01 实验一 总糖和还原糖的测定(3,5-二硝基水杨酸法)(4)
总糖和还原糖的测定
三、实验器材
1、材料：山芋粉 2、仪器：电子分析天平、水浴锅、V-1100 可见分光光度计、移液器 3、其他：试管、容量瓶、三角烧瓶、量筒、 吸管（移液管）、洗耳球、玻棒、洗瓶、 漏斗、离心管、六凹反应盘、pH试纸（1 ～14）
四、实验试剂
1、标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml） 2、DNS试剂 3、6mol/L HCl 4、6mol/L NaOH 5、I2-KI溶液
六、计算
C1V1 ω(还原糖)=——×100% m1
C2V2
ω(总糖)=——×0.9×100% m2
附：相关仪器使用 1、移液管的使用
2、移液器的使用
3、离心机的使用 注意配平，对称放 4、V-1100可见分光光度计的使用 比色皿
V-1100可见分光光度计
开机预热30min 测吸光度 选择波长（540nm） MODE键切换到T，将黑体放入光路中
2、样品中总糖的水解、提取
准确称取0.2g山芋粉置于100ml三角烧瓶中
加3ml蒸馏水，调成糊状
取1～2滴于六凹 反应盘中，加1滴 I2-KI溶液，如果 完全不显蓝色， 即可进行下面的 操作。
再加12ml蒸馏水，5ml 6mol/L HCl
沸水浴，30min (不时搅拌) 冷却至室温 用6mol/L NaOH调pH7.0（ pH试纸） 蒸馏水定容至100ml,混匀
合上盖，0键校零MODE键切换到A，参比 Nhomakorabea放入到光路中
合上盖，100键调零
将待测液依次放入到光路中，即可得出 待测液的吸光度。
比色皿的使用
管号
试剂
标准葡萄糖溶液 /ml
0
1
2
3
4
5
6
7
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定
3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。
本文将介绍该方法的操作步骤、原理及注意事项。
一、操作步骤1. 样品制备：精确称取适量糖样品，加入足量去离子水稀释至1 mL，摇匀。
2. 试剂制备：(1) Na2CO3试液：称取0.5 g Na2CO3加入50 mL去离子水中，溶解并稀释至1 L。
(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)重量浓度为1 g/L的甲醛溶液：按比例称取适量DNS和甲醛，在去离子水中稀释制成重量浓度为1 g/L的甲醛溶液。
3. 测定步骤：(1) 取3个试管，编号为A、B、C，并进行空白对照。
将A、B、C试管分别加入0.1 mL 样品，每个试管中加入相同量的0.9 mL去离子水。
在空白试管中加入相同量的去离子水代替样品。
(2) 在A试管中加入0.5 mL Na2CO3试液，摇匀。
(3) 将B试管浸于沸水中加热3-5分钟，使其中的还原糖完全还原。
(4) 在A、B两样品试管中加入0.5 mL甲醛溶液，摇匀并置于60℃水浴上加热10分钟。
(6) 加入1.5 mL水后，在空白对照试管和样品试管中均加入0.5 mL DNS溶液，摇匀。
(7) 在95℃水浴加热10分钟，并立即冷却至室温。
(8) 测量吸光度值，通过标准曲线计算样品中还原糖或总糖含量。
二、原理还原糖或总糖与Na2CO3在典型的碱性条件下发生醛基反应，把碳水化合物中的亲电基转化为醛基，再将其还原为对应的醇，生成糖醇和尿素等。
然后，在碱性条件下，醛基与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，发生环化，生成糖醛酸化合物，这些化合物在pH9.0以下表现为桥形分子，具有紫色的吸收峰。
在高温条件下，DNS与糖醛酸化合物相结合，形成柿子色化合物，进一步增加吸收光的强度。
还原糖或总糖的含量可以通过比较样品的吸光度值和标准曲线来测定。
三、注意事项1. 避免试管附着并确保试管内部表面干净。
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量
3,5-二硝基水杨酸法测定山楂片中还原糖和总糖含量3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法，其原理基于还原糖在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物，而总糖则在强硫酸存在下加热分解，生成由葡萄糖和六碳糖等组成的还原糖，在酸性条件下与3,5-二硝基水杨酸反应生成红色化合物。
具体操作步骤如下：1. 取一定质量的山楂片粉末，加入适量的蒸馏水，加热水浴至沸腾，过滤，将过滤液冷却至室温。
2. 取0.2 ml 过滤液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
3. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，还原糖含量的计算公式为：还原糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
4. 取剩余过滤液，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，浸于沸水中煮2小时，浸于水中冷却，并用蒸馏水将瓶口水洗入容量瓶，摇匀。
5. 取0.1ml 还原糖水样稀释液加入容量瓶，加入相当于5倍于样品初始体积的浓硫酸，摇匀后加入适量的蒸馏水到刻度线，摇匀后离心。
6. 取0.1 ml 离心上清液，加入2 ml 3,5-二硝基水杨酸溶液，摇匀后在60摄氏度恒温水浴中反应10分钟，然后放冷。
