羊血超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及化学修饰研究
超氧化物歧化酶提取分离及应用
超氧化物歧化酶提取分离及应用（Superoxide dismutase,SOD,Superoxide oxidoreductase, EC 1.15.1.1)SOD是一种新型酶制剂，属金属酶。
分布很广，几乎从哺乳动物到细菌，以及植物中均存在。
正常情况下仅存在于细胞溶质中。
存在于高等动物的红细胞、肝、脑组织中。
在微生物中主存于需氧菌。
SOD是催化超氧阴离子（O2-）歧化反应的酶类。
它的存在与生物体内的解毒作用有关，也发现与机体的衰老、肿瘤及免疫性疾病等有关。
因而受到医药界的关注。
目前中国国内已进入临床试验阶段。
超氧离子是氧分子获得一个电子而形成的负一价自由基。
在生物体内它可产生于某些酶的酶促反应过程中，如黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、二氢乳清脱氢酶、半乳糖氧化酶、色氨酸二氧酶及黄素蛋白脱氢酶类所催化的反应。
在儿茶酚胺、氢醌、肾上腺素、巯基基团四氢喋呤等物质的氧化过程中也产生并释放出超氧离子。
另外，在生物体遭受电离辐射时，在吞噬细胞吞噬消灭外来微生物的过程中，都会产生大量的超氧离子。
所以，在需氧生物体内，随时都有大量的超氧离子生成。
超氧离子具有较高的化学活性，对生物细胞具有一定的毒性。
它可与过氧化氢反应，生成毒性更强的羟基自由基（·OH）。
超氧离子与羟基自由基进攻生物膜，可改变膜的结构和通透性；进攻染色体，可使染色体降解、断裂。
它们还可攻击许多细胞内成分，使其失去生物活性和功能。
所以，如果生物体内或某一组织中超氧离子含量异常高，就会引起疾病，甚至死亡。
幸而，生物体内的超氧化物歧化酶在高速清除机体内随时产生的超氧离子。
一、提取分离SOD的制备方法随原料而异。
目前国际上制备SOD的原料有：动物血、微生物和动物组织。
作为药物大都是以血球为原料提取Cu·Zn-SOD，即使以富含Mn-SOD的牛肝为原料，在生产中也要通过螯金属离子制成Cu·Zn-SOD。
目前中国动物血如牛、羊、猪血大都未被利用，如若综合利用动物血中提取SOD，则具有一定实际意义。
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定、同工酶电泳
超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳实验⼆猪⾎中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活⼒测定、同⼯酶电泳⼀、实验原理超氧化物岐化酶SOD⼴泛存在于⽣物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的⾦属类酶。
它作为⽣物体内重要的⾃由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离⼦，在防御⽣物体氧化损伤⽅⾯起着重要作⽤。
SOD是⼀种酸性蛋⽩，对热、pH和蛋⽩酶的⽔解较⼀般酶稳定。
根据⾦属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。
CuZn-S0D酶蛋⽩的分⼦量约为3.2×104，每个酶分⼦由2个亚基通过⾮共价键的疏⽔基相互作⽤缔合成⼆聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原⼦各⼀个，活性中⼼的核⼼是铜。
SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之⼀，可以直接清除过量的超氧⾃由基，阻⽌机体的过氧化，对机体有较⾼的防护作⽤及保健价值。
本实验采⽤有机溶剂沉淀法以新鲜猪⾎为原料，从中提取SOD硬进⾏纯化。
酶活⼒测定可⽤以下⽅法：黄嘌呤氧化酶法、细胞⾊素C法、肾上腺素⾃氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚⾃氧化法等。
⽽该实验SOD酶活性采⽤邻苯三酚⾃氧化法测定。
酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚⾃氧化速率达50%时的酶量定义为⼀个活⼒单位。
