饮料中食品添加剂的HPLC分析

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HPLC法测定红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛的含量论文

HPLC法测定红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛的含量【摘要】目的：建立高效液相色谱法测定红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛含量的方法。

方法：选用hpc18柱（4.6×250mm），流动相：癸烷磺酸钠溶液（0.14%）-乙腈-磷酸（800：200：1），检测波长为280nm对其进行含量测定。

结果：咖啡因在7.092μg～141.84μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=25558x+9848.7，r=0.9998；烟酰胺在4.55μg～90.99μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=1816.1x-220.24； r=0.9993；盐酸吡哆辛在1.026μg～20.52μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为y=17924x-2342.6，r=0.9999。

结论：本法简便、可靠，可作为红牛饮料中咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛的含量测定方法。

【关键词】hplc法；咖啡因；烟酰胺；盐酸吡哆辛；含量测定【中图分类号】r427 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2012）13-0043-02有些食品为了改善食品色、香、味等品质，通常使用食品添加剂。

红牛饮料中含有咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛等成份，其中咖啡因具有提神醒脑等刺激中枢神经作用，且易上瘾，故而建立咖啡因等成份的含量测定方法十分必要，笔者研究建立了红牛饮料中的咖啡因、烟酰胺、盐酸吡哆辛等三个成份的含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药1.1仪器：岛津lc-20泵， cbm-20a型控制器，spd-20a型检测器，lc-solution色谱工作站。

万分之一电子分析天平（ael-200）。

1.2试剂与试药：咖啡因对照品（批号：1215-9503 ）中国药品生物制品检定所；烟酰胺对照品（批号：100115-200703 含量99.9%）中国药品生物制品检定所；盐酸吡哆辛对照品（批号：100116-200502 ）中国药品生物制品检定所；色谱甲醇，纯化水，其他试剂均为分析纯。

应用HPLC法测定果汁饮料中的纳他霉素含量

应用HPLC法测定果汁饮料中的纳他霉素含量作者：李夏林覃晓来源：《食品安全导刊》2012年第06期纳他霉素（Natamycin）又称游链霉素（Pimaricin），是一种多烯烃大环内酯类抗生素，能有效抑制霉菌和酵母菌的生长，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。

1996年我国食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准。

根据我国《食品添加剂使用标准》的规定，果蔬汁（浆）中纳他霉素的最大使用量为0.3g/kg。

本文参照《食品中纳他霉素的测定液相色谱法》，对果汁饮料中纳他霉素的测定进行了方法学考察，以供相关检测人员参考。

SHIMADZU LC-20A全自动液相色谱仪（岛津制作所），METTLER XS105DU电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)，KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；纳他霉素对照品（批号：00105、含量：89.0%，以无水物计97.0%、德国Dr、上海安普科学仪器有限公司）；统一鲜橙多（批号：2011-10-17，广州统一企业有限公司）；甲醇为色谱纯；冰乙酸为优级纯。

备溶液，备用。

（2）样品溶液的制备：精密量取鲜橙多供试样10mL,置50mL锥形瓶中，加入甲醇30mL,超声提取30min，提取液依次过0.45μm和0.22μm的滤膜，取滤液备用。

3.方法的专属性取溶剂甲醇、样品溶液、加标样品溶液与对照品溶液，按上述色谱条件，分别依法注入液相色谱仪，记录色谱图。

结果：溶剂甲醇对纳他霉素测定无干扰，样品未检出纳他霉素，其内源性物质对纳他霉素测定无干扰，加标样品与对照品在相同时间位置上检出纳他霉素峰（见图1）。

4.校准曲线和检出限、定量限取2（1）项的标准储备液，甲醇分别稀释制成纳他霉素质量浓度为10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL的系列标准溶液，各取10μL，按上述色谱条件，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标（Y），与其对应的浓度为横坐标（X）绘制校准曲线，计算回归方程为：Y=58962X-5640，相关系数r=0.99998。

