环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间_剂量_效应观察
小鼠骨髓细胞微核试验
五、作业
1. 观察并记数细胞微核率； 2. 用统计学软件SPSS统计结果。
ห้องสมุดไป่ตู้
小鼠骨髓细胞微核试验
一、实验目的
1． 观察诱变物质产生的微核； 2． 了解微核测定的方法与意义，计算微核 率。
二、实验原理
微核（Micronuclei）是真核类生物细胞中的一种异常结构， 往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间 期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主 核1/3 以下。 已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈 正相关，这一点和染色体畸变一样。所以，可用间期的微 核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。 目前国内外不少部门已经把微核测试用于辐射损伤，辐射 防护，化学诱变剂，新药实验，染色体遗传疾病及癌症前 期诊断等各方面。
三、实验材料
小鼠骨髓
四、实验步骤
1. 实验前6小时用对苯二酚80mg/kg注射于小鼠腹腔内， 处死动物，用0.85%的生理盐水吹出股骨骨髓，离心1000 转/分5分钟，除上清液，滴入少量小牛血清混匀后涂片。 2. 固定：放入甲醇和冰醋酸固定液中固定5-10分钟； 3. 染色：直接在Gimsa染液中染色10分钟，然后冲洗； 用滤纸擦干载片背面的水分，再用滤纸轻轻吸干载片上面 的水分，取出盖上盖片； 4. 观察：嗜多染红细胞呈灰兰色，成熟红细胞呈桔红色， 每只动物计数1000-2000个嗜多染红细胞，微核率为千分 之2.58+0.41。
小鼠腹腔注射阿霉素诱导骨髓细胞微核率的最佳时间—剂量效应分析
Ｌｓ Ｄ０ 值为 ２ ．４ ｇｋ ， ５ 的可信 限为 ２．４ — ４９ １ｍ ／ ｇ ９ ％ １２ １
２ ． ７ ／ ｇ ９ ２ １ｍｇｋ 。而 在 本 实 验 中 ，笔 者 用 １ ％ Ｌ 、 ０ Ｄ
染 色体损 伤 方便 、快 速 的方 法 ，是 遗 传毒 理 实 验 常 用 的细胞 遗传 学 方 法 之 一 Ｊ 。所 以 目前 许 多 国家 （ 区 ） 和 国 际组 织 都 将 其 视 为评 价新 药 、食 品 添 地
第２ ３卷
第 ２期
文 山学 院学 报
Ｊ ＵＲＮ Ｆ Ｗ Ｅ ＨＡＮ Ｕ Ｖ Ｓ Ｔ Ｏ ＡＬ ０ ＮＳ ＮＩ ＥＲ Ｉ Ｙ
Ｖｏ． ３ Ｎｏ ２ １２ ．
２１ ０ ０年 ６月
Ｊｎ ２ １ ｕ．００
小 鼠 腹 腔 注 射 阿霉 素 诱 导 骨 髓 细 胞 微 核 率 的 最 佳 时 间一 剂 量 效 应 分 析
染 色单体 行 动滞 后 ，不 能进 人 子 细胞 的主 核 ，而 形
成 了一组 微核 ，这 样 形 成 的微 核 体 积 往 往略 大 于 一 般 典型 的微核 。 由于微 核 的产 生与染 色 体和 Ｄ Ａ损 Ｎ
伤 有较大 关 系 ，故 常将微 核 的检 出率作 为 Ｄ Ａ损 伤 Ｎ
中最重要的因素是用药剂量和采样 观察 时间等¨ 引，
因此 ，笔 者设计 了本试 验 来 检 测 阿霉 素 诱 发 产生 微 核 的最佳 时 间和剂量 。在 笔者 － 面 的实验 中 ，得 】 纠前 到 了阿 霉 素腹 腔 注 射 昆 明 种 小 白 鼠 的 半 致 死 剂 量
的一种 指标 … 。微 核实 验 创建 于 ２ ０世 纪 ７ ０年 代 中
五味子粗多糖拮抗环磷酰胺诱导小鼠微核的实验研究
作者简 介： 王艳杰 （９３ ， ， １ 一）女 讲师 ， ７ 现为黑龙 江 中医药 大学 ２Ｏ 级 ０４
中药学专业博士研究生 ， 研究方 向： 中药抗肿瘤机理研究。