7. 吸收液的吸光度在515 nm处测定，总糖含量的计算公式为：总糖含量（%)= (As–A0)/(有效光程×C×0.88)×100，其中As为样品吸光度，A0为空白试剂吸光度，有效光程为1 cm，C为样品初始体积，0.88为还原糖的摩尔吸光系数。
总之，3,5-二硝基水杨酸法是一种稳定可靠的方法，能够准确测定山楂片中的还原糖和总糖含量，为山楂片的质量控制提供了重要的参考。
实验一 总糖和还原糖的测定
实验一总糖和还原糖的测定（3，5-二硝基水杨酸法）171850044钱诗晨一、实验目的掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。
二、实验原理单糖和某些寡糖含有游离的醛基或酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖和蔗糖等属于非还原性糖。
利用多糖能被酸水解为单糖的性质可以通过测定水解后的单糖含量对总糖进行测定。
还原糖在碱性条件下被氧化成糖酸及其他产物，3，5-二硝基水杨酸（DNS）则被还原为红棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在540nm处一定浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量和总糖的含量。
三、实验器材1.面粉2.试管3.吸管4.水浴锅5.电炉6.紫外可见分光光度计7.PH试纸8.容量瓶9.量筒、研体、三角烧瓶、玻璃漏斗10.电子分析天平面粉里含多糖淀粉，遇碘变蓝四、实验试剂1.标准葡萄糖溶液（1.0mg/ml）：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，溶于蒸馏水并定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2.3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂:将6.3gDNS和262ml2mol/L NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸甲钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml贮于棕色瓶中备用。
3.6mol/L HCl:取250ml浓HCl(35%~38%),用蒸馏水稀释到500ml。
4.6mol/L NaOH：称取24g NaOH溶于蒸馏水并稀释至100ml。
5.碘—碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。
五、实验操作1.葡萄糖标准溶液曲线的制作取干净试管6支，按表7进行操作。
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/ml）为横坐标作图得标准曲线2.样品中还原糖的提取和测定准确称取1.0g红薯粉，加蒸馏水约10ml，在研体中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研体2~3次，洗出液也转入三角烧瓶中。
还原糖和总糖含量的测定(3,5 一二硝基水杨酸比色法)
还原糖和总糖含量的测定（3，5 一二硝基水杨酸比色法）还原糖和总糖含量的测定（3 ，5 一二硝基水杨酸比色法）作者：佚名文章来源：生物化学实验技术点击数：2132 更新时间：2021-5-13 11:29:24一、目的植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。
它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。
还原糖还能形成其他物质如有机酸等。
此外，水果蔬菜中糖量的多少，也是坚定其品质的重要指标。
还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉蔗糖等，经水解也生成还原糖。
通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，练习比色定糖法的基本操作，热悉分光光度计的使用方法。
二、原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用溶解度不同，可以植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。
在碱性条件下，还原糖与 3 ， 5 一二硝基水杨酸共热， 3 ， 5 一二硝基水杨酸被还原为 3-氨基 -5- 硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。
一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系， 540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。
三、仪器、试剂和材料1 .仪器（ 1 ）刻度试管： 25 ml X 11（ 2 ）离心管或玻璃漏斗 X2（ 3 ）烧杯： 1OOml X 1（ 4 ）三角瓶： 100m1 X 1（ 5 ）容量瓶： 100ml X 3（ 6 ）刻度吸管： 1 ml X 1 ， 2m1 X 4, 10ml X 1（ 7 ）恒温水浴（ 8 ）沸水浴（ 9 ）离心机（过滤法不用此设备）（ 10 ）电子顶载天平（ 11 ）分光光度计2 .试剂（ 1 ） 1 mg/ ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在8 0 ℃ 烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容量瓶中，以馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