SOD同⼯酶奠定采⽤不连续聚丙烯酰胺-的作⽤，因此，电泳分离SOD后，凝凝胶电泳技术分离鉴定。
⽤“负”显⾊法显⽰。
由于SOD能够抑制O2胶上⽆SOD处显⽰为蓝⾊，⼜SOD处为⽆⾊透明，由此可以鉴定SOD同⼯酶酶谱。
⼆、实验试剂与器材ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%⼄醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、分析天平、具塞试管、刻度吸管、离⼼机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。
从动物血液提取SOD的工艺流程及技术
从动物血液提取SOD的工艺流程及技术ＳＯＤ(过氧化物岐化酶，Superoxide dismutase)存在于动物、植物及微生物中的金属酶，主要分为以下几种类型(如表)。
表 ＳＯＤ的分类及存在类 ＳＯＤ用于延缓人体衰老，防止色素沉着，并治疗慢性多发性关节炎等症，也被广泛地应用于生产日用化工品，如ＳＯＤ化妆护肤品，对抗衰老、去除脸面雀斑等有明显的效果。
随着日用化工产品的发展及ＳＯＤ在临床上的应用，ＳＯＤ的需求量越来越大。
我国动物血源丰富，牛血、猪血的价格较低，生产ＳＯＤ工艺简单。
所以，用牛血、猪血来提取ＳＯＤ具有较大的发展前途。
现介绍用牛血、猪血来提取ＳＯＤ的方法。
1、工艺流程2、技术操作要点（1）分离：新鲜动物血(牛血或猪血)收集后，用纱布滤出血液，以除去血液中的杂毛及其它异物，然后加入柠檬酸钠(一般10ｋｇ血液中加380ｍｇ柠檬酸钠)，充分搅拌均匀后以3000转/分的速度(以下如同)离心15～20分钟，收集血球，血浆可用于凝血酶的提取。
（2）去除血红蛋白：用0.9%氯化钠溶液离心洗涤已收集的血球三次，每次氯化钠溶液用量为血球体积的2倍为宜。
往已离心洗涤的血球中加入等体积的去离子水(或蒸馏水)，在温度2℃左右的条件下剧烈搅拌30～40分钟，并在同温下放置24小时左右。
因为牛血ＳＯＤ对热较稳定，但猪血ＳＯＤ对热敏感，所以在分离或提取整个过程中温度控制在0～4℃，时间不要超过3天。
若因其它原因，不能及时处理时，可以冷冻保存溶血溶液，并不影响其ＳＯＤ的活力。
（3）萃取：往溶血溶液中分别缓慢加入溶血的血球0.25～0.3倍体积的95%冷乙醇和0.15～0.2倍体积的冷氯仿，充分搅拌30分钟，静置30分钟，然后进行离心分离，收集上清液。
此时应注意有机溶剂的适当比例，才能有效地分离去除蛋白质等杂质，同时必须控制温度在2℃左右(不要超过5℃)，才能达到最佳分离效果。
（4）沉淀：向上述上清液中加入1～2倍体积的冷丙酮，充分搅拌均匀，此时可产生大量白色沉淀，静置30分钟，然后进行离心分离，收集沉淀物。
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术摘要通过对绿豆种子的研磨破碎获得SOD粗酶，经过硫酸铵分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶液中的杂质及干扰蛋白，采用葡聚糖（Sephadex G-100）凝胶层析得到纯化的SOD酶。
跟踪提纯过程活性的分布，并评价提取过程各步骤的效率。
实验结果证实随着不断的分离提纯，总活力不断减小，比活力不断上升，总纯化倍数为1.87，活性得率为0.3768%。
一、前言超氧化物歧化酶(superoxide dsdismutase，SOD)是需氧化物中以超氧阴离子为底物的一种酶，广泛存在于各种生物中。
SOD不仅在生物体内对抗氧化、解毒起重要作用，也有延缓机体衰老、抗肿瘤及抗免疫性疾病等功能，因而受到极大关注。
SOD属于金属酶，其理化性质不仅取决于蛋白质部分，而且还取决于结合到活性部位的金属离子。
按照结合的不同金属离子，生物体中SOD有Cu、Zn-SOD、Mn-SOD和Fe—sOD三种，但近几年发现低等生物中尚存在含Ni的SOD。
在已发现的酶中，超氧化物歧化酶(SOD)是需氧生物和耐氧生物的体内清除超氧化物自由基的酶超氧自由基在体内的过多积累将可能引发脂质过氧化损伤DNA，使脱水酶失活，使线粒体中的NADH脱氢酶NADH氧化酶磷酸腺苻酶(ATPase)失活，从而易引起生物体发疾病或衰老。