收稿 日期：０６ ５—１ ２０ —０ ４
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中医药信息 ２０ 年第 ２ ０６ ３卷第 ５期 表 １ 五 昧子 多糖 对 Ｃ 诱导小 鼠骨髓嗜 多染红细胞微核的影响 Ｐ
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Ｉ Ｃ ． ｅ ． Ｏ ６， Ｔ Ｍ Ｓ ｐ ２ Ｏ Ｖｄ． ３， ２ ＮＯ． ５
五味子粗 多糖拮抗环磷酰胺诱 导
小 鼠微 核 的实验研 究 ＊
王艳杰 ， 勃岩 ， 吴 梁颖
（ 黑龙江中医药大学 ， 哈尔滨 黑龙江 １ ００ ５ ４） ０
１ 实验 材料 １ １ 实验动 物 ．
昆明种小 鼠由黑龙江 中医药大 学动物饲 养室提
供。 １２ 药品与仪器 ． 五味子 由本院门诊部药材部购买 。五味子多糖 的
提取 ： 取干燥成熟的五味子果实 ， 碾碎 ， 沸水浸泡 ， 用水 连续提取 ， 浓缩 ， 乙醇沉淀多次 ， 除蛋 白、 除氨基酸、 干 燥制得 。环磷酰胺 ， 由上海华联制药公司生产。秋水 仙素 、 一Ｂ Ｕ Ｓ Ｍ ５ ｒ ，Ｉ Ａ公司生产 。Ｋ Ｌ 甲醇、 ｄ Ｇ Ｃ、 冰醋酸 均为分析纯。尼康显微镜。 ２ 实验 方 法 ２１ 五味子粗多糖的提取 ． 参照杨婷婷［方法并修改。五味子果实 ， ］ 干燥 ， 碾 碎， 用沸水浸泡过夜 ， 微沸 ｌ ， ４ ｈ用 层纱布过滤 ， 次所 ３
基金项 目： ＊黑龙江中医药 大学基金项 目（０４８ ２０ １）
得 的滤液混合后 ， 浓缩 ， 抽滤。用 ５ 倍的无水乙醇醇沉 ２ ｈ反复抽滤 ４次 ， ４， 滤液用正丁 醇和氯仿去蛋 白质等 杂质 ， 并进行氨基酸和蛋白质 的检测 ， 无氨基酸或蛋 白 质后 ， 进行干燥处理（ｏｃ ， ６ｏ）制成颗粒或粉末。根据实 验 的需 要 ， 用蒸馏 水 配成 不 同的剂量 。 再 ２２ 小 鼠骨髓 嗜多染 红细胞 （Ｃ ） ． Ｐ Ｅ 微核 试验 选 取 ２ ２ｇ昆 明种小 鼠 ５ ０ ２ ０只 ， 雄 各 半 ， 机 雌 随 分为 ５ ， 组 每组 １ 只 。阴性对照组（ ０ 生理盐水 ） 阳性 、 对照组（ 环磷酰胺 ， ｍ ／ｇ和 ３ ４ ｇｋ） 个五味子多糖剂量组 ０ （０ ｇｋ、０ ｇｋ 、０ ｇｋ ） 阴性 对 照 组 和 剂 量 组 ４ｍ ／ｇ ２ｍ ／ｇ １ｍ ／ ｇ 。 第 １ ８ 分别腹腔注射生理盐水、 ｄ 五味子多糖。阳性 对照组第 ｌ ６ 腹腔注射生理盐水 ， ｄ 于第 ７８ 腹腔注 、ｄ 射环磷酰胺 ， 于第 ８ 注射环磷酰胺 ６ 后 ， ｄ ｈ 颈椎脱臼法 处死试验动物。取其双侧股骨 ， ７ ％乙醇浸泡的纱 用 ５ 布剔除肌肉， 剪断肌骨 ， 以生理盐水 冲洗骨髓细胞 ， 常 规制片、 每只小鼠涂 ３ 张片子 ， 并编号 ， 自然凉干 ， 甲醇 固定 ，：Ｇｅ ｓ染 色、 １９ ｉ ａ ｍ 油镜观察。每 只动物计数 １０ ００ 个 嗜多染红细胞 ， 并记录出现微核细胞数 ， 采用双侧 ｔ 检测进行两样本均数 比较 ， 计算抑制率 。 抑制率 ＝［阳性组出现数 一 （ 试验组出现数） 阳性 ／ 组 出现数 ］ ０％ 。 Ｘ１０ ３ 结 果 ３ １ 五味子粗多糖的提取 ． 采用上述方法提取的五味子多糖呈现深褐色颗粒 或淡褐色粉末 。每 ｌ 五味子可获得 １ｍ 的五味子粗 ｇ ８ｇ 多糖。 ３２ 五昧子粗多糖的微核试验的结果 ． 五味子多糖各剂量组对 ｃ 诱 导的小 鼠骨髓 Ｐ Ｅ Ｐ Ｃ 微核率均有抑制作用。与阳性对照组 比较， 差异非常 显著（ Ｐ＜００ ） ．１ 。其 中在 ２ｍ ／ ｇ ４ｍ ／ｇ ０ ｇｋ 和 ０ ｇｋ 时拮抗 作用最强 ， 抑制率为 ４ ． ％和 ４ ． ％。见表 １ ８９ ８ ８８ ２ 。该 结果表明， 五味子多糖具有抑制微核率增加的作用。
