流式细胞仪12-DNA的获取和分析
流式细胞仪常用的几种检测方法
精品文档，放心下载，放心阅读流式细胞仪常用的几种检测方法（转载）一、测定用乙醇固定的DNA的含量1、培养细胞的DNA含量的测定精品文档，超值下载制备单细胞悬液于200μl的PBS缓冲液中；加入2ml预冷的70%乙醇，4℃保存；附:细胞固定的一般步骤1) 取单细胞悬液1～2×106个细胞于PBS（PH=7.2）缓冲液中；2) 300g离心5分钟，弃上清，反复两次；3) 重悬细胞于0.5ml PBS缓冲液中；4) 将细胞悬液放置于2～3ml冷70%乙醇中，混匀，保存于4℃，至少30分钟。
在4℃条件下可保存2~3周。
注意：²根据实验的要求，固定剂也可选用1～3%多聚甲醛；²将乙醇作为固定剂时，乙醇应预冷至0～4℃；²细胞在固定时，固定剂应缓慢滴入细胞悬液中，使固定剂的浓度缓慢增加，并不断震摇，以免细胞成团（特别是用乙醇固定时）。
² 300g离心5分钟，去上清，再重悬于400μl PBS中；²显微镜下观察，若有明显的黏附，须再用筛网过滤；²加入PI（含Rnase），避光孵育30分钟；²上机检测。
2、新鲜组织的DNA含量的测定1) 用200mg湿重组织用机械法制成单细胞悬液；2) 500g离心5分钟；3) 弃上清，重悬于10ml染色-去污剂中；4) 再过滤，用200目的筛网或70~80μm的筛网过滤；5) 上机检测。
3、石蜡包埋组织切片的DNA含量的测定1) 从石蜡包埋切取切片50 μm厚，2~3片，制成单细胞悬液；2) 用PBS缓冲液洗涤，500g离心5分钟，弃上清；3) 加入PI液1ml室温避光30分钟；4) 调整细胞浓度为1×106/ml；5) 上机检测。
二、细胞凋亡检测及相关分子检测1、细胞DNA含量分布（由细胞DNA降解方式检测细胞凋亡）²收集已固定的单细胞悬液约5×105~1×106/ml；²离心除去固定液，3ml PBS重悬细胞;² 1500rpm离心，5分钟，弃去PBS；²加PI染液1ml，室温避光20分钟；²调整细胞浓度5×105/ml；²上机检测。
流式细胞术分析的工作原理及应用
流式细胞术分析的工作原理及应用1. 工作原理流式细胞术（Flow Cytometry）是一种广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域的细胞分析技术。
它基于细胞在流式细胞仪中通过单个细胞传感器单元的原理，可以实时、快速地检测和分析细胞的各种特性。
1.1 流式细胞仪原理流式细胞仪是流式细胞术分析的核心工具。
它将细胞悬浮液注入到一个窄小的液流中，并通过雷射束（Laser Beam）对细胞进行激发。
当细胞经过激发光束时，会发射出特定波长的荧光信号。
流式细胞仪通过光学设备收集并分析这些信号，从而获得关于细胞的信息。
1.2 细胞荧光标记在流式细胞术分析中，细胞通常会被标记上特定的荧光染料，以便测量其特定特征。
这些标记可以是单一的，也可以是多重的，用于同时分析多个参数。
1.3 数据分析流式细胞仪在测量细胞荧光信号的同时，还会记录细胞的大小、形状和荧光强度等参数。
这些数据可以通过特定的软件进行分析和解释，以获得关于细胞数量、细胞类型和细胞功能等方面的信息。
2. 应用领域流式细胞术分析具有广泛的应用领域，在生物医学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
2.1 免疫学研究流式细胞术在免疫学研究中广泛应用，可以用于分析免疫系统中不同类型的细胞数量和功能。
通过对白细胞表面标记物的检测，可以检测特定细胞亚群的存在，并研究其在疾病和免疫反应中的作用。
2.2 肿瘤学研究流式细胞术在肿瘤学研究中也扮演重要角色。
它可以用来研究肿瘤细胞的增殖、存活和死亡等关键特性，进而评估药物治疗对肿瘤细胞的影响。
此外，流式细胞术还可以检测循环肿瘤细胞，从而提供肿瘤早期诊断和治疗监测的手段。
2.3 微生物学研究流式细胞术被广泛应用于微生物学研究中，可以用于分析微生物的数量和生物学特性。
通过对细菌、真菌和病毒等微生物的荧光标记，可以确定它们的种类、数量和活性，从而研究其生长规律和致病机制。
2.4 干细胞研究流式细胞术在干细胞研究中也扮演重要角色。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分析
流式细胞仪的流动室和液流驱动系统
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (二)激光光源与光束形成系统
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• 目前台式机FCM，大多采用氩离子气体 激光器。激光(laser)是—种相干光源， 它能提供单波长、高强度及稳定性高的 光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想 光源。由于细胞快速流动，每个细胞经 过光照区的时间仅为1μs左右，每个细 胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号 强弱，与被照射的时间和激发光的强度 有关，因此细胞需要足够的光照强度。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (2)侧向角散射：侧向角散射是指 与激光束正交90°方向的散射光 信号，侧向散射光对细胞膜、胞质、 核膜的折射率更为敏感，可提供有 关细胞内精细结构和颗粒性质的信 息。
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
2．荧光信号
激光的作用原理
