质粒提取
提取质粒的主要步骤原理
提取质粒的主要步骤原理提取质粒是一种分离和纯化质粒DNA的常见实验技术。
质粒是细菌细胞内环状的DNA分子，通常用于基因克隆、转化、表达和基因组编辑等研究。
下面将详细介绍质粒提取的主要步骤原理。
1. 细菌培养：首先，选择含有目标质粒的细菌菌株进行培养。
通常使用大肠杆菌等常用实验菌株。
将细菌接种到含有适当营养物质（如LB培养基）的培养物中，并在适当条件下培养，如37摄氏度、220 rpm振荡培养。
2. 收获细菌：将培养至适当生长期的细菌用离心机离心，收集菌体沉淀。
通常使用1500×g离心10分钟，得到一个细菌菌体的沉淀。
3. 质粒裂解：利用物理或化学方法将细菌菌体裂解，释放内部的质粒DNA。
物理方法包括超声波处理和冻融法，而化学方法则涉及使用碱性裂解液（如SDS 和NaOH）。
该步骤破坏了细胞壁和细胞膜，以及核酸酶等酶的活性。
4. 蛋白质沉淀：为了去除细菌染色体DNA和蛋白质，可通过蛋白质沉淀步骤使质粒DNA纯化。
一种常用的方法是加入混合溶液，其中包含非离子性洗涤剂（如SDS）和蛋白酶K。
SDS具有溶解细菌膜和蛋白质的作用，而蛋白酶K能够降解杂质蛋白质。
该反应可以在高温条件下进行，如50-60摄氏度，以增加SDS和蛋白酶K的活性。
5. DNA沉淀：通过加入盐和酒精，可以使DNA溶液中的质粒DNA沉淀。
正常情况下，添加等体积的冷异丙醇，再加入适量的盐溶液。
因为质粒DNA在冷异丙醇和高盐浓度下更容易沉淀。
经过离心，沉淀的DNA可被分离出来。
6. 洗涤和溶解：将DNA沉淀洗涤一两次，以去除盐和其他杂质。
通常使用70%乙醇洗涤，再次离心以分离DNA沉淀，然后去除液体，使其干燥。
最后，用适当的缓冲液（如TE缓冲液）溶解质粒DNA，以得到高纯度的DNA溶液。
以上步骤提取质粒的主要原理如下：在收获细菌步骤中，细菌通过离心过程被分离出来，得到菌体沉淀。
在质粒裂解步骤中，通过物理或化学方法破坏细胞结构，释放质粒DNA。
质粒提纯的原理
质粒提纯的原理质粒是一种由DNA分子组成的环状双链结构，常见于细菌细胞中。
质粒提纯是指从细菌细胞中分离纯净的质粒DNA，并去除其他细菌细胞成分和杂质的过程。
质粒提纯的原理主要包括质粒提取、细胞裂解、DNA溶解、去除杂质、DNA沉淀、洗涤和干燥等步骤。
1. 质粒提取：质粒提取是通过裂解细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
常见的方法有碱裂解法、酶裂解法和热裂解法。
其中，碱裂解法是最常用的一种方法。
在碱裂解法中，首先将含有质粒的细菌培养物经离心分离得到菌体沉淀，然后用碱溶解菌体，使细胞壁和细胞膜破裂，释放质粒DNA。
2. 细胞裂解：细胞裂解是指将细菌细胞壁和细胞膜破裂，释放细胞内的质粒DNA。
细胞裂解的方法包括机械破碎、超声波裂解和酶裂解等。
机械破碎法是将经离心得到的菌体沉淀在低温下用椎管等器械进行破碎，使菌体破裂，释放DNA。
超声波裂解法则是利用超声波的高频振动实现细胞破碎，释放DNA。
酶裂解法则通过添加蛋白酶、脱氧核酸酶等酶，使细胞壁和细胞膜被酶降解，释放DNA。
3. DNA溶解：DNA溶解是指将裂解的细胞中的DNA从其他细胞成分中分离出来。
一般来说，DNA可以通过溶于乙醇或异丙醇的方式沉淀下来，然后经过离心分离得到。
此步骤的目的是将DNA和其他细菌细胞成分如蛋白质、RNA等分离。
4. 去除杂质：在DNA溶解的过程中会有一些杂质如蛋白质、RNA等混入溶液中。
为了获得纯净的质粒DNA，需要去除这些杂质。
一般可以通过加入酶解剂如RNase A或蛋白酶K进行酶解，使RNA或蛋白质被降解。
然后通过盐酸/乙醚等混合液体沉淀蛋白质，或者通过乙醇沉淀RNA等方式去除杂质。
5. DNA沉淀：通过加入适量的盐和乙醇，使DNA与DNA溶液中碱性pH值条件下的盐结合形成DNA盐沉淀，同时DNA与乙醇结合形成DNA乙醇沉淀。
此过程中DNA成为不溶性盐和DNA乙醇复合物，通过离心分离沉淀下来。
沉淀条件可以根据实验需要进行调整，如调节盐和乙醇的浓度、温度等。
质粒提取方法详解
第一节概述把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,缍钥股氐目剐缘取质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed cont rol)。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%.第二节利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。
当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种,这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
质-粒-提-取-原理及步骤
质-粒-提-取-原理及步骤概述质粒提取，又称DNA提取，是一种分离和提取所需DNA的过程。
质粒提取在许多实验中都是非常重要的步骤，例如基因工程、分子生物学、遗传学和其他DNA相关实验。
本文将介绍质粒提取的原理及步骤。
原理DNA提取的过程通常包括细胞破碎、DNA纯化、DNA溶解和复性等步骤。
对于质粒提取，主要步骤通常包括以下内容：1.细菌培养：在质粒提取之前，需要将细菌培养在含有适当抗生素的培养基中，用于扩增质粒数量。
2.细胞破碎：使细胞破裂以释放出含有质粒的细胞内物质，此步骤需要进行严格的抗污染措施，以避免污染质粒样本。
3.除去污染物：除去细胞壁、蛋白质、核酸和其他污染物。
4.离心分离：将上述步骤中提取出的样本进行离心分离，使DNA沉淀，以便进一步纯化。
5.溶解：通过加入一定的缓冲液或去离子水，使DNA重新溶解。
步骤以下是一种常见的质粒提取步骤：1.处理样本：将含有所需质粒的细胞收集，并进行初始处理，包括细胞壁破裂、核酸纤维溶解等。
2.傅里叶纯化：通过傅里叶变换纯化，将细胞内杂质和有机污染物清除。
3.离心分离：将细胞样本离心，使DNA沉淀到底部，并且将上层样本移除。
4.乙醇沉淀：加入乙醇沉淀，将DNA纯化到上清液。
5.重振溶解：最后使用适当缓冲液重振重振溶解DNA，也可以使用去离子水重振。
以上就是质粒提取的原理和步骤，这是一个非常重要的操作，在DNA研究和实验中有着广泛的应用。