余甘子抗突变和抗肿瘤作用实验研究
・
３５ ・ ４６
塞旦 匡堇鍪圭 ！ ９ 月第 １ ４卷第 ２ 期 （ ５ 旬刊 ） ＪＭ ， ｅ ｅ ｂｒ２Ｈ ，ｏ １ Ｎ０ ２ （ ｓｕ Ｐ Ｔ ＳＮ ｍ ｅ＿ ０７Ｖ １ ４ ． ５ Ｉｓ ￣ ０ ．
，
Ｅ ｅｙ ｅ ａ ｖ ｒ ｎ Ｄ Ｔ
微核 实验 和睾丸染 色体 畸变实验观 察余甘 子的抗 突变作 用， Ｓ一１０和 Ｈ一２ 以 ８ ２移植 性肿 瘤观 察余甘子 的抗肿 瘤效 果。结果 ： 余甘子对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核发 生和 丝裂 霉素诱发 的小鼠睾丸 细胞 染 色体 畸变均有 明显的 抑制效果 ； Ｓ一１０和 Ｈ一 ２小鼠移植性 肿瘤生长也有 明显的抑制作 用。结论 ： 对 ８ ２ 余甘子对体 细胞 和生殖 细胞 的 Ｄ Ａ Ｎ 损伤均有保 护作用 ， 对小鼠移植性肿瘤也有一定 的抑瘤作 用。 ［ 关键词］余甘子 ； 微核 ； 肿瘤 ； 突变 抗 ［ 中图分类号］Ｒ ７ ． ［ ９ ９ １ 文献标识码 ］Ａ ［ 文章编号 ］６ １ ９ （０７）５３ ５ ￣２ １ ７ ￣０ ８ ２ ０ ２ － ６ ４
１ 材 料 与方 法
１２ ３ １ 余 甘子对 Ｓ一１０小 鼠抑 瘤试 验 雄性 昆明种小 ．．． ８ 鼠， 体重 ２ ０ ｇ～２ 。实 验动 物 随机 分为 阳 性对 照组 和高 、 ５ｇ 中 、 ３个剂量组 ， 低 每组 １ ２只动物 ， 甘子各组 剂量 同小 鼠骨 余 髓 细胞微核试验 。经 口灌 胃， 胃第 １ 灌 ３天 ， 在无 菌条 件下 ， 于 右侧腋 窝皮 下接 种 Ｓ一１０肿 瘤细 胞 悬液 ５×１ 细 胞 ０ ２ ８ ０ ． ｍ， ｌ接种后继续余甘 子灌 胃，１ｄ后 ， １ 颈椎脱 臼处死小 鼠， 取出 瘤体称重 。结果采用单 因素方差分析统计处理 。 １２ ３ ２ 余 甘子对 Ｈ一２ ．．． ２小 鼠抑瘤 试验 雄 性 昆 明小 鼠， 体重 ２ ～２ ， ０ｇ ５ｇ 动物分组 和剂量 同小 鼠骨髓细 胞微 核试 验。 经 口灌 胃， １ 第 ３天在无菌 的条件下 ， 右侧腋 窝皮下 接种 Ｈ 于 ２ 肿 瘤细胞 ５×１。 ２ ０ 细胞 ０ ２ｍ ， 种后继续余 甘子灌 胃， ． ｌ接
3.小鼠骨髓细胞微核试验
Giemsa染色时网织红细胞呈蓝灰色，称为多染红细胞；而成熟红细 胞染色呈橘红色，称为正染红细胞。
三.实验步骤 1.染毒：昆明种小鼠，环磷酰胺100mg/kg腹腔注射。 2.骨髓液制备和涂片：颈椎脱臼处死动物。解剖后取胸骨或股骨， 去除肌肉，剪去骨骺，将骨髓挤出或冲洗出，滴于载玻片推片。 3.固定：晾干后甲醇固定15秒，取出晾干。 4.染色：晾干后以新鲜配制的Giemsa染液染色5-10分钟，自来水冲 洗，晾干。 5.观察计数：低倍镜选择分布均匀、染色较好的区域，油镜下观察 计数。含有微核的PCE/1000个PCE；PCE/NCE。
实验三 小鼠骨髓多染红细胞微核试验
重庆医科大学实验教学管理中心 公共卫生实验原理 3.掌握镜下辨认微核的技术
二.实验原理： 细胞分裂过程中在染色体断裂剂或纺锤体毒物作用下，细胞染色体 断裂产生不含着丝粒的断片，或者整条染色体遗失在细胞质中，形 成微核。 染色与主核一致，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，圆形或椭圆 形，一个或多个。 在多种细胞中出现。 在红细胞成熟前组后一次分裂后数小时主核排除而微核保留。
红细胞发育过程： 骨髓多能干细胞→定向干细胞→原红细胞→早幼红细胞→中幼红细 胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞 从原红细胞到晚幼红细胞需分裂3-4次。形成晚幼红细胞后即不再 分裂，在发育过程中主核排出形成网织红细胞。网织红细胞含有少 量RNA，甲酚蓝染色成蓝色丝网状。网织红细胞进一步发育，RNA消 失成为成熟红细胞。