生 化 实 验
(3) 0.10mo1/L醋酸溶液100mL
(4) 0.01mo1/L醋酸溶液50mL
（5）0.5%酪蛋白溶液（以0.01M NaOH作溶剂）100ml
（6）0.01%溴甲酚绿指示剂
（7）0.02mo1/L氢氧化钠溶液100ml
（8）0.02mo1/L盐酸溶液100ml
1.00N醋酸溶液（ml）2.4————
0.1N醋酸溶液（ml）—4.01.0——
0.01N醋酸溶液（ml）———2.50.62
酪蛋白醋酸钠溶液（ml）1.01.01.01.01.0
溶液的最终pH3.24.14.75.35.9
沉淀出现的情况
（2）静置约20分钟，观察每支试管内溶液的混浊度，以“—、＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋”符号表示沉淀的多少。根据观察结果，指出哪一个是酪蛋白的等电点。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2。
NH2和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所
形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成
有色物质。此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸
在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
(13) 2％氯化钡溶液150mL
四、实验操作
1、蛋白质的盐析
中性无机盐(硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等)的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
4、有机溶剂沉淀蛋白质
取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL 95％乙醇，混匀，观察沉淀的生成。
实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定
实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。
二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。
利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。
2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。
（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。
总糖和还原糖的测定─3,5-二硝基水杨酸法思考题
总糖和还原糖的测定─3,5-二硝基水杨酸法思考题
1.为什么3,5-二硝基水杨酸法能够测定总糖和还原糖？
答：3,5-二硝基水杨酸法是一种常用的测定还原糖和总糖的方法，其
原理是将还原糖还原成相应的葡萄糖，在酸性条件下，葡萄糖与3,5-二
硝基水杨酸反应生成黄色化合物，通过比色法测定吸光度，即可计算出样
品中还原糖的含量。
同时，总糖中还包括非还原糖，这些非还原糖无法被3,5-二硝基水杨酸还原成葡萄糖，因此测得的是总糖含量，再用还原糖含
量去减即可计算出非还原糖含量。
2.3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖会受到哪些因素的影响？
答：3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖会受到以下因素的影响：
（1）反应时间：反应时间过短会导致还原糖没有充分被还原为葡萄糖，反应时间过长则会使吸光度值趋于平台，使测定结果不准确。
（2）反应温度：反应温度过高则会使试剂发生非特异性反应，导致
误差增大；反应温度过低则会使反应速率降低，反应不充分，测定结果不
准确。
（3）试剂的浓度：试剂浓度过高或过低均会影响反应结果的准确性，因此应当根据样品的含量调整试剂浓度。
（4）样品颜色：样品的颜色会影响吸光度的测定结果，因此应将样
品与试剂充分混合并进行比色。
（5）其他因素：例如样品中存在着色物质、杂质等都会影响到反应
的准确性。
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原 理
还原糖在碱性条件下加热被氧化 成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸 则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨 酸。在过量的NaOH碱性溶液中此化合 物在540nm处有最大吸收，在一定的 浓度范围内还原糖的量与光吸收值呈线 性关系，利用比色法可测定样品中还原 糖的含量。
原
理
黄色
棕红色
实 验 器 材
实验内容（60学时） （生技、应技、生科、信息 ）
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7. 8.