我们需要注意的是，在操作过程中需要进行高标准的质量控制，以确保实验结果的准确性。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
提取质粒的方法
提取质粒的方法提取质粒是分子生物学实验中的常见步骤之一，其目的是将细菌中的质粒分离出来，以进行后续的实验操作。
提取质粒有多种方法，本文将介绍其中的几种常用方法及其优缺点。
一、CACl2热激转化法CACl2热激转化法是经典的提取质粒方法之一。
其过程如下：1. 将含有目的质粒的细菌培养物进行扩增，使细菌数达到一定程度。
2. 离心将细菌沉淀下来，将培养液中的菌落去除。
3. 用无菌水洗涤细菌沉淀，用CACl2溶液缓慢重悬细菌，使CACl2浓度达到0.1M。
4. 加入pH 6.5的冷缓冲液，浸泡在冰上15分钟。
5. 在热水浴中40-45℃，热激转化。
6. 加入含有抗生素的琼脂糖平板上进行筛选。
该方法的优点是操作简单，不需要特殊设备，且质粒提取量较大。
但其缺点也显而易见，即有毒化学物质CACl2使用，对质粒构建的影响较大，在序列克隆等需要高质量的质粒时不适用。
二、碱裂解法碱裂解法是一种有效的质粒提取方法，是利用质粒DNA与蛋白质的不同耐碱性，将质粒分离出来的方法。
其操作流程如下：1. 将细菌沉淀用含50mM Tris-HCl（pH 8.0）的盐水洗涤。
2. 加入含50mM Tris-HCl（pH 8.0）、25mM EDTA和1%SDS的Lysis Buffer（血浆蛋白）溶液，充分振荡混合，放在65℃水浴中加热，使细胞破裂并释放DNA和蛋白质。
3. 加入冷异丙醇，低温离心，使DNA和蛋白质分开。
注意此步骤中异丙醇的体积比例对DNA的提取量有较大影响，需根据实验需要酌情设置。
4. 倒出上清液，将沉淀用50%异丙醇洗涤。
5. 将洗涤后的沉淀用无菌水重悬，进行后续实验操作。
碱裂解法优点较多，其操作简单、快捷，可以得到较纯的质粒DNA，适用于后续实验需要高质量的DNA。
三、亲水性亲油性法亲水性亲油性法又称酚-氯仿法，其原理是利用亲油性有机溶剂和亲水性酚盐在酚-氯仿-异丙醇三相体系中分离质粒和其它细胞成分。
其操作流程如下：1. 培养含有质粒的细菌，并进行扩增。
三种提取质粒的方法及原理
三种提取质粒的方法及原理《三种提取质粒的方法及原理》一、离心法离心法是最常用的一种提取质粒的方法，它通过离心力的作用，使细胞或质粒（例如DNA、RNA等）从悬浮液中分离出来，从而得到提取的质粒。
分离过程如下：1.从对象（例如细胞）上提取纯化的质粒，使其形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量离心机中，加入适当的离心剂，并配置合适的离心条件（如离心速度，离心时间）。
3.根据离心力，细胞及其他悬浮液的组分会在离心机的内壁及底部形成层，质粒则聚集在中心处，形成离心质粒。
4.把离心质粒从中心处取出，即可得到纯化的质粒。
二、丙酮离心法丙酮离心法是一种以丙酮、乙醇和水作为分离剂的提取质粒方法，它可用于提取活性质粒，如抗体、RNA和DNA等，这是因为丙酮和乙醇可以良好地维持质粒的活性，并可以使悬浮液以柱状分离，有利于质粒的提取。
丙酮离心法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如200 ml丙酮），形成悬浮液。
2.将悬浮液置于微量离心机中，并配置合适的离心条件。
3.由于丙酮和乙醇的作用，悬浮液以柱状分离，并形成梁状质粒在柱峰中。
4.把梁状质粒从柱峰中取出，即可得到纯化的质粒。
三、超滤法超滤法是一种用于提取质粒的物理分离方法，它通过扩散作用及滤膜孔径的大小，可以有效地将非蛋白质物质等从悬浮液中分离出来，而不改变其本身的结构和性质。
超滤法的分离过程如下：1.将所要提取的对象加入适当的提取液（如水），形成悬浮液。
2.将所得悬浮液置于微量超滤器中，并配置合适的超滤条件（如超滤压力、超滤温度）。
3.根据超滤的原理，液体及其他悬浮物质会被超滤滤膜过滤，而质粒则不会被过滤，从而被滤过的液体中提取出质粒。
4.把质粒从超滤液中取出，即可得到纯化的质粒。
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质粒提取来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-09-17一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA ， 这些方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长、细菌的收获和裂解、质粒DNA 的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA 。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA 的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。
在加入EDTA 后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA 变性，但闭环质粒DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当条件恢复正常时，质粒DNA 链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。
糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA 所占位置形成一致密的、模糊的区带。
因此很难避免质粒DNA 内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。
故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。
4)当从表达内切核酸酶A 的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。
因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A ，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA 会被降解。
但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。
5)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。
然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA 的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。
大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。
有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA 的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA 的量大致相等。
(三)质粒DNA 的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。
例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。
溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。
由此导致线状DNA 的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。
最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。
但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 。
由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。
多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。
然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。
其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。
本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。
二、质粒DNA的小量制备(细菌的收获和裂解、收获、碱裂解法、煮沸裂解、质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策)质粒ＤＮＡ的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解１.收获１）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
３）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
２．碱裂解法１）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。
溶液Ｉ50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。
应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
３）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/Ｌ乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上３－５分钟。
４）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
５）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心２分钟，将上清转移到另一良心管中。
有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
６）用２倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。
振荡混合，于室温放置２分钟。
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心５分钟。
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
９）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。
ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温育1－2小时。
将剩余的DNA贮存于－20℃。
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：３．煮沸裂解１）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。
STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-100２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。
如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。
３）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。
４）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。
５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心２分钟。
10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。
11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。
注：当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。
因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。
在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。