四.结果分析与评价 1.PCE/NCE比值约为1（0.6-1.2）。比值小于0.1表明PCE生成严重 受抑制，染毒剂量过大。 2.用统计方法分析结果。 五.实验成功的关键 1.制作良好的骨髓涂片 2.优质的染色
微核试验
5、关键步骤是制作良好的骨髓涂片以及优 良的染色
2 固定：将推好凉干的骨髓片放进染色缸，甲醇 固定15分钟，取出晾干
3 染色：用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储 备液一份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10－ 15分钟，细流水冲掉玻片染色液，晾干
四 观察和计数：
１ 观察：先用低倍镜观察，选择分布均匀的区域，
再在油镜下观察计数。PCE细胞呈灰蓝色，正染红 细胞（NCE）桔黄色。细胞中的微核大半呈圆形， 边缘光滑，嗜色性与核质一致，一个细胞内可以 出现一个或多个微核。
4、M期(有丝分裂期)：前期，早中期，中期， 后 期（微核形成期），末期
图13-1 细胞周期可划分为四个阶段
微核（micronucleus）
是染色体或染色单体的无着丝点片断或纺锤体 受损而丢失的整个染色体，于细胞分裂后期留在 细胞质中，末期后，单独形成一个或几个规则的 次核，包含在子细胞用使个别染色体或带着丝点 的染色体环和断片在细胞分裂后期被滞留在细胞 质中
2 断片或无着丝点染色体在细胞分裂后期不能定向 移动，从而遗留在细胞质中
结论：
微核试验能检测化学或其他物质因素诱导产生 的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗 传学终点
微核可出现于多种细胞中，但在有核细胞中 难以与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数 PCE细胞中的微核，因为在此阶段，主核排出，易 于观察微核，这些细胞保持其嗜碱性约24小时， 然后成为正染红细胞（NCE）,并进入外周血。
图 1 ：正常嗜多染红细胞 PCE （× 400 ） 图 2 带微核嗜多染红细胞 MNPCE （× 400）
微核 嗜多染细胞
注意事项：
小鼠骨髓细胞微核试验
操作步骤
• 1.取材：实验动物最后一次染毒后，按确定的时间将 小鼠颈椎脱臼（大鼠断头）处死后，剪取一侧股骨， 剔净肌肉，用纱布擦掉附在股骨上的血液和肌肉，剪 掉股骨头，露出骨髓腔。用带７号针头的注射器吸取 小牛血清（小鼠需１ml，大鼠需２ml），插入骨髓腔
微核。
试验设计
• 1.动物选择 一般常用的实验动物为大、小
鼠。以小鼠用的最多，要求体重18-20g，
7-12周龄。每组小鼠数量10只，雌、雄各
半。
试验设计
• 2.染毒途径 根据研究目的或受试化学毒物
性质不同，可分别选用经口、经皮、经呼
吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可
能采取如人接触化学毒物相同的途径。
原 理
• 微核试验是用于检测染色体损伤和干扰细
胞有丝分裂的化学毒物的快速方法。微核
是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，
大小相当于细胞直径的1/20~1/5，呈圆形或
杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细
胞中可以出现一个或多个。
原 理
• 一般认为微核使细胞内染色体断裂或纺锤
丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细