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• 前向角散射光（FSC, Forward Scatter）
细胞相对大小及其表面积
• 侧向角散射（SSC, Side Scatter）
•
细胞粒度及细胞内相对复杂性
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
• (1)前向角散射：前向角散射与被测细 胞的大小有关，确切地说，它与细胞 直径的平方值密切相关。通常在FCM 应用中，选取FSC作阈值，来排除样 品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒， 以避免对被测细胞的干扰。
流式细胞仪的构造工作 原理及数据分析
2024/2/1
流式细胞仪的构造工作原理及数据分 析
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究领域的仪器，用于分析和计数细胞、细胞内份子和细胞表面标记物。
它通过将细胞或者颗粒悬浮液通过一个细长的流动通道，并使用激光束照射样本，测量样本中的荧光和散射信号来获取细胞的信息。
流式细胞仪的工作原理可以分为以下几个步骤：1. 细胞或者颗粒的制备：样本通常是细胞悬液，可以从组织、血液或者其他样本中获得。
在进入流式细胞仪之前，样本需要经过预处理步骤，如细胞溶解、染色或者标记。
2. 样本注射：样本通过一个注射器被注入到流动通道中。
为了保持单个细胞的分离，样本注射速度需要控制在一定范围内。
3. 细胞定位：样本进入流动通道后，细胞会以单个细胞的形式通过激光束。
流式细胞仪中的光学系统包括一个激光器和一组光学镜片，用于聚焦激光束并将其定位在流动通道中。
4. 光散射和荧光检测：当细胞通过激光束时，它们会散射出光线，并且某些细胞还会发出荧光。
流式细胞仪使用一组光学镜片和探测器来采集这些散射和荧光信号。
光散射信号提供了关于细胞大小和形状的信息，而荧光信号则提供了关于细胞内份子的信息。
5. 数据分析：流式细胞仪采集到的信号会被转化为数字信号，并通过计算机进行处理和分析。
使用专业的流式细胞仪分析软件，可以对细胞进行分类、计数和分析。
流式细胞仪的工作原理基于光学原理和细胞生物学原理。
通过测量细胞的光散射和荧光信号，可以获得关于细胞的许多信息，如大小、形状、表面标记物的表达水平等。
这使得流式细胞仪成为生物医学研究中不可或者缺的工具，广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学等领域。
流式细胞仪的工作原理使得研究人员能够更深入地了解细胞的结构和功能，从而推动了生物医学研究的发展。
它的高通量、高灵敏度和多参数分析的特点使得研究人员能够更加全面地研究细胞的特性和相互关系，为疾病诊断和治疗提供了重要的依据。
流式细胞仪的工作原理的不断改进和创新将进一步推动生物医学研究的发展，为人类健康做出更大的贡献。
流式检测细胞周期的原理
一．细胞周期的检测1、原理：细胞在有丝分裂的过程中DNA会加倍。
（n----2n）2、我们使用PI来标记DNA。
PI的通到是FL23、荧光信号的表示方法，有荧光的宽度（W），荧光的高度（H），和荧光信号的积分面积（A）.我们使用荧光的积分面积（A）来检测细胞周期的变化.因为，即使DNA的含量相同的两个细胞，如果细胞的形状差异较大，荧光信号的高度是不相等的。
但是积分面积一定相等。
4.接下来我以二倍体细胞为例降解，流式检测细胞周期的过程。
首先，我们知道细胞分为处于静止期的细胞（G0）和处于分裂状态的细胞，分裂期状态的细胞又有G1期，S期,G2期和M期。
我们来分析下各个时期DNA含量的变化。
G0期DNA数目为n.G1期细胞主要进行RNA和蛋白的合成, DNA数目为n.S期DNA开始复制，直到复制结束进入M期，DNA数目从n变为2n.G2期主要是RNA和蛋白的合成,为M期做准备 DNA数目为2nM期细胞分裂的过程，直到M结束细胞一分为二，DNA数目也是2n.从DNA的数目上，我们可以将细胞周期分为G0/G1期，s期，G2/M期.我们利用荧光强度的积分面积来检测，利用直方图来表示，如果G0/G1期处于50的位置，那么G2/M期处于100的位置。
期间的为S期。
4、但是有个问题值得我们注意。
我们的样本很容易聚集有时候两个G1期的细胞会聚集在一起形成粘连体，通过激光照射区时，其荧光强度会和G2期的相同，这就需要排除粘连体。
我们BD公司的专利技术可以使粘连体通过检测区的荧光宽度比G2期的长。
我们利用W对A的散点图分析，如果G0/G1期在50的位置，那么G2/M期在100的位置，其他的位置为粘连体和一些不符合检测的细胞及碎片等。
我们通过画门来得到我们需要检测的细胞。
5、因此我们需要三个图就可以检测到我们的细胞周期变化情况，第一个散点图，通过前向和侧向的变化，区分出我们要检测的细胞群。
第二个散点图我们出去粘连体。
第三个直方图得到我们的细胞周期变化。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。
确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足够空间容纳本批标本排弃的废液。
如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中气压。
2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。
3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中气泡。