还原糖的测定（4） 蛋白质N端分析（4） 酶的底物专一性（4） 植物DNA的提取（4） DNA的酶切和电泳（4）（操作考试） 酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12） 亲和层析分离纯化蛋白质（14） Western Blot鉴定目的蛋白（14）
1、标准葡萄糖溶液（2.0mg/mL）：准确称取干燥恒
重的葡萄糖200mg，溶于蒸馏水并定容至100mL，混匀，
4℃冰箱中保存备用。 2、3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：将6.3g DNS和 262mL 2mol/L NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸 钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌 溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，存储于棕色瓶中 备用。
操
管号 试剂
作
1 0.1 0.9 2.0 7.0 0.2 2 0.2 0.8 2.0 7.0 0.4 3 0.3 0.7 2.0 7.0 0..6 4 0.4 0.6 2.0 7.0 0.8 5 0.5 0.5 2.0 7.0 1.0
1、葡萄糖标准曲线的制作： 取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度作为
1、红薯。
2、试管1.5cm × 15cm(×10)、试管1.8cm × 18cm(×2)
3、吸管 1mL(×2)、10mL(×2) 4、水浴锅。 5、电炉。 6、722型分光光度计
7、pH试纸（1~14）
8、容量瓶100mL(× 3)。 9、量筒、研钵、三角烧瓶、玻璃漏斗。 10、电子天平
实 验 试 剂
计
C1V1 m
算
按照下列公式分别计算红薯中还原糖的百分含量：
ω=
X Байду номын сангаас00%
式中， C1： 还原糖的质量浓度（mg/mL） V1： 样品中还原糖提取液的体积（mL） m： 样品的质量（mg）
操
2、样品中还原糖提取：
作
准确称取0.5g红薯，加蒸馏水约2mL，在研钵中磨 成匀浆，转入三角烧瓶中，并用15mL的蒸馏水冲洗研 钵，洗出液也转入三角烧瓶中。
将三角烧瓶于50℃水浴中保温0.5h，不时搅拌， 使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心 管中，于4000r/min下离心5min，沉淀用20mL蒸馏水洗 一次，再离心，将两次离心的上清液合并，用蒸馏水定 容至100mL，混匀，作为还原糖待测液。取1mL进行还 原糖的测定。
特别注意
若发生仪器故障其它事故，应立即切断
相关电源，及时报告老师 违反操作规程造成事故、仪器损坏，将 按学校有关规定赔偿
实验一
还原糖的测定
（3,5-二硝基水杨酸法）
目
•掌握还原糖的测定原理
的
•学习还原糖的3,5-二硝基水杨酸(DNS)测定法。
原
理
单糖和某些寡糖含有游离的醛基或 酮基，有还原性，属于还原糖；而多糖 和蔗糖等属于非还原性糖。
实验要求
按时上课，不得缺席 预习实验内容
认真观察实验现象，如实记录实验数据
独立分析实验结果，按时完成实验报告
实验室守则
保持室内安静、整洁 严格按操作规程使用仪器设备，节约试
剂和实验材料 实验过程中注意水、电、门窗安全 实验完毕后，将仪器、器皿放归原处 做好实验室卫生
生物化学实验 （生物工程、张之洞班）
生物化学技术 （生技、应技、生科、信息 ）
实验内容（40学时） （生物工程、张之洞班）
1. 2. 3.
4.
5. 6. 7.
还原糖的测定（4） 蛋白质N端分析（4） 酶的底物专一性（4） 植物DNA的提取（4） DNA的酶切和电泳（4）（操作考试） 酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12） SDS-PAGE测定蛋白质分子量（8）
离心机使用时一定要等重配平
（离心管+盖子+内容物）= （离心管+盖子+内容物） 精确到小数点后2位
操
空白
作
还原糖溶液
4、样品中还原糖的测定：
待测溶液/mL
蒸馏水/mL DNS试剂/mL
0
1.0 2.0
1.0
0 2.0
1.0
0 2.0
沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温 蒸馏水/mL 葡萄糖浓度/mg/mL A540nm 7.0 7.0 7.0
纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）作为横坐标，作图得标准曲线。
0 0 1.0 2.0 7.0 0
标准葡萄糖溶液/mL 蒸馏水/mL DNS试剂/mL
沸水浴中准确煮沸5min，取出，用自来水冷却至室温
蒸馏水/mL 葡萄糖浓度/mg/mL
A540nm
用EXCEL作图、求R2和公式
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2 0 0.5 1 1.5 系列1 线性 (系列1) y = 1.3727x - 0.0192 R2 = 0.9987