10min。如当日不染色，也需固定好保存。
• 4.染色：片子固定后，滴加瑞氏-姬姆萨A溶液于涂
片上，让染液覆盖整个标本涂片染色1分钟；再将
B溶液滴加于A液上面（滴加量为A液的2~3倍），
以嘴或洗耳球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液
充分混合，染色8分钟；水洗、干燥、镜检。
• 注意：（不要把细胞冲洗掉）
胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检
测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体
环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核的时间毒理学研究
环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核的时间毒理学研究
张杰;吴萍
【期刊名称】《首都医科大学学报》
【年(卷),期】2002(023)004
【摘要】@@ 目前,外源性化学物质与机体生物节律间的相互关系的研究,已引起人们的注意[1],而对于环磷酰胺(CP)引起的小鼠体细胞遗传损伤是否与生物节律有关的报道较少.
【总页数】1页(P346-346)
【作者】张杰;吴萍
【作者单位】首都医科大学环境卫生与劳动卫生学教研室;首都医科大学环境卫生与劳动卫生学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R1
【相关文献】
1.SOD对环磷酰胺诱发小鼠骨髓细胞微核的保护作用 [J], 马琳;卢日峰;陈强
2.长春新碱和环磷酰胺诱发小鼠骨髓微核的时间节律性 [J], 崔守强;姚根和
3.蓝靛果汁拮抗环磷酰胺诱发小鼠骨髓细胞微核 [J], 全成旭;韩春姬;李莲姬
4.轮叶党参总皂甙对环磷酰胺诱发的小鼠骨髓细胞微核的拮抗作用 [J], 韩龙哲;韩春姬;叶萌;崔香淑
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文章编号:1006-446X(2006)08-0027-05环磷酰胺诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间、剂量-效应观察王文蔚方芳李春明(温州医学院公共卫生学院,浙江温州325035)摘要:为研究环磷酰胺(CP)诱导的小鼠骨髓细胞微核率的时间-效应关系和剂量-反应关系,给小鼠一次腹腔注射不同剂量(按体质量计)CP(0、30、60、90mg/kg)后,于不同时间(给药后12、24、36、48、60h)、不同部位(胸骨与股骨)取材来观察小鼠骨髓细胞微核率的变化。
结果表明,高、中、低三个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与0mg/kg组相比较,其差异具有统计学意义(P<0101),且4个剂量组之间两两比较也均有统计学意义(P<0105),并表现出明显的剂量-反应关系;不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响具有统计学意义(P<0105),在36~48h这个时间段能够观察到更高的微核率,通过线性回归的曲线拟合分析,以41h取材最佳;胸骨取材与股骨取材之间的微核率差异无统计学意义(P>0105)。
环磷酰胺可作为诱导小鼠骨髓细胞微核的阳性对照,在一定范围内,具有剂量-反应关系和时间-效应关系。
给小鼠一次腹腔注射量(按体质量计)60~90mg/kg后36~48h胸骨取材可取得较高微核率,结果满意。
关键词:微核;环磷酰胺;骨髓;小鼠中图分类号:R446119文献标识码:A微核试验是反映染色体损伤的一种重要试验方法,它具有简易、快速、灵敏、准确的特点,因而得到广泛的应用,在食品、药品、农药、环境等多领域的化合物毒理学安全性评价中起到重要作用,是必做的试验之一[1]。