二、运行FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三色标准微球样本。
一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。
2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。
选择所需校正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。
3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。
4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。
功能键设置在“RUN”。
5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。
6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。
7.做Set up。
8.打印校正结果，退出FACSComp程序。
备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。
在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。
三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。
1.（2）对实验样本进行命名；（3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。
备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。
3.画图选择画图工具（一般选择散点图），Inspect界面会自动弹出，对几选中图形），将更改横纵坐备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。
（1一般获取10000个细胞。
（2（3）将所有补偿调为0（4）将非52（5）FSC和SSC（64.上阴性对照将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。
流式测凋亡原理步骤和结果判断
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断一、原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。
二、步骤：1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。
用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。
待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。
重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。
将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。
整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V荧光，FL2通道检测PI荧光。
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DNA测定
一、材料和试剂
1、抗凝外周血；
2、DNA QC Particle，DNA测定质量控制试剂盒（BD公司，349523，25tests）
CEN：小鸡红细胞核，CTN：小牛胸腺细胞核，核酸染料PI。
CEN试剂经过特殊处理而成，包括单个核，双联体核，三联体核和更大的聚集体，用来检测仪器的线性度和分辨率。
PI染色后，由于这些细胞核聚集程度的不同，在PI-A的直方图中会出现至少4个峰，而前4个峰分别代表单个核，双联体核，三联体和四联体。
若染色正常，仪器的线性度良好，则后三个峰所在道数的平均值与第一个峰值的比值应接近于2，3，4。
CTN具有细胞周期的各个时期，大部分核处于G0/G1期，小部分处于S期和G2/M期。
两个粘连起来的G0/G1期细胞核可以通过DDM与单个G2/M期细胞核区分开来，DDM的功能就是将双联体细胞核或其它聚集体与单个细胞核区分开来，以确保G2/M期的比值有意义。
3、CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit（BD公司，340242，40tests）
试剂A（10ml）:含有胰蛋白酶，四氢氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织片段，消化细胞膜及细胞骨架。
试剂B（8ml）:含有胰蛋白酶抑制剂，RNA酶，柠檬酸盐缓冲液，四氢氯化精胺。
用于抑制胰蛋白酶的作用并消化RNA。
试剂C（8ml）:含有PI染液，四氢氯化精胺，柠檬酸盐缓冲液。
PI作用时的最终浓度至少有125ug/ml。
二、样本制备
1、质控样本的制备（DNA QC Particle）
CEN：轻轻摇匀后，吸取40ul到1mL的PI中，混匀，室温避光放置10分钟，即可上机。
CTN：大力震荡试剂瓶，吸取40ul 到1mL PI中，混匀室温避光放置10分钟即可上机检测。
2、外周血DNA样本的制备（CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit）
2.1 将100ul抗凝外周全血加入12x75mm的管中；