自从1968年McCord与Fridovich发现SOD及其催化超氧化物自由基歧化为O2与H2O以来，SOD一直以來被认为是生物体内最重要的抗氧化酶。
根据近10年的研究报告表明，SOD具有清除超氧化物自由基，防止其对机体直接或间接的损伤；使O2成为细胞内自由基的排污漕；调节机体内O 的水平；调节机体内NO水和催化反应产物H2O2等作用。
现在在日常生产应用中，多以动物血液中提取SOD。
但是动物血液中的疾病很多，价格也比较昂贵。
从植物中提取SOD就可以相应的解决上述问题，类似绿豆芽这种植物，其成本低廉，且SOD 的含量丰富，又无污染，将其大量应用于生产有着很好的发展前景。
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化实验报告
超氧化物歧化酶SOD的分离纯化技术证明SOD提取过程工艺不同浓度的硫酸铵对纯化SOD蛋白酶的效果的综合影响一、摘要：通过对绿豆的研磨破碎获得SOD粗酶，经过(NH4)2SO4分级分离、透析除盐和浓缩等过程，除去粗酶中的杂质及干扰蛋白。
二、关键词：SOD 连苯三酚自氧化法SOD酶活性测量透析除盐三、前言：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，是一种新型酶制剂，属金属酶.它是一种源于生命体的活性物质，SOD是机体内危害最大的氧自由基专一清除剂，亦是其他自由基最有效的清除剂，它与体内的谷胱甘肽过氧酶、过氧化氢酶联手，把自由基转化为水和氧分子。
能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。
对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。
本实验以绿豆为原料提取SOD，通过各步的分离提纯，应测得酶总活力逐渐减小，比活逐渐升高.通过本实验掌握物质分离纯化的实验设计过程，以及硫酸铵分离、透析除盐、浓缩和葡聚糖凝胶层析等物质分离技术。
四、实验技术路线：我们的这次试验主要的路线是通过测定经过不同浓度的硫酸铵分离出来的不同的SOD蛋白的上清和沉淀，以此来确定硫酸铵沉淀SOD酶和其他杂蛋白的一个大致区间。
经过40%的硫酸铵和50%的硫酸铵作用过后的提取液，得到40%的上清和沉淀，50%的上清和沉淀。
然后分别测定这4份样品的SOD酶活力，来推理出硫酸铵沉淀区间。
五、材料和试剂：绿豆（实验使用前需先用蒸馏水浸泡20h）；连苯三酚（使用时需先稀释5倍）；硫酸铵（粉末）；Tris-HCL缓冲液；蒸馏水。
六、仪器：匀浆机；低温离心机；分光光度计；移液枪；500ml量筒；纱布；烧杯和试管若干。
七、实验步骤：1、取30g绿豆，并加入300ml蒸馏水，用匀浆机匀浆。
2、匀浆出来的豆液用二层纱布过滤，离心（5℃，3000rpm / 8min）取上清液，取1ml上清液测量其总活性（用连苯三酚自氧化测SOD活性法），其余量取150ml分装成两支各75ml。
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定
动物血中超氧化物歧化酶的提取和活性测定原理超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。
离子(02-)是人体氧代谢产物，它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰老等疾病，超氧阴离子与生物体内许多疾病的发生和形成有关。
由于SOD能专一消除超氧阴离子(O2 -)而起到保护细胞的作用，SOD作为一种药用酶，具有广阔的应用前景，并引起了国内外医药界、生物界和食品界的极大关注。
按金属辅基成分的不同可分成3种类型。
最常见的一种含有铜锌金属辅基(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中，在高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙也有存在，CuZn-S0D 酶蛋白的分子量约为3.2×104，纯品呈蓝绿色，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体。
