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF），白细胞介素10（IL-10）和转化生长因子β（TGF-β）被认为是介导MSC产生免疫抑制的细胞因子。

MSCs可通过直接接触淋巴细胞、DC等免疫细胞而产生免疫抑制作用，亦可通过分泌细胞因子发挥作用。

也有人认为MSCs介导的免疫抑制与趋化因子和一氧化氮的协同作用有关［14］。

二、MSCs在肺损伤时作用MSCs的研究进展遍及到多个临床领域，对其向其他组织细胞分化的研究主要集中在脑、心、肝和血液等脏器，而对其在肺脏作用的研究相对迟缓。

近年研究发现，MSCs可以在肺损伤中发挥修复作用［15-20］。

Ortiz等［21，22］研究发现MSCs能够减轻博莱霉素诱导的肺纤维化。

Gupta等［7，23］直接气道腔注射MSCs，发现MSCs可以提高小鼠的生存率，减轻内毒素诱导的急性肺损伤。

Zhen等［24］研究发现移植的MSCs在受体大鼠的肺组织中植入和分化，能够减轻木瓜蛋白酶和［60Co］照射所致大鼠肺气肿。

这些结果支持MSC是多能性的，提示MSCs可以用来治疗肺部疾病。

1．肺损伤疾病的实验动物模型：实验动物中使用的肺损伤模型主要有放射损伤模型、博莱霉素诱导的肺纤维化模型、细菌脂多糖（LPS）和内毒素诱导的肺炎症损伤模型和高氧肺损伤模型。

肺的放射损伤模型一般采用全身照射或全胸照射。

损伤后首先出现放射性肺炎，表现为间质水肿和肺泡腔水肿、肺泡萎陷、肺泡膨胀不全、炎症因子表达升高，而后出现肺纤维化。

博莱霉素模型是最有代表性的肺纤维化模型，表现为肺泡上皮细胞的凋亡和坏死、炎症因子浸润及肺纤维化。

LPS和内毒素诱导的损伤模型主要为肺的炎症损伤模型，表现为炎症因子浸润、肺结构破坏和肺气肿样损伤。

高氧肺损伤是一个极其复杂的病理生理过程，其损伤机制涉及到细胞凋亡、血管生成、炎性水肿、细胞外基质重建和组织异常修复等多种因素。

利用动物模型模拟肺损伤过程是目前进行MSCs干预研究的重要手段。

不同的研究者采用了不同的肺损伤模型和检测方法，绝大部分研究者认为骨髓来源的MSCs能够归巢到损伤部位并减轻肺损伤。

2．MSCs向肺组织归巢：多项研究证明MSCs有向缺血或损伤组织归巢的特征，其详细机制尚不清楚。

Dominici等［4，25］认为MSCs在肺损伤状态下可以向肺部移行并表现出肺细胞的表型。

Mei等［26］对MSCs在肺脏的定植进行定量分析，发现大约47%的MSCs定植在LPS诱发损伤的小鼠肺脏，而天然小鼠中约38%，并且无论有无肺损伤，MSCs注入体内3d内，大部分MSCs从肺中消失。

Ortiz 等［21］用RT-PCR定量检测静脉移植雄性小鼠来源的MSCs在雌性小鼠体内的分布，发现博莱霉素致肺损伤模型组的肺组织比正常对照组所含MSCs数量增加23倍，即表明MSCs有显著向损伤肺组织聚集现象。

干细胞向损伤肺组织的归巢部分原因是损伤的组织细胞引起一系列趋化性细胞因子的释放，损伤组织同时表达特异性受体或配体引导对应的干细胞迁移并黏附于损伤处。

目前比较认可的趋化干细胞的分子有基质细胞衍生因子（SDF-1）、血小板衍生生长因子、基质金属蛋白酶等。

SDF-1是由骨髓基质产生只对CXCR4的配体作出移动反应的一种趋化因子。

正常血管中无SDF-1表达，血管损伤后平滑肌细胞分泌SDF-1，血浆SDF-1水平于血管损伤后1d达高峰。

SDF-1以及其与存在于骨髓干细胞上的特异受体CXCR4的相互作用，被认为在移植过程中发挥重要作用。

在体外表达CXCR4的骨髓MSCs对SDF-1的浓度梯度有强列的趋化作用。

损伤可能是MSCs的激活剂，促使其向损伤部位迁移，从而发挥修复作用。

肺损伤时肺泡上皮细胞DNA断裂、细胞肿胀、变性、坏死，肺内出现炎症，大量炎性细胞浸润，这些变化所引起的细胞生存所依赖的微环境的改变均有可能趋化MSCs，使MSCs 进入肺组织及肺泡腔内。

对于MSCs在肺部定植后的作用机制仍不清楚，可能是通过（直接或间接）转分化为目标细胞替代损伤的细胞，或者与原有宿主细胞发生相互作用，如分泌一些细胞因子调节MSCs发挥功能。

3．MSCs在肺内分化：肺泡上皮由两种形态学上不同的细胞构成，即Ⅰ型和Ⅱ肺泡上皮细胞（AECⅠ、AECⅡ）。

AECⅠ为高度扁平的鳞状上皮细胞，覆盖肺泡表面积的95%，构成气血屏障，细胞可高表达T1α（podoplanin，平足蛋白）和水通道蛋白5（aquaporin protein5，AQP5），番茄凝集素（lycopersicon esculentum lectin）可与其结合而不与AECⅡ结合。

AECⅡ呈立方形，完全分化的AECⅡ最有特征的表型标志是表面活性蛋白（surfatcant protein，SP）-A、SP-B、SP-C，而仅在AECⅡ上表达的唯一表面活性蛋白是SP-C。

已有研究证实ACEⅠ细胞为终末分化细胞，不再增生分裂。

AECⅡ细胞是肺内主要干细胞，正常肺泡上皮更新和肺损伤修复的唯一途径是AECⅡ通过增殖，并向肺泡Ⅰ型上皮细胞转分化，使肺泡壁重新上皮化以恢复血气屏障的重要功能。

当AECⅡ转分化为AECⅠ时，获得AECⅠ的特异表型特征AQP-5，同时失去AECⅡ的表型标志SP-C［27］。

研究报道，损伤细胞能够诱导MSCs分化为损伤特异性的细胞，可能是因为损伤细胞分泌的特殊的细胞因子刺激MSCs或者是损伤细胞激活某个信号传导［20］。

目前关于MSCs在肺内分化的研究有不同结论。

有的研究报道骨髓MSC分化成为AECⅠ，而有的报道骨髓MSCs分化成为AECⅡ。

另有报道BMSCs具有分化形成内皮细胞、修复损伤血管及形成新生血管的能力［28］，可以逆转肺动脉高压的血管重构，降低肺动脉压力。

还有的研究认为MSCs对肺的保护作用并不依赖于它植入肺脏及分化的能力，可能通过旁分泌方式［16，17］。

此外干细胞分化过程中存在细胞融合现象，即与相应组织细胞的直接接触可能是影响干细胞定向分化的关键因素。

MSCs在肺中首先分化为哪种类型的肺泡细胞？是经过Ⅱ型细胞分化为Ⅰ型细胞，还是它们直接分化为Ⅰ型细胞？还是通过免疫调节作用？这些问题均值得进一步研究。

4．MSCs的免疫调节作用：MSCs具有免疫调节活性，能下调促炎症反应。