第四章食品添加剂的分析第四节饮料中咖啡因的测定方法

第四节饮料中咖啡因的测定方法
5.结果（1）计算：可乐型饮料中咖啡因含量ω
（4-2）
咖啡、茶叶及其固体制成品中咖啡因含量（mg/100g）
（4-3）
咖啡、茶叶及其液体制成品中咖啡因含量（mg/L）（4-4）
第四节饮料中咖啡因的测定方法
式中： ω—— 样品吸光度相当于咖啡因浓度， μg/mL；
第四节饮料中咖啡因的测定方法
二、高效液相色谱法(HPLC) 1.原理咖啡因的甲醇液在286nm波长下有最大吸收，其吸收值的大小与咖啡因浓度成正比，从而可进行定量。 2.试剂（1）甲醇：HPLC试剂。（2）乙腈：HPLC试剂。（3）三氯甲烷：分析纯(必要时须重蒸)。（4）超纯水(18.2MΩ)。（5）无水硫酸钠：分析纯。（6）氯化钠：分析纯。（7）咖啡因标准品：纯度98%以上。
第四节饮料中咖啡因的测定方法
（5）15％(V/V) 磷酸溶液：吸取 1 5 mL 磷酸置于 100mL容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。
（6）20％(m/V)氢氧化钠溶液；称取20g氢氧化钠，用水溶解，冷却后稀释至100mL。
（7）20％(m/V) 乙酸锌溶液：称取 2 0 g 乙酸锌 [Zn(CH3COO)2·2H2O]，加入3mL冰乙酸，用水溶解并稀释至100mL。
相关系数：0.999。
方法回收率：91.9%～105.8%。
相对标准偏差：小于2%。
第四节饮料中咖啡因的测定方法
（3）允许差：同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝
对值可乐型饮料为5%。
（2）标准曲线的绘制从0.5mg/mL的咖啡因标准储备液中，用重蒸三氯甲烷配制成浓度分别为0，5，10，15，20μg/mL的标准系列，以0μg/mL作参比管，调节零点，用1cm比色杯于 276.5nm下测量吸光度，作吸光度－咖啡因浓度的标准曲线或求出直线回归方程。（3）样品的测定在25mL具塞试管中，加入5g无水硫酸钠，倒入 20mL样品的三氯甲烷制备液，摇匀，静置。将澄清的三氯甲烷用1cm比色杯于276.5nm测出其吸光度，根据标准曲线(或直线回归方程)求出样品的吸光度相当于咖啡因的浓度c(μg/mL)，同时用重蒸三氯甲烷作试剂空白。

饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定

仪器关机
测定结束后，点停止，停止泵运行。把A瓶中的滤头取出，放入超纯水中，设定水：甲醇=90：10的比例，点运行，启动泵运行 30分钟。30分钟后再设定100%甲醇运行 30分钟，后关闭软件，电脑。依次关闭各模块电源。
实验步骤1
按照下列高效液相色谱参考条件和仪器操作说明开机，设定。检测器：紫外检测器，230nm波长，色谱柱：C18 4.6×250mm, 5μm不锈钢柱流动相：甲醇：乙酸铵溶液（0.02 mol/L） =5:95（先100%甲醇运行10分钟后再设定次比例）流速：1 mL/min 进样量：10 μL
实验步骤4
先进混和标准溶液（ 0.1mg/mL）一针分析，记录色谱图及各峰面积保留时间。进汽水样品溶液，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。以其峰面积求出样液中被测物质的含量，供计算。
数据处理
以糖精钠为例
式中 X------试样中糖精钠含量，g/kg; A------进样体积中糖精钠的质量，mg； V2-----进样体积，mL； V1-----试样稀释液总体积，mL； m-----试样质量，g。
饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定—HPLC法
1、掌握HPLC测定饮料中糖精钠、苯甲酸钠和山梨酸钾的原理和方法。 2、了解HPLC的结构，学习HPLC的操作方法。 3、掌握HPLC的定性定量方法
糖精钠是最古老的甜味剂。糖精于1878年被美国科学家发现，很快就被食品工业界和消费者接受。糖精的甜度为蔗糖的300倍到500倍，它不被人体代谢吸收，在各种食品生产过程中都很稳定。据国外资料记载，1977年加拿大进行的一项多代大鼠喂养实验发现，摄入大量的糖精钠可以导致雄性大鼠膀胱癌。因此，美国等发达国家的法律规定，在食物中使用糖精时，必须在标签上注明“使用本产品可能对健康有害，本产品合有可以导致实验动物癌症的糖精”的警示。