每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。
第二种含有锰离子(Mn-SOD)，主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。
第三种是Fe-S0D，过去一直认为只存在于原核细胞中，近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。
Fe-SOD纯品呈黄色或黄褐色，由2条肽链组成，多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe原子。
l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。
自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。
迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。
藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。
为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。
月桂酰氯修饰羊血超氧化物歧化酶工艺优化及酶学性质
月桂酰氯修饰羊血超氧化物歧化酶工艺优化及酶学性质杨学山;王本启;王正娟;杨佐青;李远玲;康延良【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2014(035)007【摘要】以羊血为材料获得超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶液,采用月桂酰氯修饰SOD,在修饰温度、修饰时间、月桂酰氯添加量和丙酮添加量的单因素试验基础上,通过正交试验优化工艺参数,并比较修饰酶与天然酶的酶学性质.结果表明:10mL酶比活力为4 348.6 U/mg的SOD样液在修饰温度60℃、修饰时间30 min、月桂酰氯用量0.1mL、丙酮添加量为酶液体积的1.5倍条件下充分反应,所得修饰酶活力最强;修饰酶热稳定性、pH值耐受性、半衰期等均优于天然酶.月桂酰氯可用于修饰性能较优的羊血超氧化物歧化酶.【总页数】4页(P128-131)【作者】杨学山;王本启;王正娟;杨佐青;李远玲;康延良【作者单位】甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】TS251.9【相关文献】1.壳聚糖固定化羊血超氧化物歧化酶工艺条件优化及酶学性质比较研究 [J], 付文力;杨学山;杨孝朴;祝霞;韩舜愈;杜娜;李蔚蔚;白钰2.月桂酸修饰超氧化物歧化酶的制备及其性质研究 [J], 阎家麒3.月桂酸修饰的超氧化物歧化酶保护红细胞抗氧化溶血作用的实验… [J], 孙淑芬;莫简4.氰尿酰氯活化肝素修饰超氧化物歧化酶的研究 [J], 王烜;王凤山;藤莉5.丙酰氯氯化制2-氯代丙酰氯的反应工艺优化 [J], 孔令启;郭德来;郑世清;李玉刚;曹传波因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
动物血中超氧化物歧化酶的提纯及应用
Ｖｏ ． ８ Ｎｏ ４ １３ ．
河 南 科 技 学 院 学 报
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ｎ ｎ Ｉ ｓｉ ｔ ｆＳ ｉｎ ｅ ａ ｄ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ｒ ａ ｆＨｅ ａ ｎ ｔｔ ｅ ｏ ｃｅ ｃ ｎ Ｔ ｃ ｎ ｌｇ ｕ
２１ ０ ０年 １ ２月
受到国内外学者的广泛关注， 田春美等人【 Ｓ Ｄ的种类分布 、 ３ Ｏ 】 对 催化 、 抗氧化机理 、 结构性质 、 生产方式 、 模拟研究及应用等方面做了大量研究， 目前在食品 、 化妆品、 临床上有广泛应用， 特别近年来， Ｄ作为 日 Ｓ Ｏ 用 化工产 品 和保健食 品行业 的重 要添 加剂成 为人 们 的研究热 点． Ｓ Ｄ的制备方法因原料不同而异， Ｏ 目前制备 Ｓ Ｄ的原料有动物血液 、 Ｏ 微生物和动植物组织． 纵观大 量文献发现， 从植物组织 中提取 Ｓ Ｄ的工艺已经成熟且广泛应用， Ｏ 如从大蒜 、 芦荟 、 唇形科芳香植物等中