本实验以环磷酰胺为诱变剂,观察给药剂量、取材时间及取材部位对小鼠骨髓细胞微核率的影响,为微核试验的标准化和最佳实验方案提供依据。
1材料与方法111材料、仪器与试剂环磷酰胺(上海华联制药有限公司,批号:041103),用生理盐水配制;小牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司,批号:20031219),灭活后使用。
显微镜(Leica),普通离心机。
甲醇(分析纯),pH618的磷酸盐缓冲液,1B9Giemsa染色液。
112动物分组与处理选用ICR小鼠80只(温州医学院实验动物中心提供,合格证号SYXK(浙)2005-0061),体质量18~25g,雌雄各半。
称质量,编号,随机分为4组(剂量均按体质量计):零剂量组(0mg/kg,也可称阴性对照组),低剂量组(30mg/kg),中剂量组(60m g/kg),高剂量组(90mg/kg),每组20只,收稿日期:2006-04-20按10mL/kg腹腔注射给药(0mg/kg剂量组用生理盐水代替),随后再将每组动物随机分为5小组,每组4只,分别于给药结束后12、24、36、48、60h用颈椎脱臼法处死、取样。
113取样方法与处理对中剂量组每只小鼠均取胸骨与股骨两个不同部位的骨髓制作涂片,其余三个剂量组则只取胸骨骨髓制作涂片。
胸骨取材,选取骨髓相对较多的两节胸骨,清理干净,剪断,挤出骨髓于滴有小牛血清的玻片上,混匀,制成细胞悬液推片;股骨取材则分离一侧股骨,剔除干净,剪断两端骨骺,用015~1mL小牛血清冲洗骨髓腔至115mL离心管中,1000r/min离心5min,弃上清液后摇匀推片。
晾干后两种骨髓片均用甲醇固定15min,Giemsa染色13min,然后冲洗、晾干、镜检。
114观察计数与统计方法采用双盲法阅片,每张片子计数1000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes,简称PCE),记录含有微核的嗜多染红细胞数(micronucleated polychromatic erythrocytes,简称MNPCE),规定PCE 中出现多个微核的按一个计算,计算微核率(j)。
统计方法采用SPSS1210软件及STATA610软件进行统计分析处理。
2结果与分析211不同剂量、不同取样时间对小鼠骨髓细胞微核率的影响结果见表1。
经两因素析因设计方差分析,不同剂量与不同取样时间两个因素对小鼠骨髓细胞微核率的影响没有交互作用(F=01972,P=01485,P>0105),但它们各自的单独效应(对小鼠骨髓细胞微核率的影响)均有统计学意义(P<01001)。
组间比较经LSD-t检验后发现,高、中、低各个剂量组的小鼠骨髓细胞微核率与0mg/kg组相比较,其差异具有统计学意义(P<01001),而且4个剂量组之间两两比较也均有统计学意义(P<0105),表现出明显的剂量-反应关系。
不同时间取样点经两两比较,36、48h取材时间点与其他几个取材时间点的差异有统计学意义(P<0105),表明36~48h这个时间段能够观察到更高的微核率。
表1不同剂量、不同取样时间的小鼠骨髓细胞微核率比较(n=4)单位:j组别取样时间/h1224364860零剂量组(0mg/kg)1125?11261150?11292150?11291175?01961150?1173低剂量组(30mg/kg)8150?213810125?117113150?218914150?316911150?2108中剂量组(60mg/kg)11125?313015125?219818150?218919100?313715150?4120高剂量组(90mg/kg)12175?315017150?216520175?317721150?318717125?4135212给予不同剂量环磷酰胺后不同时间取样的小鼠骨髓细胞微核率变化趋势在本实验条件下,随着处理剂量的增加,小鼠骨髓细胞微核率相应升高,显示出良好的剂量-效应关系;同时随着取样时间的变化,小鼠骨髓细胞微核率也显现出逐渐升高、达到高峰、然后下降的变化过程,表现出明显的时间-效应关系,见图1。