食品添加剂检测新方法规范

食品添加剂检测新方法规范随着科技的进步和人们对食品安全的日益关注，食品添加剂的检测方法也随之不断改进和规范化。

本文将介绍一些食品添加剂检测的新方法，并探讨其规范化的重要性。

一、液相色谱法（HPLC）液相色谱法是一种常用的分析方法，可用于检测食品中的添加剂。

该方法通过将样品溶解在适当的溶剂中，然后通过色谱柱进行分离和测定。

液相色谱法具有分离效果好、准确性高的特点，可以检测多种食品添加剂。

二、气相色谱法（GC）气相色谱法是另一种常用的分析方法，适用于检测易挥发性的食品添加剂。

该方法通过将样品蒸发成气体并进入色谱柱进行分离和检测。

气相色谱法具有灵敏度高、分辨率好的特点，适用于检测微量的食品添加剂。

三、质谱联用技术（LC-MS、GC-MS）质谱联用技术是将质谱仪与液相色谱或气相色谱相结合的一种分析方法。

该方法不仅可以进行分离和检测，还可以通过质谱的特征图谱进行确定和鉴定。

质谱联用技术具有准确性高、灵敏度好的特点，可用于检测复杂的食品添加剂。

四、电化学方法电化学方法是一种用电流、电势和电量等电化学参数来进行检测和分析的方法。

该方法通过测量食品添加剂与电极间的电化学反应来确定其含量和特征。

电化学方法具有灵敏度高、分析速度快的特点，适用于检测特定的食品添加剂。

规范化对食品添加剂检测方法的重要性：1.确保食品安全：规范化的食品添加剂检测方法能够保证食品安全，有效地筛查出潜在的食品安全隐患，并采取相应的措施以确保消费者的健康。

2.提高检测准确性：规范化的检测方法能够减少人为误差，提高测试的准确性和重复性，避免不必要的误判和漏判，确保测试结果的可靠性。

3.提升监管能力：规范化的食品添加剂检测方法可以帮助监管机构更好地履行职责，加强对食品安全的监督管理，及时发现和处理可能存在的问题。

4.促进产业发展：规范化的检测方法能够提高食品添加剂产业的技术水平和竞争力，为企业提供可信赖的检测手段，促进行业的健康发展。

总结：食品添加剂检测新方法的规范化对保障食品安全、提高检测准确性、加强监管能力和促进产业发展具有重要意义。

HPLC法测饮料中苯甲酸、山梨酸

DAD1 B, Sig=230,16 Ref=360,100 (A001151.D) mAU 600 500 400 300 200 100 5 .8 1 1
DAD1 C, Sig=260,16 Ref=360,100 (A001151.D) mAU 50 40 30 20 10 0
0
-10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 min
HPLC法检测饮料中苯甲酸和山梨酸 HPLC法检测饮料中苯甲酸和山梨酸
一：
苯甲酸、苯甲酸、山梨酸的简单介绍
实验部分
二：
三：
数据分析及总结
一：苯甲酸、山梨酸的简单介绍苯甲酸、
苯甲酸（benzoic acid）类防腐剂作为最常用的防腐剂在食品中添加少量苯甲酸时，对人体并无毒害[1]。但过量摄入防腐剂会对人体产生一定的毒性，过量摄入苯甲酸和苯甲酸钠，会影响肝脏酶对脂肪酸的作用。其次苯甲酸钠中过量的钠对人身体健康产生影响，特别是对于心脏、肝、肾功能弱的人群而言，苯甲酸和苯甲酸钠的摄食是不适合的[2]。有些人群还伴有代谢性酸中毒、惊厥和气喘等病症[3]。苯甲酸在碳酸饮料中的使用量，国家标准也有严格限量。 GB2760 - 1996《食品添加剂使用卫生标准》规定苯甲酸在碳酸饮料中不得超过0.2 g/kg（以苯甲酸计）。山梨酸(sorbicacid)，学名 2，4－己二烯酸，对酵母、霉菌和许多真菌都具有抑制作用。是卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，但是根据GB2760 - 1996《食品添加剂使用卫生标准》规定山梨酸在碳酸饮料和橙汁饮料中不得超过0.5 g/kg（以山梨酸计）。如果食品中添加的山梨酸超标严重，消费者长期服用，在一定程度上会抑制骨骼生长，危害肾、肝脏的健康。
（二）试剂和原料