2.2 加入1x的溶血素2ml，混匀，室温放置10分钟；
2.3 室温300×g离心5分钟，吸去上清夜；
2.4 加入2mlPBS洗涤细胞2次，室温300×g离心5分钟，吸去上清液；
2.5 加入250ul A液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟；
2.6 加入200ul B液，轻轻混匀，不要震荡，室温静置10分钟；
2.7 加入200ul C液，轻轻混匀，不要震荡，低温（2-8℃）避光静置10分钟；
2.8 用300目过滤尼龙网或50um尼龙网膜或35um细胞过滤器过滤细胞；
2.9 低温避光放置以待上机检测。
建议在加入C液后3小时内上机，上机前轻轻混匀细胞悬液。
3、培养细胞DNA样本的制备：
3.1 胰酶充分消化，加PBS吹打成单个细胞；
3.2 室温500×g离心5分钟，吸去上清液，加1mlPBS重悬；
3.3室温300×g离心5分钟，吸去上清液，加1mlPBS重悬；
3.4 吸去上清液，加入PBS重悬细胞，调整细胞浓度到1.0×106细胞/ml；
3.5 取上述浓度的细胞1ml，室温300×g离心5分钟，吸去上清液，留下100ul左右悬液；
3.6 混匀，按“外周血DNA样本的制备”步骤中的2.5继续制备样本。
三、流式上机检测（以CTN为例）：
1、在浏览框里建文件夹（DNA）和实验组（PI），样本（日期），1个采集管（CTN），并重命名。
2、选择Cytometer>View Configuration，确保当前的仪器设置包含了合适的参数，本实验需要添加一个
parameter，即PI，蓝光激发，用B接收器接收。
3、将“浏览框”的采集箭头选中采集管，点击“仪器框”的参数parameter页面，删除不必要的荧光参
数，仅保留PI（仪器设置列表中B探测器下有多个参数，默认显示PerCP-Cy5.5，在该参数的下拉菜单中选择PI）。
4、所有参数均设为线性，FSC选H高度信号，其余选A面积信号，PI还需选择W宽度信号。
阈值设为
PI，定为5000（收集包括从二倍体G1峰道数值1/10处以上所有的信号）。
5、在“通用工作页面”上建获取模板：
①一共画三个图：前两个图为散点图，第三个为单参数直方图。
第一个图，横轴FSC-H，纵轴SSC-A；
第二个图，横轴PI-W，纵轴PI-A，（DDM模式，区别粘连细胞）；
第三个图，横轴PI-A；
②选中第三张图：
⑴在50和100道数位置设两个间隔门P1、P2。
并选择“Show Population Hierarchy”。
⑵单击右键，选择“Create Statistics View”，右键单击统计图，选择“Edit Statistics View”，在“Edit
Statistics View”窗口的“Statistics”页面选择PI的“Mean，CV”选项。
6、上机检测：
①放CTN在流式细胞仪上。
确认调节机器、获取样本均为低速。
②确认数据采集箭头指向该管；点击“Acquire”按扭。
③看通用工作页面中的散射光点图，调整FSC和SSC电压，使图中细胞群显示在合适位置。
④看PI直方图，调节PI电压，使得CTN单个细胞核的DNAG0-G1峰位于50道数上。
⑤看PI散点图（横轴PI-W，纵轴PI-A），观察单个细胞群的位置。
⑥调试结束后，在“采集控制框”里选择获取全部30000个微粒停止，记录数据。
四、数据导出：
Diva软件的数据是以“FCS 3.0”版本格式输出。
而ModFIT软件可分析的流式数据为“FCS 2.0”版本格式，因此需将数据导出，转变版本格式。
1、在“D：\BD Export\FCS”目录下，选择“File>New>Folder”命令，新建一个文件夹。
2、双击打开要导出的实验组，选择“File>Export>Export FCS”命令。
3、在“Export Parameter（输出参数）”窗口中选择“FCS 2.0”版本，所有实验涉及的参数均设为线性关
系，并把不用的参数选为none，单击“OK”。
4、在目录路径的最后，加上您在“驱动盘D:”中新建的文件夹的名字或者用对话框上的“Browser”找
到新建文件夹的存储路径。
5、单击“Save (保存)”。
五、Analysis数据分析（用ModFIT软件）
1、在桌面上双击ModFIT图标，打开软件，OK-OK-进入软件主屏；
2、在File下打开数据保存文件夹，文件类型设为ALL File，选出待分析的文件；
3、选择参数Choose parameter of analysis，选PI-A，双击；
4、在设门中选择Defile gate（根据需要，选择是否设门，设几个门）
✧Gate 1：X轴选FSC，Y轴选SSC，OK，然后在图中圈出你所要分析的细胞；
✧Gate 2：X轴选PI-W，Y轴选PI-A，OK，然后在图中圈出你所要分析的单个细胞；
✧OK后出现一个峰图。
5、对这个图进行分析
✧自动分析（点击工具栏中的Auto键）。
✧手动分析
1）单击工具栏中的Mod键：选择分析所要的参数（是否有凋亡Apoptosis，是否有标准参照Standard，是否有聚集体），选择有几个Cycle（二倍体、四倍体、异倍体），并对每
一个循环是否有S期和G2/M期进行定义－OK;
2）确认每个峰的位置，并将Range放置于不同的峰上；
3）单击工具栏中的Fit键，软件开始以最小乘法拟合曲线，并进行统计；
4）此外，还可以点击工具栏中的Diags键来得到关于分析结果的一系列评估指标。
6、Save As 保存分析结果，Print打印分析结果。
7、报告中至少应包含以下信息：
⑴DNA倍体，包括所有群体的DI；⑵主要G1峰的CV；⑶S期比例；
⑷必要的简单评价：如细胞数的不足、碎片较多、CV太高等。