t/h图1不同剂量与不同取样时间下小鼠骨髓细胞微核率的变化213微核率随时间变化的曲线拟合方程用STATA610软件作线性回归分析,用各剂量组的微核率均数作二次拟合曲线,得各剂量组方程如下:¹零剂量组:y=011104x-010014x2(F=90197,P=010005,r2=019785)º低剂量组:y=016665x-010079x2(F=298187,P=0000,r2=019934)»中剂量组:y=019363x-010113x2(F=741152,P=0000,r2=019973)¼高剂量组:y=110677x-010130x2(F=752182,P=0000,r2=019974)。
通过计算,各剂量组微核率达到最大值的取材时间点分别为38136、42136、41131、40195h,均值为40175h。
在原始数据中加入(0,0)点,用各组均数和时间作图,并且规定拟合的曲线过(0,0)点,见图2。
t/h图2小鼠骨髓细胞微核率随时间变化的二次拟合曲线214不同取材部位对小鼠骨髓细胞微核率的影响经观察,胸骨和股骨骨髓涂片的嗜多染红细胞形态及染色情况无明显差别,其微核检出率及两者的差别见表2。
经配对t检验,胸骨和股骨微核率之间的差异没有统计学意义(P>0105)。
因采用胸骨骨髓制片更为简便易行,并可减少试验费用,值得提倡。
表2中剂量组不同部位取材的小鼠骨髓细胞微核率比较(n=4)单位:j编号取样时间/h1224364860胸骨股骨胸骨股骨胸骨股骨胸骨股骨胸骨股骨113111416151422211122891613181923182119396129221715121617415121915191318171416t(P)11849*(01162)11477*(01236)11665*(01195)11172*(01326)01577*(01604)*与股骨同时间取样组比较,经配对t检验,P>0105。
3讨论在微核试验中常用环磷酰胺为诱变剂作阳性对照,但由于影响骨髓微核率的因素较多,如小鼠品系、性别、年龄、给药方式和剂量、染毒途径和次数、取材时间和部位,以及制片、染色、检测方法等,其中,给药剂量和取样观察时间对小鼠骨髓微核率的影响较大,常造成各实验结果的不尽一致[2-4]。
由于不同化合物诱发微核出现的高峰时间不尽相同,波动范围可能在24~72h[5];而且同一化合物,如果给药剂量与途径不同,动物种属不同,微核率峰值出现的时间也不同[6-7]。
因此,合理选择给药剂量和取样时间对获取较高的微核率显得尤为重要,特别是当化学物致突变效应较弱时更有意义。
本次实验根据文献推荐的环磷酰胺剂量(50~100mg/kg)[5],采用4个剂量组别,5个取样时间,应用两因素析因设计方法来观察它们对小鼠骨髓微核率的影响,结果表明,剂量因素与时间因素对小鼠骨髓细胞微核率的影响均具有统计学意义(P<0105),并具有剂量-反应关系和时间-反应关系,通过线性回归的曲线拟合分析,发现给药后41h小鼠骨髓微核率达到高峰。
考虑到微核峰值的时效性,并且它的峰值不会很快升降,在其高峰前后12h采样均能高效检出微核[8]。
故建议:用环磷酰胺作为诱导小鼠骨髓细胞微核的阳性对照时,剂量(按体质量计)可选择60~ 90mg/kg,取样时间在给药后36~48h,采用一次腹腔注射、胸骨取材可取得较高微核率,结果满意。
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