HPLC法测定碳酸饮料中的维生素C

HPLC 法测定碳酸饮料中的维生素 C摘要采用反相高效液相色谱法(HPLC)，测定碳酸饮料中的维生素C食品添柱化学键合固定相，以体积比为6：94的甲醇和0.02mol/L乙加剂。

实验采用C18酸铵(PH值为5.4)混合液为流动相，在紫外检测波长230nm，流速0.8ml/min,常温下进行检测。

高效液相色谱法测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量

分析检测高效液相色谱法测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸和糖精钠含量辛明彦（浮山县综合检验检测中心，山西临汾 042600）摘要：目的：建立高效液相色谱-紫外检测器测定果汁饮料中苯甲酸、山梨酸及糖精钠3种食品添加剂的分析方法。

方法：果汁饮料试样用纯水提取，经Acclaim TM 120 C18色谱柱分离，用紫外检测器测定。

结果：苯甲酸、山梨酸及糖精钠在1.00～50.00 mg/L线性良好，相关系数均大于0.999，3种添加剂的检出限均为0.005 g/kg，定量限均为0.015 g/kg，加标回收率为91.7%～109.0%，RSD为1.29%～3.36%。

结论：该方法前处理简便、分析速度快、准确度高及精密度好，可用于上述3种添加剂的定性、定量检测。

关键词：高效液相色谱；果汁饮料；食品添加剂Determination of Benzoic Acid, Sorbic Acid and Saccharin Sodium in Fruit Juice Drinks by HPLCXIN Mingyan(Fushan County General Inspection and Testing Center, Linfen 042600, China) Abstract: Objective: The method for the determination of benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium in fruit juice drinks by HPLC with UV detector was established. Method: Pear juice beverage samples were extracted with pure water, separated by Acclaim TM120 C18 chromatographic column and determined by UV detector. Result: The linearity of benzoic acid, sorbic acid and saccharin sodium is good at 1.00～50.00 mg/L, the correlation coefficient is greater than 0.999, the detection limit of the three additives is 0.005 g/kg, the quantitative limit is 0.015 g/kg, the recovery is 91.7%～109.0%, and the RSD is 1.29%～3.36%. Conclusion: The method has the advantages of simple pretreatment, fast analysis speed, high accuracy and good precision. It can be used for the qualitative and quantitative detection of the above three additives.Keywords: high performance liquid chromatography; fruit juice beverage; food additives随着我国社会经济发展与食品工业水平的提升，人们对饮料类食品的消费需求日益增长，果汁类饮料以其口味佳、富含维生素与矿物质等优势深受广大消费者喜爱[1-3]。