Ｋ ｅ ｒ ｓｓ ｐ ｍｘｄ ｉ ｕａ ｅ ｘ ａ ｔ ｎａ ｄｐ ｒ ｃｔ ｎａ ｐｉａ ｏ ｙ ｗ０ ｄ ：ｕ ｅ ｉｅｄｓ ｔ ， ｔ ｃ ｏ ｎ ｕｉ ａ ｏ ， ｌ ｔ ｎ ｍ ｓｅｒ ｉ ｉ ｆ ｉ ｐ ｃｉ
１３ 年 Ｍ ｎ 和 Ｋ ｉ ｔ 次从牛红细胞 中分离出蓝色含铜蛋白质， ６ 年 Ｍ ｃｒ 和 Ｆｉ ｖ ｈ 发 ９９ ａｎ ｅ ｉ’ ｌ 】 ｎ首 １ ９ ９ ｃｏ ｄ ｒ ｏｉ ｍ ｄ ｃ
ｍｉｒ ｏ ｇ ｎ ｓ ．ＯＤ ａ ｉ ｏ ａ ｔ ｐ ｙ ｉｌｇ ｃ ｌ ｆ ｎ ｔ ｎｆ ｒ ｘ ｍｐ ｅ ｏ ｎ ａ ｃ ｈ ｃ ｔｌｔ ｄ ｓ ｍｐ ｒ ｏ ａｉ ｎ ｃ ｏ ｒ ａ ｉｍｓ Ｓ ｈ ｓ ｍｐ ｒ ｎ ｈ ｓｏｏ ｉａ ｕ ｃｉ ， ｅ ａ ｌ， ｅ ｈ ｎ ｅ ｔ ｅ ａａ ｙｉ ｉｐ ０ ｔ ｎ ｔ ｔ ｏ ｏ ｔ ｃ ｉ ｏ ｒ ａ ｔ ｎ ｏ ｈ ｌ ａ ｏ ｙ ｅ ｎ ｉ ，ｎ ｏ ｅｆｃ ｉｅｙ ｒ ｍｏ ｅ ｓ ｐ ｒｘ ｄ ｒ ｅ ｒ ｄ ｃ ｌ ｉ ｒ ａ ｉｍ． ｈ ｓ ｐ ｐ ｒｈ ｅ ｃ ｉ ｆ ｔｅ ｕｔ ｘ ｇ ｎ ａ ｏ ｎａ ｄ ｔ ｆ ｔ ｌ ｅ ｖ ｕ ｅｏ ｉ ｅ ｆｅ ａ ｉａ ｎ ｏ ｇ ｎ ｓ Ｉ ｔ ｉ ａ ｅ， ｅ ｏ ｒ ｅ ｖ ｎ ｔ
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羊血超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及化学修饰研究
作者：高巍
学位授予单位：内蒙古农业大学
1.Tang Yun-ming.Tang Liang-ting.Xu Rong-min Purification and Some Properties of Superozide Dismutase from Aloe saponaria (Ait) Haw.[会议论文]-2009
2.ZHU Yanbing.LI Hebin.ZHANG Xuqin.ZHANG Chunyan.XIANG Jionghua.LIU Guangming Characterization of a thermostable manganese-containing superoxide dismutase from inshore hot spring thermophile Thermus sp.JM1[期刊论文]-海洋学报（英文版）2011,30(6)
3.徐榕敏.易燚波.阙瑞琦.岑亮.孙焕顷.唐云明.XU Rong-min.YI Yi-bo.QUE Rui-qi.CEN Liang.SUN Huan-qing. TANG Yun-ming芦荟超氧化物歧化酶的纯化与部分性质[期刊论文]-西南师范大学学报(自然科学版)2007,32(3)
4.刘剑利.孟鑫.陈红漫.Liu Jianli.Meng Xin.Chen Hongman两种纯化玉米超氧化物歧化酶方法的比较[期刊论文]-中国粮油学报2006,21(2)
5.TENG Li-rong.WANG Ya-jun.WU Min.HONG Shui-sheng.CHEN Jia.MENG Qing-fan.LIU Lan-ying Purification and Properties of Superoxide Dismutase(SOD) in Allium Sativum[期刊论文]-高等学校化学研究(英文版) 2003,19(4)
6.许平.XU Ping芦荟超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化研究[期刊论文]-重庆工商大学学报（自然科学版）2007,24(1)
7.张兰杰.候冬岩.辛广.袁勤生.ZHANG Lan-jie.HOU Dong-yan.XIN Guang.YUAN Qin-sheng鹿血红细胞Cu,Zn-SOD的纯化及部分性质研究[期刊论文]-特产研究2005,27(1)
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