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四元梯度系统
一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
进样装置
流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，
色谱分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长一般为3～ 25cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效及分析速度。分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备
3．附加实验： (1) 不依靠保留时间鉴定各峰，而是以尿嘧啶的保留时间作为死时间，加入到标样与样品中，求k’值，利用k’值鉴定各个峰。选用几种流速进行分析从中选取最佳流速。 (2) 检测咖啡、茶、果汁等饮料中的添加剂。
六、实验关键及注意事项
• 要获得线性较好的标准曲线，应用同一根注射器进样。 • 流动相成份改变后，一定要等基线及压力线重新稳定后再进样分析。 • 如果柱压过高不要强行让仪器工作，应检查柱压过高的原因 • 流动相须用溶剂过滤装置过滤，样品进样前最好用样品过滤头过滤。 • 实验结束后，必须冲洗色谱柱。
三、仪器构造及主要部件
Agilent 1100高效液相色谱系统
仪器流程图
主要部件高压输液泵
—主要关键部件之一，压力：150～350×105 Pa。 —为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力。 —要求具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性 —柱塞往复泵， 100次/分钟
二、基本原理
• 苯甲酸和咖啡因是饮料中常用的添加剂，化学结构如下：
化合物均带有离子化的基团，-NH2或-COOH，因而它们的质子化程度或解离程度会随流动相的pH变化而改变，所以，在反相色谱中，它们的保留时间也会随流动相的pH变化而改变，但不同物质因疏水性及电离情况不同，只要选择合适的pH值，在反相柱上一定有不同的保留时间，从而产生色谱分离，所以本实验中,流动相pH的选择是关键点之一。另外，这四种化合物均带有芳香环，因此采用UV检测，可用254nm通用波长。
七、思考题
• 1. 确定流动相最佳pH时，应考虑哪些因素？
• 2. 分离上述四种添加剂时，为何不用偏碱性的流动相？ • 3. 用色谱保留时间进行实验样品中被测组份的定性有何缺点？比较可靠的定性方法有哪些？
开启HPLC仪，调节流动相流速为1.5mL·min1，检测器波长设定在254nm。分别以上述混合液为流动相进行HPLC分析（注意每次更换流动相时要达到充分平衡），混合标准液的进样量为 20μL，记注入10μL的单一标准样获取谱图与混合标样的色谱图对照，确定各组份的保留时间。
• • •
五、实验内容
1．流动相最佳pH选择：
(1) 将5.26mL的乙酸用蒸馏水稀释至100mL配成5个相同的乙酸溶液，分别在上述乙酸溶液中逐滴加入50% （ w/w ）NaOH调节pH，使配制溶液的PH依次为3.0， 3.5，4.0，4.2，4.5。滴加过程中的pH变化用pH计监测，（NaOH加入量约为1～2mL） (2) 将上述80mL的不同pH乙酸溶液分别与20mL甲醇溶液混合，配制成约 100mL 的不同 pH 的乙酸 / 甲醇（80/20（ V/V ））混合液。流动相随用随配（若储存可能有乙酸甲酯生成，会影响各组份的保留时间）。
饮料中食品添加剂的HPLC分析
邬建敏
一、实验目的
• 1. 学习高效液相色谱技术分析食品中常用添加剂的方法 • 2. 掌握高效液相色谱仪的基本构造 • 3. 理解反相液相色谱的工作原理，了解流动相 pH值对组份保留时间的影响。 • 4. 掌握利用HPLC对组分进行定性和定量的方法，并了解定性定量过程中可能会遇到的问题。
•紫外-可见光检测器
基于样品池(S)中的样品对光产生吸收，有信号差
– 如是可变波长检测器，还有分光系统(光珊)
流动池灯
R S
样品入口 Hg Zn Cd D2 254 214 229 可变
光电二极管
DAD 检测器
DAD检测器所获得的三维色谱图
四、仪器操作方法
• • • • • • • • • 打开计算机，等待windows操作系统启动。打开色谱仪主机所有电源启动计算机上色谱工作站的Bootp自检程序至自检通过。鼠标双击Instrument online快捷键图标，启动Chemstation 色谱工作站。设置泵参数（各流动相通道的比例，流速等）及检测器波长打开放空阀后，启动高压泵及检测器，观察各管路无气泡后关闭放空阀。观察信号窗口的基线及压力线是否稳定，等稳定后输入操作信息，准备进样分析。将六通阀打在“Load”位置，用微量注射器进样，再搬动阀至”Inject”位置，此时工作站开始采集数据，记录色谱图。待组分均出峰后，按F8停止色谱图记录，此时工作站会打开所记录的色谱图及相关数据（保留时间，峰面积，分离度等参数），并保存这次的分析结果。依次进样分析实验完成后，用纯水和甲醇分别冲洗色谱柱各8分钟以上。依次关闭工作站，计算机，色谱仪主机
(3)
将4种添加剂成分的色谱保留时间对流动相pH作图，确定流动相的最佳pH。
2．添加剂的定量分析： (1)在同样色谱条件下，依次注入2，5，10， 15，20μL的混合标样溶液，得相应色谱图。重复三次，将各组份平均峰高或峰面积对质量或注射体积做各组份的标准曲线。组份质量或注射体积应与峰高或峰面积成线性关系。 (2)饮料试样分析前应先放在超声波中脱气10min 或敞口放气过夜。用0.8μm的过滤膜过滤。按上述同样色谱条件进样15μL。记录色谱图，并根据保留时间、峰面积或峰高对饮料试样中食品添加剂进行定性和定量计算。实验结束后，用10mL 80/20(V/V)的水/甲醇混合液清洗色谱柱以保证柱效。注意柱子不能保存在酸性流动相中